TỔNG QUAN NGUYÊN LIỆU
Tổng quan về vi khuẩn lactic
2.1.1 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic
2.1.1.1 Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic
Trở lại trước thế kỉ 20, thuật ngữ vi khuẩn lactic được sử dụng để chỉ những vi khuẩn làm chua sữa Năm 1873, J Lister lần đầu tiên phân lập được vi khuẩn “Bacterium lactis” (hay Lactococcus lactis) Nghiên cứu phân loại vi khuẩn lactic cho thấy sự tương đồng giữa vi khuẩn trong sữa và các vi khuẩn có mặt trong thực phẩm chứa axit lactic khác như thịt, rượu vang, cùng với các vi khuẩn lactic có lợi trong đường ruột.
Vi khuẩn lactic, được định nghĩa là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men và đông tụ sữa, bao gồm vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn lactic Năm 1901, Beijernick đã mô tả Lactobacillus, một loại vi khuẩn Gram dương, và phân biệt rõ ràng giữa vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn lactic Đây là một trong những vi khuẩn lactic có lợi nhất, chủ yếu hiện diện trong hệ tiêu hóa.
Vào thế kỷ 20, sự quan tâm đến Lactobacillus trong chế độ ăn uống của con người gia tăng khi Elie Metchnikoff tại viện Pasteur Paris phát triển và ứng dụng loại vi khuẩn này để bổ sung vào khẩu phần ăn nhằm ngăn ngừa và chữa bệnh Tuy nhiên, lý thuyết của ông về việc kéo dài tuổi thọ và sức khỏe thông qua thực phẩm chứa vi khuẩn này đã gây tranh cãi, do hiệu quả của các sản phẩm không đạt như mong đợi và thiếu cơ sở khoa học để chứng minh sự ưu việt của chúng.
Kể từ đó, nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic đã được thực hiện nhờ vào các kỹ thuật hiện đại, giúp mô tả chi tiết về hình dáng, cấu tạo và đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chúng Trong số đó, kỹ thuật di truyền đóng vai trò quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn, đặc biệt là thông qua việc xác định hàm lượng phần trăm mol C+G trong DNA và sử dụng phương pháp điện di để nhận diện các gen.
2.1.1.2 Khái niệm vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn tạo ra sản phẩm chủ yếu là lactic acid trong quá trình lên men carbonhydrate [452]
Nhóm vi khuẩn lactic có một số đặc điểm chính như sau:
- Là những vi khuẩn gram dương, bất động, không sinh bào tử, catalase và oxydase âm tính.
Các vi sinh vật này có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất cần thiết cho sự sống rất yếu, do đó chúng thuộc nhóm đa khuyết dưỡng và cần nhiều amino acid Ngoài ra, chúng không chứa cytochrome.
- Nhiều loài trong chúng là những vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, vi hiếu khí và có khả năng tồn tại cả hiếu khí cũng như kỵ khí.
2.1.1.3 Phân loại vi khuẩn lactic.
Vi khuẩn lactic có thể được phân loại theo nhiều cách dựa trên các tính chất cơ bản như hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở nhiệt độ khác nhau, và khả năng chịu muối, axit hay kiềm Năm 1919, Orla – Jensen đã tiên phong trong việc nghiên cứu và phân loại hệ thống các vi khuẩn lactic, chia chúng thành bốn giống chính: Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus và Lactococcus.
Leuconostoc là một giống vi khuẩn quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm Hiện nay, Bifidobacterium cũng được bổ sung vào danh sách các giống vi khuẩn, với hình dạng biến đổi đáng chú ý Ngoài ra, một số giống vi khuẩn đã được phân tách thành nhiều chi khác nhau do sự khác biệt về các yếu tố sinh học.
Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic, gồm khoảng
Có 80 loài vi khuẩn lactic hình que, với sự khác biệt rõ rệt về hình thái, đặc điểm sinh hóa và sinh lý Dù có sự đa dạng này, tất cả đều được xếp vào cùng một chi thống nhất theo định nghĩa của chi.
Chúng là những vi khuẩn gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵ khí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí Các loài trong chi
Lactobacillus có thể tiến hành cả lên men lactic đồng hình thông qua con đường
Lactobacillus phát triển mạnh trong môi trường acid với pH từ 4,5 đến 6,4, và có mặt trong nhiều sản phẩm tự nhiên như thịt, sữa, bia, cũng như trong nước sạch, bùn, và trên bề mặt thực vật Các loài thuộc chi Lactobacillus đóng vai trò quan trọng trong hệ vi sinh đường ruột của người và động vật bậc cao, hiện diện trong khoang miệng, đường ruột và âm đạo Chúng giúp duy trì sự ổn định của hệ vi sinh trong cơ thể, mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ và ức chế sự phát triển của một số vi sinh vật gây bệnh.
Lactobacillus được sử dụng rộng rãi trong quá trình lên men để sản xuất acid lactic và chế biến sữa Tuy nhiên, chúng cũng có thể gây ra vấn đề khi làm hỏng thực phẩm do một số sản phẩm trao đổi chất của chúng tạo ra mùi khó chịu trong bia, sữa và thịt.
Hình 2.1 (a) Lb acidophilus và (b) Lb lactis
Các loài thuộc chi Carnobacterium trước đây được xếp vào chi
Lactobacillus, đó là các loài Lb divergens, Lb carnis, và Lb piscicola, nhưng sau đó đã thể hiện những tính chất khác biệt và được tách ra khỏi chi
Lactobacillus Các loài trong chi Carnobacterium có thể phát triển trong môi trường có pH khá cao (khoảng 9) trong khi Lactobacillus không thể phát triển trong điều kiện này.
Ban đầu, ba chi vi khuẩn này được xếp vào chi Streptococcus Chúng là vi khuẩn lactic hình cầu, tồn tại theo cặp hoặc xếp thành chuỗi, và thực hiện quá trình lên men lactic đồng hình Mặc dù đã có sự phân tách và hình thành các chi mới, nhưng bản chất của chúng vẫn giữ nguyên.
Streptococcus là một chi vi khuẩn lớn và khó phân loại chính xác, thường được chia thành ba nhóm chính: nhóm pyogenic (sinh mủ), nhóm ở miệng (oral) và nhóm “khác” bao gồm các loài còn lại.
Streptococcus là một loài vi khuẩn gây bệnh, trong đó St thermophilus được ứng dụng quan trọng trong công nghệ thực phẩm, đặc biệt trong chế biến sữa chua và một số loại phomat Loài này thuộc nhóm Streptococcus ở miệng và nổi bật với khả năng chịu nhiệt cao, có thể phát triển ở nhiệt độ lên đến 52°C.
Lactococcus, đặc biệt là Lc lactis, là chi vi khuẩn quan trọng trong công nghệ chế biến sữa Chúng thường xuất hiện trong các môi trường tự nhiên có sữa hoặc gần các khu vực chế biến sữa Việc hiểu rõ đặc điểm của chúng là cần thiết để cải thiện quy trình sản xuất sữa.
Lactococcus, Enterococcus và Streptococcus được phân loại dựa trên khả năng phát triển ở các nhiệt độ, nồng độ NaCl và pH khác nhau Các chủng Lactococcus không thể phát triển ở 45°C, nồng độ NaCl 6,5% và pH 9,6, trong khi các chủng Enterococcus lại phát triển tốt trong cả ba điều kiện này Đối với nhóm Streptococcus, không có quy luật chung nào về khả năng phát triển.
Chức năng probiotic của vi khuẩn lactic
2.2 Một số tính chất có lợiChức năng probiotic của vi khuẩn lactic
Nói đến các tính chất có lợi của vi khuẩn lactic, điều đầu tiên các nhà khoa học nghĩ đến là tiềm năng probiotic.
Từ "probiotic" có nguồn gốc từ Hy Lạp, có nghĩa là "dành cho cuộc sống" trong tiếng Anh, chỉ những vi sinh vật sống trong cơ thể người và động vật, mang lại lợi ích cho sức khỏe của vật chủ Nhiều định nghĩa về probiotic đã được đưa ra, trong đó có định nghĩa của Fuller (1989) theo FAO/WHO.
2001, [2315]) đã chỉ rõ bản chất vi sinh vật của probiotic qua định nghĩa:
Probiotic là những vi sinh vật sống có lợi cho sức khỏe của vật chủ, được định nghĩa bởi Guarner và Schaafsma vào năm 1998, theo FAO/WHO (2001) Những vi sinh vật này khi được cung cấp với một lượng thích hợp sẽ giúp cải thiện sự cân bằng trong đường tiêu hóa, mang lại nhiều lợi ích sức khỏe cho người sử dụng Định nghĩa của FAO/WHO đã nêu rõ các đặc điểm chính của probiotic.
Probiotic là những chất bổ sung thực phẩm chứa vi khuẩn hoặc nấm men có lợi, trong đó vi khuẩn lactic được sử dụng phổ biến nhất Chúng có khả năng sản sinh ra Bacteriocxin, một hợp chất kháng sinh giúp ức chế vi khuẩn gây bệnh, giải độc đường ruột và cải thiện khả năng tiêu hóa Probiotic trong đường ruột có thể tự tái thiết lập cân bằng khi cần thiết.
Tác động tích cực của probiotic phụ thuộc vào liều lượng tiêu thụ, với nghiên cứu cho thấy chỉ khoảng 10-30% lượng probiotic trong thực phẩm tồn tại trong hệ tiêu hóa sau khi hấp thụ Vì vậy, hàm lượng probiotic tối thiểu trong thực phẩm cần đạt 10^7 CFU/ml để đảm bảo hiệu quả.
Probiotic được chia làm 2 loại:
- Vi khuẩn không sinh lactic:
Bacillus subtilis, Escherichia coli strain nissle…
- Giống Lactobacillus: L acidophilus, L casei, L plantarum, L fermentum, L reuteri, L bulgaricus, L paracasei…
- Giống Bifidobacterium: B bifidum, B breve, B longum, B lactic …
Trong đó, hệ vi khuẩn axit lactic là hệ vi khuẩn mà chủ yếu là giống
Lactobacillus là một trong những vi khuẩn probiotic phổ biến nhất, chủ yếu nhờ vào khả năng chuyển hóa đường và các loại carbohydrate thành axit lactic Vi khuẩn này không chỉ tạo vị chua cho sản phẩm sữa lên men như sữa chua mà còn đóng vai trò bảo vệ bằng cách hạ pH, từ đó giảm khả năng phát triển của các vi sinh vật có hại.
Probiotic không chỉ mang lại lợi ích cho sức khỏe con người mà còn được áp dụng rộng rãi trong nuôi trồng thủy sản, chăn nuôi gia súc và xử lý môi trường Một số vai trò quan trọng của probiotic bao gồm cải thiện sức đề kháng, tăng cường hiệu quả tiêu hóa và hỗ trợ cân bằng hệ vi sinh vật trong môi trường nuôi trồng.
2.2.2.1 Giảm nguy cơ tiêu chảy, rối loạn tiêu hóa
Probiotic giúp giảm nguy cơ tiêu chảy bằng cách ức chế vi khuẩn gây bệnh đường ruột, như nhóm Vibrio trong thủy sản Chúng cạnh tranh chỗ trú với vi khuẩn có hại, ngăn cản sự bám dính vào thành ruột và tiết ra enzyme hỗ trợ tiêu hóa, từ đó làm giảm triệu chứng rối loạn tiêu hóa và tiêu chảy.
2.2.2.2 Tăng cường khả năng miễn dịch Đối với con người: Hhiệu quả của vi khuẩn lactic là liên kết bộ máy tiêu hoá và tạo hiệu quả trong điều trị bệnh tiêu chảy và sự nhiễm trùng đường ruột.
Vi khuẩn lactic kích thích hệ thống miễn dịch qua hai cơ chế: đầu tiên, khi chúng di chuyển vào ruột non, phát triển và nhân lên, các kháng nguyên được giải phóng và cơ thể hấp thụ, từ đó kích hoạt hệ miễn dịch Thứ hai, các giống Lactobacillus tác động gián tiếp lên các thành phần khác trong ruột non, tạo ra sản phẩm biến đổi góp phần vào đáp ứng miễn dịch.
Hệ miễn dịch được cải thiện nhờ vi khuẩn lactic biểu hiện theo ba cách: + Tăng cường hoạt động của đại thực bào
+ Tăng cường sự sản xuất kháng thể thường xuyên: IgM, IgG và interferon (tác nhân chống virus đặc hiệu)
Lactobacillus, đặc biệt là L acidophilus, đã được chứng minh là làm tăng lượng kháng thể IgA tại chỗ trên bề mặt màng nhầy như thành ruột non và miệng ở vật nuôi Các thí nghiệm với loài gặm nhấm cho thấy rằng vi khuẩn này còn nâng cao hoạt động của đại thực bào, góp phần vào sức khỏe miễn dịch tổng thể.
L casei kích thích hoạt động của đại thực bào chống lại Listeria, đồng thời làm tăng sự hình thành kháng thể IgA tại ruột non, góp phần bảo vệ khỏi sự xâm nhiễm của Salmonella typhimurium Loại vi khuẩn này cũng được sử dụng như một tá dược để ngăn chặn sự xâm nhiễm từ bên ngoài Bên cạnh đó, L acidophilus cũng hiệu quả trong việc tăng cường sản xuất kháng thể đường ruột Kết quả thí nghiệm cho thấy, sau 7 ngày bổ sung thực phẩm chứa L acidophilus, số lượng kháng thể miễn dịch ở ruột non của lợn đã tăng đáng kể.
2.2.2.3 Chức năng dinh dưỡng, hỗ trợ tiêu hóa và quá trình sinh tổng hợp
Vi khuẩn lactic hỗ trợ quá trình tổng hợp vitamin B (B1, B2, B3, B12), vitamin K, và các enzyme như protease và lipase, giúp cải thiện khả năng tiêu hóa ở người và động vật Đối với những người không tiêu hóa được lactose, vi khuẩn này sản xuất enzym lactase, giúp tiêu hóa đường lactose hiệu quả hơn Hệ tiêu hóa của con người chứa hàng trăm loại vi sinh vật, cả có lợi và có hại, trong trạng thái cân bằng Khi cơ thể bị bệnh, tiêu chảy hoặc mất cân bằng do kháng sinh, sức khỏe sẽ bị ảnh hưởng Vi khuẩn lactic có khả năng ức chế các vi sinh vật gây bệnh như Salmonella và E.coli bằng cách sản sinh axit lactic, H2O2 và Bacteriocin, tạo ra môi trường không thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật có hại Nhờ đó, vi khuẩn lactic giúp khôi phục sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột và giảm tác dụng phụ của thuốc kháng sinh.
Probiotic có khả năng giảm nguy cơ ung thư bằng cách ức chế sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột sản sinh ra chất gây ung thư như nitrosamine Sự hiện diện của probiotic giúp bảo vệ sức khỏe, làm giảm khả năng mắc bệnh ung thư Nghiên cứu của nhóm Saikali đã chỉ ra tầm quan trọng của probiotic trong việc phòng ngừa ung thư.
Nghiên cứu của Mongkol và cộng sự (2004, 2009) cho thấy sữa lên men sống chứa probiotic có khả năng giảm nguy cơ ung thư ruột kết Tuy nhiên, hiện tại vẫn còn ít nghiên cứu trong lĩnh vực này, và việc đưa ra kết luận lâm sàng về tác dụng chống ung thư của probiotic vẫn còn quá sớm.
2.2.2.5 Giảm hấp thu cholesterol và lượng cholesterol huyết thanh
Hàm lượng cholesterol trong huyết thanh có ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe tim mạch; mức cholesterol cao làm tăng nguy cơ mắc bệnh tim và béo phì Sử dụng sản phẩm probiotic có thể giúp giảm cholesterol trong máu, từ đó hỗ trợ cải thiện sức khỏe tim mạch.
[21], [22], [27] Toranto và cs (1998) đã tiến hành thử nghiệm trên chuột mắc chứng cao cholesterol huyết thanh và nhận thấy việc đưa vào một lượng nhỏ
ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
Chủng vi khuẩn lactic Lactobacillus L fermentum TC10, một loại probiotic tiềm năng, đã được phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống của Việt Nam là tôm chua Việc định danh chủng vi khuẩn này đã được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh của Đại học Gent, Vương quốc Bỉ.
- Địa điểm thực hiện: Trung tâm Nnghiên cứu, Ứứng dụng và Thông tin tiến bộ KH&CN tỉnh Quảng Trị.
- Thời gian thực hiện: từ ngày 05/11/2018 đến ngày 10/03/2019.
Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với các nội dung nghiên cứu sau:
3.2.1 Khảo sát xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng L fermentum
3.2.2 Ảnh hưởng của mật độ tế bào gieo cấy ban đầu lên lượng sinh khối của L fermentum TC10 thu được sau thời gian nuôi cấy.
3.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên lượng sinh khối của L fermentum
TC10 thu được sau thời gian nuôi cấy.
3.2.4 Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy lên lượng sinh khối của L fermentum TC10 thu được sau thời gian nuôi cấy.
3.2.5 Xác định thời gian nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để thu nhận lượng sinh khối L fermentum TC10 cao.
Môi trường và thiết bị phân tích
Môi trường MRS lỏng để hoạt hóa, tăng sinh vi khuẩn lactic.
Bảng 3.1 Thành phần môi trường MRS (Theo Schillinger và Holzapfel, 2003)
Môi trường MRS rắn được sử dụng để tăng sinh vi khuẩn lactic, có thành phần cơ bản giống như MRS lỏng nhưng được bổ sung agar với hàm lượng 20g/lít Để chuẩn bị môi trường này, cần đảm bảo đủ 1 lít dung dịch với các thành phần như 10g pepton, 10g thịt và 4g đường glucose Môi trường MRS rắn là lựa chọn hiệu quả cho việc nuôi cấy vi khuẩn lactic trong nghiên cứu và ứng dụng thực tiễn.
Hóa chất để điều chỉnh pH môi trường: NaOH, HCl.
Tiệt trùng môi trường ở 1atm, trong thời gian 20 phút.
Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu được thể hiện qua bảng 3.2.
STT Tên thiết bị Nhãn hiệu – Nước sản xuất
1 Thiếp bị cấy DaiHan Hàn QuốcNhật
2 Cân điện tử Shinko Nhật
3 Máy đo pH Hanna Italia
4 Kính hiển vi Kruss Đức
5 Nồi hấp Nhật BảnYuin Việt-Hàn
6 Máy li tâm NhậtLabnet Mỹ
7 Tủ ấm Pol-eko Liên xô
8 Thiết bị lên men 15Ll Biocanvas Hàn Quốc
10 Tủ đông Daihan Hàn Quốc
12 Tủ sấy Pol-eko Liên xô
14 Lò vi sóng Sanyo Nhật
Phương pháp xác định pH bằng máy đo pH điện tử là một kỹ thuật chính xác để đo độ axit hoặc kiềm của môi trường MRS Sau khi pha chế môi trường theo công thức, máy đo pH điện tử được sử dụng để xác định giá trị pH, từ đó điều chỉnh pH của môi trường bằng cách thêm NaOH hoặc HCl.
Phương pháp nuôi cấy thu nhận sinh khối
Phương pháp nhuộm màu Gram
Xác định số lượng tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
3.43.2.1 Phương pháp hoạt hóa, giữ giống và bảo quản.
Để duy trì tính chất của giống vi sinh vật, cần đảm bảo giữ nguyên đặc tính ban đầu trước khi cất giữ Nguyên tắc chính là làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất của vi sinh vật, đồng thời ngăn chặn sự sinh sản của chúng.
Để giữ giống vi sinh vật lâu dài, phương pháp lạnh đông ở -80 độ C được áp dụng Vi sinh vật được đưa vào môi giữ giống MRS lỏng có chứa 30% glycerol, nuôi trong 24 giờ ở 37 độ C để thích nghi và tạo sinh khối Sau đó, mẫu được đưa vào tủ đông ở -80 độ C, giúp bảo quản giống trong nhiều năm Khi cần sử dụng, chỉ cần kích hoạt giống trong môi trường MRS lỏng và cấy sang thạch nghiêng MRS agar để chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo.
+ Giống bảo quản ở ống thạch nghiêng trong tủ lạnh ở 4 0o C: trường hợp này phải cấy chuyền hàng tháng trong vòng 2 tháng sau thời gian đó phải cấy truyền.
3.43.2.2 Phương pháp tăng sinh trên môi trường MRS rắn
Sau khi kích hoạt chủng gốc, cần nuôi vi khuẩn trên môi trường MRS rắn để thu được các khuẩn lạc riêng lẻ phục vụ cho thí nghiệm.
Để tiến hành thí nghiệm, sử dụng ống Eppendorf đã được hoạt hóa và que cấy vô trùng để lấy mẫu vi khuẩn Nhúng que cấy vào ống Eppendorf, sau đó ria mẫu lên đĩa thạch với môi trường MRS rắn theo hình ziczac Cuối cùng, bọc đĩa thạch bằng màng bọc hoặc giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ.
3.43.2.3 Phương pháp tăng sinh trên môi trường MRS lỏng
Trong môi trường lỏng, vi khuẩn tiếp xúc dễ dàng với các chất dinh dưỡng, giúp chúng phát triển ổn định và thu được sinh khối cần thiết cho các nghiên cứu tiếp theo.
Sau khi tăng sinh trên đĩa thạch, các khuẩn lạc sẽ được thu thập Sử dụng que cấy vô trùng, lấy các khuẩn lạc đơn và chuyển vào ống nghiệm hoặc bình chứa MRS lỏng Cuối cùng, tiến hành nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ.
3.4.2.4 Nhuộm tế bào bằng phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc : Đánh giá chủng giống nghiên cứu là Gram(+) hay không và thông qua hình thái từ đó có thể khẳng định đặc điểm của chủng giống.
Để tiến hành nhuộm Gram, nhỏ một giọt khuẩn lạc lên lá kính và dàn đều Sau đó, làm khô bằng cách hơ qua ngọn lửa đèn cồn Nhuộm vết bôi bằng dung dịch Crystal Violet trong 1 phút, rồi rửa sạch bằng nước cất Tiếp theo, nhỏ vài giọt Lugol lên phiến kính trong 1 phút, sau đó rửa bằng Ethanol trong 10-15 giây Rửa sạch tiêu bản bằng nước, rồi nhuộm bổ sung bằng dung dịch Safranine trong 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước sạch Đợi tiêu bản khô và soi dưới kính hiển vi để đánh giá kết quả: vi khuẩn bắt màu tím là Gram(+), còn vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram(-).
3.4 3 2.5 Xác định số lượng tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
Mẫu được thu thập theo thời gian cụ thể và được cấy lên đĩa chứa môi trường MRS, sau đó được ủ trong tủ ấm ở 37 độ C trong 24 giờ Cuối cùng, khuẩn lạc được kiểm tra và đếm bằng máy đếm khuẩn lạc.
- ► Phương pháp pha loãng dung dịch
Để chuẩn bị ống nghiệm cho quá trình pha loãng, cần rửa sạch và hấp khử trùng ống nghiệm ở nhiệt độ 121 oC và áp suất 1 atm Sau đó, đặt ống nghiệm vào buồng cấy vô trùng và bật đèn cực tím trong 30 phút Tiếp theo, hút 9 ml nước muối sinh lý cất vô trùng và cho vào các ống nghiệm, sau đó hấp khử trùng lại một lần nữa Tiến hành hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm thứ nhất và vorntex đều, sau đó chuyển 1 ml dung dịch từ ống thứ nhất sang ống thứ hai và tiếp tục quá trình này cho đến khi đạt nồng độ mong muốn Cuối cùng, khi có dung dịch với nồng độ cần thiết, tiến hành cấy trải lên các đĩa petri.
Để chuẩn bị giống thí nghiệm, cần sử dụng các bình tam giác 250 ml chứa môi trường nuôi cấy đã được khử trùng Tiến hành lấy giống từ các ống giống bằng que cấy và đưa vào các bình tam giác Sau đó, lắc đều bằng tay hoặc bằng máy lắc và nuôi hoạt hóa giống trong 48 giờ tại tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C.
Lưu ý: Lưu ý: Tất cả các dụng cụ đều đượcphải vô trùng, mọi thao tác phải được thực hiện trong boxtủ cấy vô trùng và trên ngọn lửa đèn cồn.
3 43 3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm thực hiện nội dung của đề tài
(1) Khảo sát xây dựng đường cong sinh trưởng của Lactobacillus L. fermentum TC10 0 trong thiết bị lên men.
Xác định số lượng tế bào sống của vi khuẩn trên môi trường MRS agar theo từng mốc thời gian giúp phân tích các pha sinh trưởng và xây dựng đường cong sinh trưởng chính xác.
Chủng giống L fermentum TC10 được bảo quản trong ống Eppendorf ở nhiệt độ -80 oC và được kích hoạt trong môi trường MRS lỏng 9ml Sau 24 giờ nuôi cấy ở 37 oC, chủng được phục hồi hoạt tính ban đầu Tiếp theo, thực hiện pha loãng ở các nồng độ 10^-6, 10^-7, 10^-8 và trang đĩa để thu được khuẩn lạc rời Từ các khuẩn lạc này, sử dụng que cấy vô trùng để thu khuẩn lạc ria ziczac trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS agar, sau đó nuôi trong tủ ấm 37 oC trong 24 giờ và bảo quản lạnh cho các giai đoạn tiếp theo.
Giống ở thạch nghiêng bảo quản trong tủ lạnh 4 0o C, sau tháng 2 cấy truyền 1 lần để đảm bảo chủng đủ điều kiện tồn tại.
Gieo cấy L fermentum TC10 vào môi trường MRS trong thiết bị lên men 15 L với tỉ lệ tiếp giống ban đầu 6,45.10 8 6x.10 8 CFU/mL, nuôi cấy ở
35 o C, tốc độ cánh khuấy 150 vòng/phút Các mẫu thí nghiệm được lấy 4 giờ/
Để xác định mật độ tế bào sống trong môi trường, tiến hành pha loãng mẫu ở các nồng độ 10^-6, 10^-7, 10^-8 và 10^-9, sau đó trải lên đĩa petri chứa MRS agar Mẫu được nuôi trong tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Khuẩn lạc đơn được đếm bằng máy đếm khuẩn lạc, từ đó xác định mật độ tế bào sống trong 1 ml mẫu theo công thức.
Số tế bào vi khuẩn trong 1 ml mẫu (CFU: colony forming units)
Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu trong các thí nghiệm được xử lý sai khác thống kê (Duncan’s test) bằng phần mềm SPSS 16.0 và excel 2010.