ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ðỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Lợn các lứa tuổi mắc PRRS trong các ổ dịch
Phạm vi nghiên cứu của đề tài này tập trung vào các tỉnh thuộc vùng tả ngạn sông Hồng, nơi có dịch PRRS diễn ra từ năm
Từ năm 2007 đến 2010, nghiên cứu về tình hình dịch bệnh PRRS đã được thực hiện tại các tỉnh Thái Nguyên, Bắc Giang, Lạng Sơn, Bắc Ninh, Hải Dương, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hưng Yên và Thái Bình, tập trung vào khu vực tả ngạn sông Hồng.
Mẫu bệnh phẩm ủược lưu giữ và làm thớ nghiệm tại Bộ mụn Bệnh lớ Khoa Thú y trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội
Các chỉ tiêu huyết học của lợn mắc PRRS đã được xét nghiệm tại Khoa Thú y và Khoa Huyết học - Hóa sinh của Bệnh viện Trung ương Quân đội 108 Các thí nghiệm phân lập và giám định vi khuẩn gây bệnh trong ổ dịch PRRS được thực hiện tại Bộ môn Vi trùng của Viện Thú y Quốc gia.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1 Nghiờn cứu diễn biến dịch tại một số ủịa phương
- Xỏc ủịnh tỷ lệ mắc PRRS
- Xỏc ủịnh tỷ lệ chết khi lợn mắc PRRS
2.2.2 Nghiờn cứu ủặc ủiểm bệnh lớ chủ yếu của lợn mắc PRRS
- Nghiên cứu triệu chứng lâm sàng khi lợn mắc PRRS
- Nghiờn cứu bệnh tớch ủại thể khi lợn mắc PRRS
- Nghiên cứu bệnh tích vi thể của một số cơ quan khi lợn mắc PRRS
- Xỏc ủịnh một số vi khuẩn kế phỏt, gõy bệnh tớch khi lợn mắc PRRS
2.2.3 Nghiên cứu một số chỉ tiêu huyết học khi lợn mắc PRRS
+ Thay ủổi về hồng cầu
+ Thay ủổi về bạch cầu
+ Thay ủổi về GOT, GPT của mỏu lợn ốm
+ Thay ủổi protein huyết tương
2.2.4 Áp dụng phương pháp hĩa mơ miễn dịch (IHC) để chẩn đốn PRRSV
NGUYÊN LIỆU
+ Mỏy quay phim, mỏy chụp ảnh ủể phục vụ những nghiờn cứu về triệu chứng lõm sàng và bệnh tớch ủại thể
+ Bộ ủồ mổ: Dao mổ, kộo, panh, tỳi ủựng mẫu bệnh phẩm, dụng cụ lấy máu, dụng cụ chắt huyết thanh,…
+ Mỏy xử lý bệnh phẩm tự ủộng
+ Máy cắt tiêu bản microtom
+ Tủ ấm, tủ lạnh, máy làm lạnh block
+ Dụng cụ nhuộm và làm tiêu bản
+ Kính hiển vi quang học
+ Các hóa chất, môi trường nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM, FBS, kháng sinh, DMSO, trypsin, EDTA, PBS,…
+ Hoá chất trong phòng thí nghiệm phục vụ cho việc nhuộm và làm tiêu bản: focmol, cồn, xylen eosin,…
- Kháng thể kháng PRRS chế trên thỏ hoặc chuột: Dako envision TM System Labelled Polymer (USA)
- Kháng kháng thể thỏ hoặc chuột: HRP anti-mouse and anti-rabbit (Dako Corporation – USA)
- Hoá chất sử dụng cho phản ứng RT- PCR: Kít chiết tách ARN (QIAamp), Nuclease free water, dNTP, enzym, primers, TBE, agarose…
Và các dụng cụ, hóa chất cần thiết khác phục vụ cho nghiên cứu.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Trong các ổ dịch, chúng tôi tiến hành quay phim, chụp ảnh và ghi chép một cách khách quan để mô tả, so sánh và rút ra kết luận về các triệu chứng đặc trưng của lợn mắc bệnh.
2.4.2 Phương pháp mổ khám toàn diện
Phương pháp nghiên cứu bệnh tích của PRRS bao gồm việc mổ khám lợn bệnh trên bàn mổ Quy trình mổ được thực hiện từ trên xuống dưới, nhằm bộc lộ tất cả các cơ quan để quan sát và phát hiện những biến đổi về mặt bệnh tích Cần sử dụng cưa để cắt hộp sọ, sau đó bộc lộ toàn bộ hai bán cầu và các tiểu phần của nó để tiến hành quan sát Các cơ quan khác được mổ rất đơn giản, từ hạch amidan, phổi, hạch phổi,… theo cấu trúc giải phẫu Tất cả những biến đổi ở các cơ quan của từng lợn bệnh đều được ghi chép, mô tả và chụp ảnh để làm tư liệu nghiên cứu.
2.4.3 Phương phỏp ủiều tra hồi cứu
Những lợn ốm trong dịch PRRS được chọn làm thí nghiệm và được quan sát qua việc quay phim, chụp ảnh, mổ khám Tất cả đều được đánh dấu theo từng vụ dịch ở từng địa phương trong từng năm, sau đó lập thành hồ sơ theo dõi Khi phân tích các nội dung của đề tài, chúng tôi chỉ tập trung vào những con có kết quả dương tính với PRRS.
Mẫu mỏu lợn bệnh được lấy từ vịnh tĩnh mạch cổ của lợn ủược, khi lợn nằm ngửa và kéo hai chân trước ra phía sau bụng, sẽ lộ ra phần hõm ở dưới hầu và giữa hai chân Vị trí chính để lấy mẫu là ở đây Dùng kim chọc nghiêng 45 độ từ sau ra trước để lấy đủ lượng mẫu cần thiết, sau đó bảo quản trong ống nghiệm để phục vụ cho các xét nghiệm sinh lý và sinh hóa cần thiết.
Mẫu bệnh phẩm từ các khí quan và tổ chức như phổi, hạch phổi, hạch ruột, gan, lách, thận được lấy từ những vùng có bệnh tích rõ ràng Sau khi thu thập, các mẫu này cần được chuyển ngay về phòng thí nghiệm để bảo quản, làm tiêu bản và thực hiện các xét nghiệm cần thiết.
2.4.5 Phương pháp phân lập virus trên môi trường tế bào Marc-145
PRRSV có khả năng nhân lên và gây hại cho tế bào Marc-145 Sau 36 và 72 giờ nuôi cấy, các CPE (Cytopathogenic Effect) được quan sát để đánh giá sự nhân lên của virus.
Phương phỏp phõn lập ủược tiến hành như sau:
+ Chuẩn bị tế bào : Nuôi cấy tế bào Marc-145 trong khay 96 giếng
Đặt tế bào vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 và theo dõi hàng ngày cho đến khi tế bào phát triển thành một lớp Sau đó, tiến hành gõ nhiễm mẫu bệnh phẩm nghi ngờ có virus PRRSV đã được chuẩn bị sẵn.
+ Chuẩn bị mẫu phân lập
- Mẫu bệnh phẩm nghi cú PRRSV sau khi lấy ủược bảo quản trong tủ lạnh - 80 0 C
- Khi cần phõn lập, bệnh phẩm ủược ủồng nhất trong mụi trường DMEM có bổ sung thành phần kháng sinh như trên (tỷ lệ 1:10)
- Ly tõm huyễn dịch, bỏ cặn và pha loóng theo cơ số 2 ủể gõy nhiễm vào môi trường tế bào
- Mỗi giếng gõy nhiễm 25àl dung dịch Mỗi mẫu bệnh phẩm gõy nhiễm trên 3 giếng
- ðĩa nuụi cấy ủược ủặt trong tủ ấm 37 0 C cú 5% CO 2
- Quan sát CPE trên khay nuôi cấy sau 36; 48 và 72 giờ
- Khi xuất hiện CPE (90%) thì thu virus, bảo quản trong tủ lạnh -80 0 C hoặc trong Ni tơ lỏng ủến khi cần sử dụng
2.4.6 Phương pháp RT-PCR ðể xỏc ủịnh chắc chắn lợn ốm cú mắc PRRS hay khụng Chỳng tụi tiến hành phản ứng RT- PCR, dựng kit QIAamp ủể tỏch chiết ARN, với cặp mồi ORF7; P08L220619, P08L220620, (Mồi xuôi: GATTGCGGCAAATGATAACC; Mồi ngược: TGCCATTCACCACACATTCT) cặp mồi này cho phộp xỏc ủịnh ủoạn gen có kích thước 372bp mã hóa ra protein N của virus
Để tiến hành phân lập virus, trước tiên cần tách chiết ARN làm khuôn cho quá trình tổng hợp gen Mẫu bệnh phẩm 2g được nghiền nát bằng chày và cối, sau đó ủ trong dung dịch DMEM (600µl có bổ sung 10% kháng sinh) và bảo quản ở -80°C cho đến khi sử dụng Mẫu ủ được làm tan băng và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C Dịch ly tâm sau đó được gói nhiễm vào khay 96 giếng đã được phủ một lớp tế bào Marc 145, đặt trong tủ ấm và kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) hàng ngày Những giếng tế bào có bệnh tích được thu và bảo quản ở -20°C để sử dụng cho tách chiết ARN của virus.
* Phương pháp tách chiết ARN
Sau khi phân lập virus trên môi trường tế bào cần tách chiết ARN của virus ủể tiến hành phản ứng RT- PCR
- Quy trình tách chiết ARN từ dịch thu tế bào gây nhiễm virus
Bước 1: Cho 560àl Buffer AVL vào ống eppendoft
Bước 2: Cho 140àl mẫu vào ống trờn Votex trong 15 giõy, ủể nhiệt ủộ phòng trong 10 phút, ly tâm thời gian ngắn
Bước 3: Thêm 560 µl Ethanol (96% - 100%) vào ống và vortex trong 15 giây Bước 4: Chuyển 630 µl mẫu trong ống vào cột QIA, đậy nắp và ly tâm ở 8.000 vòng/phút trong 2 phút, sau đó loại bỏ dung dịch phía dưới ống Lặp lại bước 4 với phần mẫu còn lại.
Bước 5: Cho 500àl AW1 vào cột QIA, ly tõm 8.000 vũng/phỳt/2 phỳt, loại bỏ dịch phía dưới cột
Bước 6: Đổ 500µl AW2 vào cột QIA, ly tâm ở tốc độ 13.500 vòng/phút trong 3 phút Sau đó, loại bỏ dịch phía dưới cột và ly tâm lại lần nữa với tốc độ tối đa trong 1 phút.
Đặt cột QIA vào ống Eppendorf 1.5 ml mới, thêm 60 µl AVE và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút Ly tâm ở tốc độ 8.000 vòng/phút trong 1 phút Thu dịch qua cột và bảo quản ở -20°C hoặc -80°C.
* Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu ARN sau khi tỏch chiết sẽ ủược hỗn hợp với cỏc thành phần ủược trình bày ở bảng 2.1
Bảng 2.1 Thành phần phản ứng RT - PCR
Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy (àl)
Tiến hành phản ứng khuếch ủại sản phẩm trong mỏy PCR theo chu kỳ nhiệt ủược trỡnh bày ở bảng 2.2
Bảng 2.2 Chu kỳ nhiệt của phản ứng RT - PCR
Giai ủoạn Bước tổng hợp Nhiệt ủộ ( o C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
- ðiện di kiểm tra sản phẩm PCR
Để chuẩn bị thạch Agarose 1,2%, bạn cần cân 1,2g Agarose và hòa tan vào 100ml dung dịch TBE 1X Sau đó, đun sôi hỗn hợp trong lò vi sóng và để nguội xuống khoảng 40 độ C Cuối cùng, đổ thạch vào khay với số giếng tương ứng với số mẫu cần phân tích.
- Chuẩn bị mẫu: Thờm 2 àl loading dye vào 8 àl sản phẩm RT-PCR
- Chuẩn bị bể ủiện di: Chuyển thạch ủó ủụng vào bể ủiện di, thờm TBE 1X ủến ngập thạch
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR vào cỏc giếng với thể tớch 3àl maker 100bp và 10 àl sản phẩm PCR mỗi giếng
- ðiện di ở hiệu ủiện thế 100V trong 30 phỳt
- Quan sỏt kết quả ủiện di sản phẩm PCR trờn mỏy chụp ảnh gel và chụp ảnh
2.4.7 Phương pháp làm tiêu bản vi thể
Phương pháp làm tiêu bản vi thể bao gồm quy trình tẩm ủy bằng parafin và nhuộm Haematoxilin – Eosin (HE) Các bước thực hiện quy trình này bao gồm: chuẩn bị mẫu, tẩm parafin, cắt mẫu, nhuộm bằng Haematoxilin và Eosin, và cuối cùng là quan sát dưới kính hiển vi.
Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất
- Dụng cụ: mỏy ủỳc block, khuụn ủỳc, tủ ấm, mỏy cắt mảnh mycrotom, phiến kớnh, lamen, dao, kộo, panh, kẹp, cốc ủựng húa chất
- Hóa chất: focmol 10%, cồn các loại, xylen paraffin, thuốc nhuộm eosin, hematoxylin
Chuẩn bị và cố ủịnh bệnh phẩm
Để nghiên cứu bệnh phẩm từ lợn mắc bệnh PRRS, cần lấy mẫu từ các vùng dịch Mẫu bệnh phẩm được cắt gọn, đánh dấu rõ ràng và ngâm trong dung dịch formalin trung tính 10% Thể tích formalin phải gấp ít nhất 10 lần thể tích của mẫu bệnh phẩm Sau 10-15 ngày, lấy bệnh phẩm ra để thực hiện các bước tiếp theo trong quá trình nghiên cứu.
Tiến hành lần lượt các bước sau:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU DIỄN BIẾN DỊCH PRRS TẠI MỘT SỐ ðỊA PHƯƠNG
3.1.1 Diễn biến tình hình dịch PRRS ở các tỉnh vùng tả ngạn sông Hồng từ năm 2007-2010
Từ năm 2007 đến nay, dịch PRRS đã liên tục bùng phát ở miền Bắc Việt Nam theo một quy luật nhất định, với hai đợt dịch trong năm: đợt 1 từ cuối tháng 2 đến đầu tháng 3 và đợt 2 từ tháng 10 đến hết năm Dịch thường bắt đầu tại một địa phương cụ thể và nhanh chóng lan ra các xã, huyện, tỉnh lân cận, đặc biệt khi có yếu tố như vận chuyển lợn bệnh Mặc dù ổ dịch có thể chỉ xuất hiện ở một vài xã, nhưng thực tế cho thấy sự lây lan diễn ra trên diện rộng Trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã phối hợp với cơ quan Thú y vùng II để theo dõi tình hình dịch PRRS tại các tỉnh thuộc vùng tả ngạn sông Hồng, bao gồm Cao Bằng, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Hưng Yên và Thái Bình, và tổng hợp diễn biến dịch từ năm 2007 đến 2010 theo bảng 3.1.
Bảng 3.1 Diễn biến tình hình dịch PRRS ở các tỉnh vùng tả ngạn sông
(Số liệu ủược tổng hợp theo bỏo cỏo của cơ quan Thỳ Y vựng II)
Số lợn chết và tiêu hủy (con)
Kể từ khi xuất hiện vụ dịch ủầu tiờn tại Hải Dương vào thỏng 3 năm
Năm 2007, dịch PRRS bùng phát mạnh mẽ, gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng với 53.030 con lợn mắc bệnh, trong đó 18.900 con đã chết và phải tiêu hủy Từ năm 2008 đến 2010, dịch vẫn âm thầm tái phát ở nhiều khu vực với mức độ khác nhau, đặc biệt là vào năm 2010, khi dịch PRRS tấn công dữ dội, làm kiệt quệ ngành chăn nuôi lợn tại Việt Nam, dẫn đến thiếu hụt nghiêm trọng nguồn giống Sau bốn năm dịch bệnh hoành hành, chỉ riêng các tỉnh thuộc tả ngạn sông Hồng đã ghi nhận 191.227 con lợn ốm, trong đó 85.042 con đã chết và phải tiêu hủy Dịch PRRS vẫn tiếp diễn hàng năm, gây chết nhiều lợn và ngày càng phức tạp hơn, mặc dù đã có nhiều biện pháp phòng chống, nhưng vẫn là thách thức lớn đối với ngành chăn nuôi.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn 5 tỉnh có ngành chăn nuôi lợn phát triển mạnh mẽ ở vùng tả ngạn sông Hồng, bao gồm Bắc Giang, Hải Phòng, Bắc Ninh, Hải Dương và Hưng Yên Số liệu về lợn mắc bệnh PRRS từ năm 2007 đến 2010 tại các tỉnh này được trình bày chi tiết trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Tổng hợp số lợn mắc bệnh trong vùng dịch PRRS từ năm 2007
Số lợn mắc bệnh trong năm (con) Năm
Năm 2007, dịch PRRS bùng phát tại Hải Dương vào ngày 12/3, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam Hải Dương ghi nhận 15.804 con lợn mắc bệnh, cao nhất trong các tỉnh theo dõi, tiếp theo là Bắc Giang với 13.597 con Các tỉnh Hải Phòng, Bắc Ninh và Hưng Yên có số lợn mắc bệnh thấp hơn, dao động từ 461-6.132 con Dịch bệnh diễn biến khác nhau giữa các tỉnh, góp phần làm lan rộng và khó kiểm soát Từ năm 2007, PRRS trở thành mối đe dọa không thể xem thường cho ngành chăn nuôi Năm 2008, chỉ Hải Dương báo cáo có 674 con lợn mắc bệnh, cho thấy các địa phương đã nâng cao ý thức và có biện pháp phòng ngừa hiệu quả Đến năm 2009, dịch chỉ xảy ra ở Bắc Giang và Hưng Yên với 816 con lợn mắc bệnh.
Vào năm 2010, dịch PRRS bùng phát mạnh mẽ trên diện rộng, trở thành vụ dịch nghiêm trọng nhất trong lịch sử, gây thiệt hại nặng nề cho hầu hết các tỉnh mà chúng tôi theo dõi Tỉnh Bắc Ninh ghi nhận 55.462 con lợn mắc bệnh, trong khi tỉnh Hưng Yên có 24.305 con lợn bị ảnh hưởng Số lượng lợn bệnh tại các tỉnh còn lại dao động từ 3.962 đến 9.390 con.
Bắc Giang Hải Phòng Bắc Ninh Hải Dương Hưng Yên
Hỡnh 3.1 Biểu ủồ tổng hợp số lợn mắc bệnh trong vựng dịch PRRS từ năm 2007 – 2010 ở ủịa bàn nghiờn cứu
Từ năm 2007 đến 2010, tổng số lợn mắc bệnh PRRS tại 5 tỉnh mà chúng tôi theo dõi là 140.898 con, trong đó năm 2010 chiếm tới 98.140 con Bắc Ninh là tỉnh có số lợn mắc bệnh cao nhất, tiếp theo là Hưng Yên Những số liệu này cho thấy dịch PRRS đang diễn biến ngày càng nghiêm trọng và khó kiểm soát Nếu không có biện pháp và chiến lược phòng bệnh hiệu quả, PRRS sẽ tiếp tục là mối đe dọa lớn đối với ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam.
3.1.2 Tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu ủàn ủược khảo sỏt trong ủịa bàn nghiên cứu
Trong nghiên cứu về dịch PRRS, chúng tôi nhận thấy rằng lợn ở các giai đoạn phát triển khác nhau có tỷ lệ mắc bệnh khác nhau Các diễn biến phức tạp về tính chất gây bệnh và khả năng lây lan rộng đã được khảo sát, và kết quả được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu ủàn ủược khảo sỏt trong ủịa bàn nghiên cứu
Lợn thịt Lợn con ðực giống Lợn nái
Theo bảng 3.3, năm tỉnh mà chúng tôi theo dõi đều có đặc điểm chung là số lượng lợn nuôi rất lớn, ví dụ như Bắc Giang, nơi có tổng đàn lợn đứng thứ nhì ở miền Bắc chỉ sau Thanh Hóa Tuy nhiên, lợn chủ yếu được nuôi theo quy mô nhỏ dưới hình thức gia trại và hộ chăn nuôi gia đình, với trình độ chăn nuôi chưa cao Cơ cấu đàn lợn ở các tỉnh này tương đối giống nhau, dẫn đến khi dịch bệnh bùng phát, có sự tương đồng nhất định về tỷ lệ mắc bệnh theo giai đoạn Cụ thể, trong tổng số 18.163 lợn mắc PRRS ở Bắc Giang, có 7.257 con lợn thịt mắc bệnh, chiếm tỷ lệ cao nhất (39,95%), 6.572 lợn con mắc bệnh chiếm 37,17%, 4.574 lợn nái mắc bệnh chiếm 25,18%, và chỉ có 30 con lợn đực giống mắc bệnh, chiếm 0,17%.
Lợn thịt Lợn con ðực giống Lợn nái
Hỡnh 3.2 Biểu ủồ biểu diễn tỡnh hỡnh lợn mắc PRRS theo cơ cấu ủàn trong ủịa bàn nghiờn cứu
Trong những năm qua, Hải Phòng đã ghi nhận tổng số lợn mắc PRRS lên tới 5.482 con, trong đó có 3.337 lợn thịt, chiếm 60,87% Tỷ lệ mắc bệnh ở lợn con là 27,89% và ở lợn nái là 11,09% Tại Bắc Ninh, Hải Dương và Hưng Yên, lợn thịt vẫn là đối tượng chính bị ảnh hưởng với tỷ lệ mắc bệnh dao động từ 41,00% (Hưng Yên) đến 47,27% (Bắc Ninh) Tỷ lệ mắc bệnh ở lợn con nằm trong khoảng 34,89-49,09%, trong khi tỷ lệ ở lợn nái dao động từ 7,96-23,38% Đáng chú ý, tỷ lệ mắc bệnh ở lợn giống chỉ khoảng 0,13-0,7%, thấp nhất so với các nhóm lợn khác.
Tỷ lệ mắc bệnh theo cơ cấu ủàn ở 5 tỉnh mà chỳng tụi theo dừi ủược tổng hợp qua biểu ủồ 3.3
Lợn thịt Lợn con ðực giống Lợn nái
Hỡnh 3.3 Biểu ủồ tổng hợp tỷ lệ lợn mắc PRRS theo cơ cấu ủàn trong ủịa bàn nghiên cứu
Theo biểu đồ tổng hợp, lợn thịt mắc PRRS chiếm tỷ lệ cao nhất với 44.57%, tiếp theo là lợn con với 39.15%, lợn nái 15.93%, và thấp nhất là lợn ủực giống với 0.35% Mối tương quan này phản ánh thực tế chăn nuôi, khi số lượng lợn thịt luôn chiếm ưu thế trong tổng thể đàn lợn, do đó, trong trường hợp dịch bệnh, lợn thịt sẽ là nhóm có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất.
Tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS của 5 tỉnh mà chỳng tụi theo dừi ủược trỡnh bày ở bảng 3.4
Bảng 3.4 Tổng hợp tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS trong ủịa bàn nghiờn cứu
Từ bảng số liệu, trong giai đoạn 2007-2010, chúng tôi ghi nhận 140.898 con lợn mắc bệnh PRRS tại 5 tỉnh, trong đó có 45.959 con chết, chiếm tỷ lệ 32,62% Bảng số liệu cũng chỉ ra rằng tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết ở các tỉnh khác nhau có sự khác biệt rõ rệt Tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS được thể hiện chi tiết trong bảng 3.4.
Hỡnh 3.4 Biểu ủồ tổng hợp tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS
Qua biểu đồ, chúng ta có thể đánh giá mối quan hệ giữa tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết khi lợn mắc PRRS Ngoài ra, biểu đồ cũng giúp sơ bộ đánh giá tình hình chăn nuôi và hiệu quả của công tác điều trị tích cực cho lợn trong thời gian có dịch.
Theo số liệu tổng hợp, lợn thịt mắc bệnh PRRS có tỷ lệ tử vong thấp hơn so với lợn con, mặc dù tỷ lệ mắc bệnh cao hơn khi dịch bùng phát Khảo sát tỷ lệ chết theo cơ cấu đàn lợn mắc PRRS đã được trình bày trong bảng 3.5.
Bảng 3.5 Tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS theo cơ cấu ủàn ủược khảo sỏt trong ủịa bàn nghiờn cứu
Lợn thịt Lợn con ðực giống Lợn nái
Số lượng (con) Tỷ lệ (%)
Qua bảng 3.5, chúng tôi nhận thấy rằng lợn ở các giai đoạn khác nhau sẽ có sức đề kháng khác nhau trước các bệnh truyền nhiễm, đặc biệt là PRRS Bên cạnh đó, tập quán, trình độ và quy mô chăn nuôi cũng ảnh hưởng đến tỷ lệ chết của lợn, tùy thuộc vào từng đối tượng như lợn con, lợn thịt hay lợn nái.
Bắc GiangHải Phòng Bắc Ninh Hải
Lợn thịt Lợn con ðực giống Lợn nái
Hỡnh 3.5.Biểu ủồ biểu diễn tỷ lệ lợn chết do mắc PRRS theo cơ cấu ủàn ủược khảo sỏt trong ủịa bàn nghiờn cứu
Tại Hưng Yên, qua các vụ dịch PRRS, có 14.269 con lợn chết, trong đó 8.754 con lợn con chiếm 61,35%, 5.054 lợn thịt chiếm 35,42%, và chỉ 3,22% lợn nái bị chết Tương tự, tại Hải Dương, trong số 7.428 con lợn chết, có 5.104 lợn con chiếm 68,71%, lợn thịt chiếm 28,03% và lợn nái chiếm 3,19% Tỷ lệ lợn chết theo cơ cấu giống cần được chú ý.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ðẶC ðIỂM BỆNH LÝ CHỦ YẾU CỦA LỢN MẮC PRRS
3.2.1 Kết quả xỏc ủịnh triệu chứng lõm sàng ủặc trưng của lợn mắc PRRS
Thông qua việc quan sát, quay phim và chụp ảnh tại các ổ dịch, kết hợp với công tác khám bệnh định kỳ, chúng tôi đã tổng hợp được một số triệu chứng điển hình của lợn mắc bệnh PRRS, như được trình bày trong bảng 3.7.
Bảng 3.7 Triệu chứng của lợn ốm trong vùng dịch PRRS
(n0 cho mỗi loại lợn theo dõi, Nái chửa và nái nuôi con n= 50)
12 Viêm bộ phận sinh dục - - - 38 46
Theo dõi các triệu chứng bệnh trong dịch PRRS, chúng tôi ghi nhận một số biểu hiện như sau: Lợn thường sốt cao, bỏ ăn, sau đó cơ thể chuyển sang trạng thái suy yếu Vài ngày sau, lợn bắt đầu xuất hiện tình trạng da mỏng, tai lợn có dấu hiệu viêm Lợn bệnh thường bị tiêu chảy nặng, phân sống có màu nâu vàng Một số trường hợp lợn nôn ra máu, mắt sưng, có dử mắt và mũi chảy dịch nhầy Trước khi chết, lợn thường sốt rất cao, sau đó thân nhiệt giảm, có biểu hiện run rẩy và sùi bọt mép Đặc biệt, trên nhiều đàn lợn ốm lâu ngày (21-30 ngày) mà không chết, có nhiều con gầy yếu, da trắng bệch, thường nằm ở góc chuồng và thở rất khó khăn, khi di chuyển thì lờ đờ hoặc cố gắng đi lại một cách khó khăn.
Phân tích bảng số liệu cho thấy các triệu chứng phổ biến của bệnh truyền nhiễm bao gồm sốt và bỏ ăn (100%), cùng với da ửng đỏ Một triệu chứng cần lưu ý là tai xanh, với tỷ lệ xuất hiện chỉ từ 2 – 7%, khác biệt so với một số nghiên cứu trước đó Các triệu chứng đáng chú ý khác có tỷ lệ cao là tiêu chảy (64 – 94%), khó thở (85 – 95%) và chảy nước mũi (50-67%) Tỷ lệ tiêu chảy ở lợn con theo mẹ và lợn con cai sữa cao hơn so với các đối tượng khác, dẫn đến tỷ lệ chết cao nhất trong vùng dịch PRRS Nghiên cứu của Phạm Ngọc Thạch (2007) cho thấy 100% lợn ốm có dấu hiệu sốt cao và bỏ ăn, 95% có chảy dịch nhày ở mũi, và 100% lợn choai có khó thở Triệu chứng khó thở rất phổ biến, cho thấy tình trạng nghiêm trọng của đàn lợn bệnh trước khi chết, trong khi chảy dịch nhày ở mũi là triệu chứng lâm sàng thường gặp nhất trong vùng dịch PRRS, giúp bác sĩ thú y có những kết luận ban đầu về dịch.
Trong nghiên cứu thực nghiệm về PRRS do tác giả Yonggang Liu và cộng sự (2010) thực hiện, lợn nhiễm chủng PRRSV HuN4 cho thấy các triệu chứng bệnh rõ rệt Ban đầu, lợn có biểu hiện giảm tính thèm ăn và giảm tăng trọng trong khoảng thời gian từ 3 đến 21 ngày sau khi gây nhiễm Sau đó, nhiệt độ cơ thể tăng cao và xuất hiện các triệu chứng hô hấp như khó thở và ho trong khoảng từ 4 đến 15 ngày sau khi nhiễm Đặc biệt, mũi của lợn bị bệnh chảy nhiều dịch đặc giống như mủ.
Trong vòng 21 ngày, nhiều lợn đã xuất hiện các triệu chứng như liệt hai chân sau, run cơ, tiêu chảy nặng và da mỏng, đặc biệt là vùng cạnh tai chuyển sang màu xanh Ngoài ra, các triệu chứng khác như khó thở, tiêu chảy nặng, tím mừm và tóm tai cũng được ghi nhận, khiến người ta nghi ngờ về nguyên nhân gây chết cho nhiều lợn trong vùng dịch Các vi khuẩn hoặc virus phát triển từ hệ tiêu hóa và hô hấp được xem là nguyên nhân chính Do đó, việc điều trị và ngăn chặn các yếu tố gây bệnh ở hệ hô hấp và tiêu hóa của lợn trong vùng dịch là rất cần thiết để bảo vệ đàn lợn.
3.2.2 Nghiờn cứu sự biến ủổi về thõn nhiệt khi lợn mắc PRRS
Trong thí nghiệm này, chúng tôi đã chọn 30 con lợn ốm có dấu hiệu bệnh lớn từ các đàn lợn bị PRRS (ký hiệu LB) và 30 con lợn khỏe mạnh không có dấu hiệu bệnh lý từ vùng không có dịch PRRS (ký hiệu LK) Sau đó, chúng tôi tiến hành đo thân nhiệt hàng ngày của cả hai nhóm lợn nghiên cứu bằng cách sử dụng nhiệt kế thủy ngân qua trực tràng, và kết quả được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8 Kết quả ủo thõn nhiệt lợn mắc PRRS
Lợn bình thường có thân nhiệt dao động từ 38 đến 40 độ C Khi lợn mắc bệnh truyền nhiễm hoặc có viêm, ổ mủ trong cơ thể, thân nhiệt sẽ tăng cao, dẫn đến biểu hiện sốt Phản ứng sốt ở lợn được xác định khi thân nhiệt vượt mức bình thường.
Nghiên cứu cho thấy, khi nhiệt độ đạt 40,0°C, 66,67% lợn bệnh bắt đầu có dấu hiệu sốt sau ngày thứ hai, với nhiệt độ cơ thể tăng lên 40,5°C Nhiệt độ cao nhất được ghi nhận vào ngày thứ năm, khi một số lợn có nhiệt độ lên tới 41,8°C, đánh dấu thời điểm lợn ốm sốt cao nhất với nhiệt độ trung bình đạt 41,6°C Sau đó, nhiệt độ dần giảm, có thể do sốt bắt đầu lui Trong khi đó, nhóm lợn khỏe mạnh không xuất hiện dấu hiệu sốt nào trong suốt thời gian theo dõi.
Diễn biến về thõn nhiệt khi lợn mắc PRRS ủược Yonggang Liu và cs,
Nghiên cứu năm 2010 cho thấy có tới 13 trong số 16 con lợn thí nghiệm bị sốt trên 41°C vào các ngày thứ 5, 6 và 9, với nhiệt độ chủ yếu dao động từ 40,2 đến 40,5°C Đặc biệt, có trường hợp sốt lên đến 41,3°C ở ngày thứ 21, sau đó nhiệt độ giảm xuống 40°C trong khoảng từ 22 đến 28 ngày Kết quả này tương tự như quan sát của chúng tôi, tuy nhiên, thời gian biến đổi nhiệt độ có sự khác biệt, có thể do sức mạnh của virus PRRSV và phản ứng của từng cá thể lợn đối với virus là khác nhau, dẫn đến thời gian phục hồi nhiệt độ cũng không giống nhau.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRIỆU CHỨNG LÂM SÀNG
Hình 3.8 Lợn ốm ngày thứ 15 Hình 3.9 Lợn chết do PRRS
Hỡnh 3.10 Lợn tớm tai, xanh tai Hỡnh 3.11 Lợn sốt cao, thõn ủỏ, nôn mửa
Hình 3.12 Lợn ủ rũ mệt mỏi Hình 3.13 Lợn chết, thân có nhiều nốt ủỏ
3.2.3 Ảnh hưởng của PRRSV ủối với lợn nỏi sinh sản
PRRSV là tác nhân gây rối loạn hô hấp cho lợn ở mọi lứa tuổi, với triệu chứng hô hấp rõ ràng trong các ổ dịch Ngoài ra, đối với lợn nái, PRRSV còn gây rối loạn sinh sản, dẫn đến thiệt hại lớn cho người nuôi Để khảo sát sự hiện diện của PRRSV ở lợn nái, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu phủ tạng từ phổi và hạch phổi của lợn nái mắc bệnh và chết trong vùng dịch PRRS, và đã thu được kết quả như trình bày trong bảng 3.9.
Bảng 3.9 Tỷ lệ nhiễm PRRSV trờn ủàn nỏi sinh sản
TT ðối tượng NC Số mẫu phân tích
Số mẫu dương tính (con)
Chửa kỳ 1 kéo dài 3 tuần và chửa kỳ 2 kéo dài 3 tháng, trong đó tỷ lệ tìm thấy PRRSV ở cả ba đối tượng quan sát đều rất cao Cụ thể, trong số 44 lợn nái chửa kỳ 1, có 36 con dương tính, chiếm 81,82%, trong khi tỷ lệ dương tính ở nái chửa kỳ 2 cao hơn, đạt 91,07% Tỷ lệ dương tính cao nhất được ghi nhận ở lợn chửa ở giai đoạn sau Nghiên cứu chỉ ra rằng lợn chửa ở giai đoạn sau mắc PRRS có tỷ lệ chết rất cao Các nghiên cứu trước đây của Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Văn Thanh và Lờ Văn Năm cũng cho kết quả tương tự Mặc dù nhiều cá thể lợn nái nhiễm PRRSV không chết, nhưng khả năng sinh sản của chúng ở các lứa đẻ sau sẽ bị ảnh hưởng nhiều.
3.2.4 Hậu quả về rối loạn sinh sản trờn ủàn lợn nỏi sống sút sau dịch PRRS
Sau mỗi vụ dịch PRRS, ngành chăn nuôi lợn thường phải đối mặt với những di chứng nặng nề, bao gồm tỷ lệ lớn lợn con và lợn choai mắc bệnh và chết Lợn nái thường gặp phải tình trạng sảy thai, đẻ non và thai chết lưu, gây thiệt hại cho lợn mẹ Một vấn đề quan trọng cần được chú ý là khả năng sản xuất của đàn lợn nái không chết sau khi dịch qua đi Chúng tôi đã theo dõi khả năng sinh sản của 212 lợn nái đã hồi phục sau dịch PRRS, và kết quả được trình bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10 Ảnh hưởng của PRRS sau khi khỏi bệnh ủến sự sinh sản của ủàn lợn nỏi
TT Chỉ tiêu theo dõi
Số lợn nái theo dõi (con)
Số lợn nái có biểu hiện (con)
Sau khi tách lợn con khoảng 4 đến 5 ngày, lợn nái sẽ trở lại động dục để chuẩn bị cho chu kỳ mang thai tiếp theo Nếu sau ngày thứ 5 mà không có dấu hiệu động dục, lợn nái được coi là chậm động dục Trong số 212 lợn nái được theo dõi, có 39 con biểu hiện chậm động dục, chiếm tỷ lệ 18,4% Khi lợn nái chưa động dục sau 5 ngày, chủ trại cần can thiệp bằng các biện pháp như tiêm hormone hoặc cho lợn chạy quanh chuồng Nếu không có kết quả, tỷ lệ lợn xác định không động dục là 16,51% Thụ tinh không thành công cũng là vấn đề nghiêm trọng trong quá trình sản xuất giống, với thực tế cho thấy lợn nái đã được thụ tinh mà 21 ngày sau lại động dục trở lại được coi là thụ tinh không có kết quả Trong 212 lợn nái theo dõi, chỉ có 12 con thụ tinh không thành công, chiếm 5,66%.
Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Thanh và Nguyễn Hữu Nam (2007), virus PRRSV kết hợp với vi khuẩn có thể gây viêm nội mạc tử cung, dẫn đến rối loạn sinh sản ở lợn nái, với hậu quả nghiêm trọng nhất là sẩy thai và sinh non Cụ thể, có tới 24,06% lợn nái bị sẩy thai do tác động của PRRSV làm biến dạng thành nội mạc tử cung, ảnh hưởng đến khả năng làm tổ và nuôi dưỡng phôi thai Nghiên cứu của Ma Guowen và cộng sự (1998, 1999) thông qua phương pháp ELISA và RT-PCR cho thấy tỷ lệ lớn các trường hợp thai chết lưu và sẩy thai đều dương tính với PRRSV, gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA PRRS TRÊN LỢN NÁI VÀ ðỰC GIỐNG
Hình 3.14 Sẩy thai ở kỳ chửa cuối
Hình 3.16 Sẩy thai ở kỳ chửa ủầu
Hỡnh 3.17 Lợn nỏi ủẻ non
Hỡnh 3.18 Thai chết lưu và thai gỗ Hỡnh 3.19 Lợn ủực giống mắc PRRS
3.2.5 Kết quả nghiờn cứu bệnh tớch ủại thể của lợn mắc PRRS ðể nghiờn cứu những triệu chứng lõm sàng ở cỏc ủối tượng lợn mắc bệnh trong vựng dịch PRRS, chỳng tụi tiến hành mổ khỏm ủể kiểm tra bệnh tớch ủại thể và lấy mẫu bệnh phẩm phục vụ cho việc nghiờn cứu Quỏ trỡnh mổ khỏm ủược tiến hành tại cỏc trại chăn nuụi cú dịch, nơi tiờu hủy lợn ốm, mẫu ủược bảo quản tại phũng thớ nghiệm của khoa Thỳ y – ðại học Nụng nghiệp
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÁC CHỈ TIÊU HUYẾT HỌC CỦA LỢN MẮC PRRS
Máu phản ánh tình trạng sức khỏe của gia súc, do đó, nghiên cứu sự biến đổi của máu là tiêu chí quan trọng trong chẩn đoán bệnh Để cung cấp thông tin đầy đủ về lợn mắc bệnh phổi, chúng tôi đã khảo sát một số chỉ tiêu huyết học cơ bản của lợn Kết quả nghiên cứu sẽ được trình bày trong các mục tiếp theo.
3.3.1 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu hệ hồng cầu của lợn bệnh
Hồng cầu có nhiệm vụ vận chuyển O2 đến các tổ chức và đưa CO2 từ tổ chức trở lại phổi, chức năng này được thực hiện nhờ huyết sắc tố Hồng cầu là tế bào đặc biệt, không có nhân và rất ít bào quan, với hình dạng dẹt và lồi hai mặt Cấu trúc đặc biệt này giúp các phân tử huyết sắc tố trong hồng cầu luôn gần màng tế bào, tạo điều kiện thuận lợi cho việc tiếp xúc với O2.
Số lượng hồng cầu khác nhau giữa các loài và có sự biến đổi trong cùng một loài tùy thuộc vào giống, tuổi, giới tính và chế độ dinh dưỡng Khi gia súc mắc bệnh, số lượng hồng cầu có thể tăng hoặc giảm.
Kết quả khảo sỏt một số chỉ tiờu hệ hồng cầu ủược trỡnh bày ở bảng 3.26
Bảng 3.26 Kết quả khảo sát một số chỉ tiêu hệ hồng cầu của lợn bệnh
Stt Chỉ tiêu Lợn bệnh (n )
4 Thể tích bình quân của
5 Nồng ủộ huyết sắc tố bỡnh quân (%) 28,51 30,53 < 0,05
6 Lượng huyết sắc tố bình quân trong một hồng cầu (pg) 19,46 21,18 < 0,05
Qua bảng 3.26: cho thấy số lượng hồng cầu ở lợn ủối chứng trung bỡnh 6,22 ± 0,06 triệu/mm 3 dao ủộng 5,65 - 7,25
Theo Hồ Văn Nam và cs, (1996), số lượng hồng cầu lợn trung bình 6,5 triệu/mm 3 , dao ủộng từ 6,00 - 7,50
Theo Nguyễn Xuõn Tịnh và cs, (1996) số lượng hồng cầu dao ủộng từ 6,00 - 8,00 triệu/mm 3
Theo nghiên cứu của Perk và cs (1964), số lượng hồng cầu trung bình ở lợn là 6,50 triệu/mm³, dao động từ 5,00 đến 8,00 triệu/mm³ Schmidt, D.A (1986) cho biết số lượng hồng cầu dao động từ 5,7 đến 8,3 triệu/mm³, với giá trị trung bình là 7 triệu/mm³ Coles (1967) cũng chỉ ra rằng số lượng hồng cầu của lợn khỏe mạnh là 6,5 triệu/mm³, dao động trong khoảng từ 5 đến 8 triệu/mm³ (Nguyễn Hữu Nam, 2007).
Khi lợn mắc bệnh, số lượng hồng cầu tăng lên 6,53 ± 0,07 triệu/mm³, dao động trong khoảng 5,80 - 7,70 triệu/mm³ Bệnh PRRS gây ra tình trạng thiếu oxy ở các mô bào, dẫn đến phản ứng thích nghi của cơ thể, tăng cường quá trình tạo máu và kéo dài tuổi thọ của hồng cầu, nhằm khắc phục tình trạng thiếu oxy.
Hàm lượng huyết sắc tố có mối liên hệ tỷ lệ thuận với số lượng hồng cầu; khi số lượng hồng cầu tăng, hàm lượng huyết sắc tố cũng tăng theo Ở lợn ốm, hàm lượng huyết sắc tố trung bình đạt 13,85 ± 0,51 mg%, với dao động từ 11,70 đến 15,02% Trong khi đó, ở lợn đối chứng, hàm lượng huyết sắc tố trung bình là 12,10 ± 0,31 mg%, dao động từ 10,95 đến 14,50%.
Tỷ khối huyết cầu (hematocrit) là tỷ lệ phần trăm khối lượng hồng cầu trong thể tích mẫu máu, được tính bằng đơn vị % Tỷ lệ này có thể tăng hoặc giảm do nhiều nguyên nhân khác nhau, do đó việc xác định tỷ khối huyết cầu rất quan trọng trong quá trình chẩn đoán.
Tỷ khối huyết cầu trung bình của lợn mắc PRRS trong khảo sát của chúng tôi là 45,45 ± 0,41%, dao động từ 42,50 - 47,50%, cao hơn so với nhóm chứng Sự gia tăng số lượng hồng cầu tương ứng với tỷ khối huyết cầu Theo nghiên cứu của Bush và cộng sự (1995), tỷ khối huyết cầu của lợn dao động từ 32 - 42%, trong khi Coles cho rằng tỷ lệ này nằm trong khoảng 32 đến 50% Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng nằm trong khoảng dao động chung này.
- Thể tích bình quân của hồng cầu (V bq ) là thể tích bình quân của mỗi hồng cầu , ủơn vị tớnh là àm 3 và ủược tớnh theo cụng thức:
V bq (àm 3 ) Số triệu hồng cầu/mm 3
Kết quả khảo sát cho thấy, thể tích bình quân hồng cầu của lợn bị bệnh là 69,68 âm 3, trong khi lợn khỏe mạnh chỉ đạt 68,25 âm 3 Điều này cho thấy rằng, khi lợn mắc bệnh, thể tích hồng cầu trung bình sẽ lớn hơn so với lợn khỏe mạnh.
Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ huyết sắc tố ở lợn ốm là 28,51%, thấp hơn so với 30,53% ở lợn khỏe mạnh Điều này chứng tỏ rằng khi tuổi thọ của hồng cầu kéo dài, chất lượng của chúng sẽ giảm so với mức bình thường.
Lượng huyết sắc tố bình quân trong một hồng cầu, được đo bằng picogram (pg), cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa lợn ốm và lợn khỏe Cụ thể, hàm lượng huyết sắc tố bình quân của lợn ốm là 21,18 pg, trong khi lợn chứng trung bình chỉ đạt 19,46 pg Mặc dù lượng huyết sắc tố bình quân của lợn bệnh không khác biệt đáng kể so với lợn khỏe (p > 0,05), nhưng nồng độ huyết sắc tố bình quân ở lợn bệnh lại thấp hơn so với lợn chứng Điều này khẳng định rằng chất lượng hồng cầu ở lợn bệnh bị suy giảm nghiêm trọng, dẫn đến hậu quả là tình trạng thiếu oxy nghiêm trọng ở các mô bào.
Sau khi kiểm tra các chỉ tiêu về hệ hồng cầu và chỉ tiêu về Hemoglobin ở lợn bệnh chúng tôi có nhận xét như sau
Khi lợn bị mắc PRRS, số lượng hồng cầu trong cơ thể tăng lên để thích nghi, tuy nhiên chất lượng hồng cầu lại giảm sút, dẫn đến tình trạng thiếu oxy nghiêm trọng ở các mô bào.
3.3.2 Kết quả nghiên cứu một số chỉ tiêu hệ bạch cầu của lợn bệnh
Khác với hồng cầu, bạch cầu là những tế bào hoàn chỉnh có nhõn và số lượng bạch cầu trong mỗi loài là cố định, nhưng dễ thay đổi và giao động tùy thuộc vào trạng thái sinh lý và bệnh lý của cơ thể Bạch cầu phản ánh khả năng bảo vệ cơ thể thông qua các hoạt động thực bào và tham gia vào quá trình đáp ứng miễn dịch Kết quả khảo sát các chỉ tiêu hệ bạch cầu được trình bày ở bảng 3.27.
Bảng 3.27 Kết quả khảo sát chỉ tiêu bạch cầu của lợn bệnh
Số lượng bạch cầu (nghìn/mm 3 ) 15,75 ± 0,48
Bạch cầu ủa nhõn trung tính (%)
Bạch cầu ủơn nhõn lớn (%) 1,40 ± 0,18
Theo bảng 3.27, số lượng bạch cầu trung bình ở lợn bệnh là 15,75 ± 0,48 nghìn/mm³, dao động từ 12,55 - 18,75 nghìn/mm³, cho thấy sự tăng rõ rệt so với lợn khỏe, có số lượng bạch cầu trung bình là 12,25 ± 0,48 nghìn/mm³, dao động từ 10,50 - 14,25 nghìn/mm³.
Nguyên nhân khiến bạch cầu trong máu của lợn bệnh tăng cao là do các tác nhân gây bệnh, như vi khuẩn, xâm nhập vào cơ thể Các cơ quan miễn dịch sẽ phản ứng để chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn này.
Kết quả nghiên cứu thực nghiệm trên lợn của Cysewski và cs,
(1989), cũng cho thấy, khi lợn mắc nhóm bệnh phổi thì số lượng bạch cầu tăng lên rõ rệt
ÁP DỤNG PHƯƠNG PHÁP HÓA MÔ MIỄN DỊCH ðỂ CHẨN ðOÁN PRRS
Phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch được chọn để áp dụng trong chẩn đoán PRRS, phục vụ cho mục đích nghiên cứu của đề tài này Để đánh giá ưu điểm và độ tin cậy của phương pháp nhuộm huỳnh quang miễn dịch, chúng tôi đã xây dựng quy trình thí nghiệm qua các bước cụ thể.
Bước 1: Chọn các con lợn ốm trong vùng dịch, có triệu chứng bệnh tích ủiển hỡnh của PRRS
Bước 2: Xét nghiệm để xác định lợn dương tính với PRRSV Chúng tôi sử dụng hai phương pháp chẩn đoán phổ biến trong các phòng thí nghiệm hiện nay: Phương pháp RT-PCR và phương pháp nuôi cấy PRRSV trên môi trường tế bào Marc-145.
Bước 3: Sử dụng phương phỏp húa mụ miễn dịch ủể phỏt hiện sự cú mặt của PRRSV trong mô bào lợn bệnh
Bước 4: So sánh kết quả chẩn đốn của phương pháp hĩa mơ miễn dịch với hai phương pháp RT-PCR và phương pháp nuôi cấy phân lập virus
3.4.1 Chẩn đốn PRRS bằng phản ứng RT-PCR
Mẫu bệnh phẩm được sử dụng là phổi và hạch phổi của lợn nghi mắc PRRS Chúng tôi đã tiến hành tách chiết ARN virus bằng kit QIAamp Sản phẩm tách chiết sau đó được khuếch đại bằng kỹ thuật RT-PCR, sử dụng enzym sao chép ngược và cặp mồi ORF7, P08L220619, P08L220620 Cặp mồi này có khả năng phát hiện virus PRRS thuộc cả chủng Bắc Mỹ và chủng Châu Âu, cho phép xác định đoạn gen virus PRRS với kích thước 392bp Kết quả phản ứng RT-PCR xác định PRRSV được trình bày ở hình 3.48.
Hình 3.48 Kết quả phản ứng RT-PCR
Virus PRRS được phát hiện thông qua phản ứng RT-PCR với chiều dài gen là 392bp, sử dụng thang chuẩn M 100bp Trong đó, giếng từ 1 đến 10 là mẫu từ 5 con lợn bệnh, giếng 11 là mẫu chứng âm và giếng 12 là mẫu chứng dương.
Kết quả của phản ứng RT-PCR đã cho phép chẩn đoán chính xác những con lợn mắc virus PRRS Theo nghiên cứu của tác giả Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (2007), phương pháp RT-PCR được khẳng định là có độ tin cậy cao và có thể yên tâm sử dụng trong chẩn đoán PRRSV.
3.4.2 Chẩn đốn PRRS bằng phương pháp nuơi cấy phân lập virus trên môi trường tế bào Marc-145
Chúng tôi đã thu thập bệnh phẩm từ phổi và hạch phổi của 5 con lợn mắc PRRS, được xác định bằng phản ứng RT-PCR với ký hiệu TNPL1, TNPL2, TNPL3, TNPL4, TNPL5 Những bệnh phẩm này được sử dụng để nuôi cấy virus trên môi trường tế bào Marc.
Nghiên cứu so sánh giữa virus vaccine và môi trường ủ bệnh cho thấy, sau các khoảng thời gian 24h, 36h, và 72h, việc kiểm tra bệnh tích tế bào (CPE) đã được thực hiện Mức độ bệnh tích tế bào được xác định dựa trên tỷ lệ giữa diện tích vùng tế bào bị phá hủy và toàn bộ diện tích bề mặt nuôi cấy Kết quả nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.31.
Bảng 3.31 Kết quả phân lập PRRSV trên môi trường tế bào Marc-145
(Tớnh theo % diện tớch bệnh tớch tế bào so với tổng số diện tớch ủỏy bỡnh)
TT Nhóm lợn Bệnh phẩm CPE
Tỷ lệ sau 72 giờ nuôi cấy
Chú thích: (**) - Tế bào bong khỏi bề mặt giếng nuôi cấy
- Không có bệnh tích tế bào
CPE TRÊN MÔI TRƯỜNG TẾ BÀO MARC-145
Hình 3.49 ðối chứng (-) Hình 3.50 ðối chứng (+)
Hình 3.51 Sau 36 giờ gây nhiễm Hình 3.52 Sau 48 giờ gây nhiễm
Hình 3.53 Sau 60 giờ gây nhiễm Hình 3.54 Sau 72 giờ
Sau khi gây nhiễm virus trên môi trường tế bào, chúng tôi ghi nhận rằng sau 12 giờ chưa thấy dấu hiệu bệnh lớn tế bào, và các CPE chỉ bắt đầu xuất hiện từ 36 giờ sau khi gây nhiễm Đến 72-84 giờ, CPE xuất hiện ở 100% các mẫu nuôi cấy, cho thấy tất cả mẫu bệnh phẩm đều dương tính với PRRSV Theo nghiên cứu của Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan (2007), phương pháp nuôi cấy phân lập trên môi trường tế bào Marc-145 cho kết quả đáng tin cậy trong chẩn đoán PRRSV Để xác định chắc chắn rằng các CPE là do PRRSV gây ra, chúng tôi đã lấy mẫu bệnh phẩm từ lợn dương tính và thực hiện thí nghiệm HMDTB Kết quả từ các thí nghiệm HMDTB một lần nữa khẳng định virus phân lập từ các mẫu thí nghiệm chính là PRRSV.
3.4.3 Chẩn đốn PRRS bằng phương pháp nhuộm hĩa mơ miễn dịch (IHC)
Bằng phương pháp RT-PCR và nuôi cấy virus trên môi trường tế bào Marc-145, chúng tôi đã xác định được sự hiện diện của PRRSV tại phổi và hạch phổi của lợn thí nghiệm Tiếp theo, chúng tôi đã thu thập bệnh phẩm từ những con lợn này để thực hiện nhuộm miễn dịch, với kết quả được trình bày trong bảng 3.32.
Bảng 3.32 Kết quả nhuộm hoá mô miễn dịch một số cơ quan của lợn mắc PRRS
Cơ quan Lợn1 Lợn2 Lợn3 Lợn4 Lợn5 ðối chứng
Ghi chú : +++ đám, hạt bắt màu nâu vàng nhiều
++ đám, hạt bắt màu nâu vàng trung bình
+ đám, hạt bắt màu nâu vàng ắt
- Khụng cú ủỏm, hạt bắt màu nõu vàng
Trên tiêu bản nhuộm huỳnh quang miễn dịch, khi có sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên, kháng thể và kháng thể nhuộm màu, kết quả xét nghiệm của bệnh phẩm trên tiêu bản sẽ là dương tính Điều này được thể hiện qua các ổ màu vàng nâu trên tiêu bản, nơi virus tập trung.
Qua kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch, chúng tôi thấy hầu hết các cơ quan ủều thấy sự cú mặt của PRRS
Phổi là cơ quan biểu hiện rõ rệt các dấu hiệu bệnh lý nặng, với sự hiện diện của virus PRRS tập trung chủ yếu ở phế nang và hạch phổi Virus này cũng được tìm thấy trong tế bào Kupfer của gan, ở thận gây xuất huyết cầu thận và bể thận, trong khi ở tim và não, tỷ lệ phát hiện virus thấp hơn Nghiên cứu của Pol và cộng sự (1991) khẳng định tính chính xác của phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch trong chẩn đoán PRRS, cho thấy sự tập trung của virus ở hầu hết các cơ quan của lợn bệnh là rất quan trọng cho việc xác định bệnh.
MỘT SỐ HÌNH ẢNH MINH HỌA KẾT QUẢ NHUỘM HÓA MÔ
Hình 3.55 Virus tập trung ở phổi
Hình 3.56 Virus tập trung ở phổi
Hình 3.57 Virus tập trung ở gan
Hình 3.58 Virus tập trung ở gan
Hình 3.59 Virus phân bố ở thận
Hình 3.60 Virus phân bố ở thận
3.4.4 Mối tương quan giữa bệnh tớch ủại thể, vi thể của lợn mắc PRRS với kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch
Trong quá trình quan sát lợn bệnh, chúng tôi nhận thấy sự tương đồng giữa bệnh tích đại thể và vi thể Khi bệnh nặng, tiêu bản vi thể cho thấy các biến đổi rõ rệt Để xác định mối liên hệ giữa bệnh tích đại thể, vi thể và kết quả nhuộm huỳnh quang miễn dịch, chúng tôi đã thực hiện thí nghiệm với mẫu phổi và hạch phổi của 5 con lợn Các tiêu bản vi thể và nhuộm huỳnh quang miễn dịch được thực hiện trên các lát cắt tương ứng, và kết quả được so sánh trong bảng 3.33.
Bảng 3.33 Mối tương quan giữa bệnh tớch ủại thể, vi thể và kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch
Số hiệu của lợn thí nghiệm
Biến ủổi ủai thể Biến ủối vi thể Húa mụ miễn dịch
Ghi chỳ: +++ Biến ủổi nặng + Biến ủổi nhẹ
++ Biến ủổi trung bỡnh - Khụng cú biến ủổi
Theo bảng trên, trong số lợn thí nghiệm, lợn số 2 và lợn số 3 có sự tương đồng về biến đổi ủổi ủại thể, vi thể và kết quả nhuộm húa mụ miễn dịch.
Trong nghiên cứu về biến đổi bệnh lý ở lợn, chúng tôi nhận thấy sự khác biệt rõ rệt giữa các lợn Cụ thể, lợn số 2 có biến đổi bệnh lý ở phổi và hạch phổi ở mức (+++), trong khi lợn số 3 có biến đổi ở phổi là (+++) và hạch phổi là (++) Đối với lợn số 1, bệnh tích thể và vi thể đều ở mức (++), nhưng khi nhuộm hóa mô miễn dịch lại cho kết quả (+++) Tương tự, lợn số 4 cũng có biểu hiện bệnh tích thể và vi thể ở mức (++), nhưng nhuộm hóa mô miễn dịch cho kết quả (+++) Lợn số 5 có biến đổi thể và vi thể ở mức (+), nhưng nhuộm hóa mô miễn dịch lại cho kết quả (+++), trong khi phổi của lợn này chỉ đạt mức (+) Điều này cho thấy bệnh lý thể và vi thể không luôn tương đồng với kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch, có thể do ảnh hưởng của số lượng và độc lực của virus Nếu virus tồn tại với số lượng lớn nhưng độc lực thấp, triệu chứng bệnh có thể không biểu hiện rõ Ngược lại, virus với số lượng ít nhưng độc lực cao vẫn có thể gây ra các biến đổi rõ ràng Mức độ biến đổi bệnh lý cũng phụ thuộc vào sức đề kháng của cơ thể lợn; sức đề kháng tốt sẽ làm giảm triệu chứng bệnh nặng và ngược lại Thời điểm lấy mẫu cũng ảnh hưởng đến kết quả quan sát; mẫu lấy khi lợn mới ốm sẽ có virus tập trung nhiều, nhưng bệnh tích chưa rõ, trong khi mẫu lấy sau đó virus ít hơn nhưng bệnh tích lại rõ ràng hơn.
3.4.5 So sánh kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch với các phương pháp chẩn đốn RT-PCR và Phân lập virus trên mơi trường tế bào Marc-145
Sau khi thực hiện nhuộm hóa mô miễn dịch, chúng tôi đã tiến hành so sánh kết quả với các phương pháp chẩn đoán khác Cụ thể, chúng tôi so sánh với các phương pháp chẩn đoán phổ biến hiện nay tại các phòng thí nghiệm, bao gồm phương pháp RT-PCR và nuôi cấy phân lập virus.
Kết quả ủược chỳng tụi trỡnh bày ở bảng 3.34
Bảng 3.34 So sánh kết quả của các phương pháp dùng trong chẩn đốn PRRS
Bệnh phẩm RT - PCR Phân lập virus Hóa mô miễn dịch