Phương pháp chiết fucoidan trong axit pH 2-3
Mẫu rong xay được trộn với HCl 0,1N ở pH 2-2,5 theo tỷ lệ 1:10 và giữ ở 70 °C, khuấy liên tục trong 1 giờ Quá trình này lặp lại ba lần, thu thập dịch lọc và đuổi bớt dung môi bằng cách bay hơi nước Fucoidan được tủa bằng cách thêm ethanol 80% và tinh chế thêm với fomanđehit, sau đó được làm khô và phân tích thành phần.
Phương pháp chiết fucoidan trong nước nóng
Để chiết xuất fucoidan, các mẫu rong được xay nhỏ và ngâm trong 300 ml nước nóng ở 100 °C trong 6 giờ Sau đó, hỗn hợp được lọc và dịch lọc được ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút trong 10 phút Tiếp theo, thêm ethanol 70% vào dịch lọc cho đến khi tạo kết tủa, sau đó thực hiện ly tâm lần nữa để tách fucoidan rắn ra khỏi chất lỏng, thu được fucoidan kết tủa cuối cùng.
Phương pháp chiết fucoidan trong dung dịch CaCl 2 2%
Năm 2018, Bilan và cộng sự đã chiết thành công fucoidan từ rong nâu Alaria Marginata ở vùng biển Thái Bình Dương bằng dung môi CaCl2 2% Họ xử lý 200g rong khô ở nhiệt độ phòng với hỗn hợp MeOH-CHCl3-H2O (tỉ lệ 4:2:1) để loại bỏ chất màu, sau đó sấy khô Bã rong được chiết với 250ml dung dịch CaCl2 2% (5 lần) ở 85°C trong 5 giờ Dịch chiết được gom lại và thêm 80ml dung dịch hexadecyltrimethylammoniumbromide 10% Tủa tạo thành được ly tâm, rửa và khuấy trộn với 150ml dung dịch NaI 20% trong cồn ở nhiệt độ phòng trong 2-3 ngày Sau 5 lần ly tâm, tủa được rửa với cồn và hòa tan lại trong nước Cuối cùng, dung dịch được thẩm tách qua màng 10kDa và đông khô để thu được fucoidan thô dưới dạng muối Na.
Phương pháp chiết fucoidan bằng ethanol
Trong phương pháp này, mẫu rong được xay nhỏ và ngâm trong ethanol 95% theo tỷ lệ 1:2, lắc đều trong 1 giờ để loại bỏ sắc tố, protein và lipid Sau đó, hỗn hợp được ly tâm trong 10 phút, thu được kết tủa Kết tủa này được pha với nước cất hai lần (w/v = 1:10) và đặt trong nồi cách thủy ở nhiệt độ 40 °C.
Sau khi lắc đều trong 15 phút, hỗn hợp được để lắng trong 10 phút và thu lấy phần nổi phía trên Tiếp theo, ethanol 95% được thêm vào phần nổi để tạo ra ethanol 20%, sau đó hỗn hợp lại được để lắng trong 30 phút và tiếp tục thu lấy phần nổi Quá trình này lặp lại với ethanol 95% cho đến khi đạt được nồng độ ethanol 50%, là nồng độ ổn định để thu được fucoidan Cuối cùng, fucoidan rắn được sấy khô ở 40 độ C.
Phương pháp chiết fucoidan bằng chất lỏng ion
Chất lỏng ion (ILs) là loại muối nóng chảy ở nhiệt độ thường, được phát hiện từ năm 1914 bởi Walden Chúng được cấu thành từ các cation và anion có tính đối xứng và mật độ điện tích thấp, tạo nên những tính chất hóa lý đặc trưng như điểm nóng chảy, độ phân cực, độ nhớt, và mức độ ổn định nhiệt và hóa học Cấu trúc của ILs có thể dễ dàng thay đổi bằng cách điều chỉnh các cation hoặc anion, cho phép tạo ra vô số sự kết hợp khác nhau Điều này giúp tùy chỉnh các đặc tính của ILs như tính chất nhiệt vật lý, khả năng phân hủy sinh học, độc tính và tính kỵ nước, nhằm đáp ứng nhu cầu ứng dụng Vì vậy, ILs được coi là dung môi được thiết kế để cung cấp các giải pháp tối ưu.
Chất lỏng ion (ILs) được coi là dung môi xanh nhờ vào các đặc tính vượt trội như áp suất hơi bão hòa thấp, không bắt lửa, cửa sổ điện hóa rộng, và ổn định nhiệt cũng như hóa học cao Khả năng hòa tan đa dạng các hợp chất hữu cơ và vô cơ của ILs giúp thay thế dung môi hữu cơ dễ bay hơi, từ đó giảm thiểu tổn thất dung môi vào khí quyển và ô nhiễm môi trường Với những ưu điểm này, ILs đang được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như hóa lý, hóa phân tích và hóa hữu cơ, hứa hẹn mở ra một hướng đi mới cho hóa học xanh thân thiện với môi trường.
Rong biển chứa nhiều hợp chất có giá trị kinh tế cao như polysaccharide sulfate, lipid và các chất chuyển hóa thứ cấp, nhưng khả năng hòa tan kém trong dung môi thông thường đã hạn chế việc sử dụng hiệu quả chúng Trong thập kỷ qua, nghiên cứu đã chỉ ra rằng ionic liquids (ILs) có thể được sử dụng làm dung môi chiết để thu hồi các hóa chất quý giá từ vi tảo biển Teixeira đã tiến hành nghiên cứu sử dụng ba loại ILs để chiết xuất lipid từ loài vi tảo.
Chlorella vulgaris là ([Bmim][BF4],[Bmim] Cl và[Amim] Cl) Kết quả là cả
Ba loại ionic liquids (ILs) được nghiên cứu đều cho thấy khả năng chiết xuất lipid hiệu quả, với việc bổ sung CO2 vào [Bmim][BF4] giúp tăng hiệu suất chiết lipid từ 14,2% lên 15,6% Nghiên cứu của các nhà khoa học Hàn Quốc cho thấy rằng việc sử dụng hỗn hợp [Bmim][CF3SO3] và methanol có thể nâng cao tổng hàm lượng lipid chiết xuất từ Chlorella Vulgaris lên 12,5% và 19,0% so với phương pháp Bligh và Dyer thông thường Đặc biệt, nghiên cứu của các tác giả Nhật Bản năm 2013 đã chứng minh khả năng hòa tan vi tảo biển Saliferous ướt bằng [C2mim][MeO(H)PO(2)] trong 30 phút mà không cần nhiệt, mở ra tiềm năng ứng dụng ILs trong chế biến vi tảo Ngoài vi tảo biển, các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ILs như [Emim][OAc], [Ch][OAc] và [Emim][Dep] có thể chiết tách agarose từ rong đỏ Gracilaria dura, với [Emim][OAc] đạt hiệu suất cao nhất là 39,5% khi có hỗ trợ nhiệt Pezoa-Conte và cộng sự phát hiện rằng ILs ([TMGH+][EtCO2−]) có thể hòa tan 67% carbohydrate từ Ulva rigida, và khi nhiệt độ tăng từ 100°C lên 120°C, hiệu suất hòa tan carbohydrate tăng gấp ba lần, với khả năng thu hồi carbohydrate đạt 92,0% Điều này cho thấy ILs là dung môi tiềm năng trong công nghệ chiết xuất hoạt chất từ rong biển.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU FUCOIDAN TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM
Tình hình nghiên cứu fucoidan trên thế giới
Mặc dù có nhiều nghiên cứu về cấu trúc của fucoidan, chỉ một số ít công bố rõ ràng về cấu trúc tổng thể, trong khi phần lớn chỉ mô tả các đoạn có độ lặp lại cao Bảng 1.3 trình bày một số cấu trúc chi tiết của fucoidan chiết xuất từ các loài rong nâu trên toàn cầu.
Bảng 1 3 Cấu trúc hóa học của các fucoidan từ một số loài rong nâu [20]
Fucoidan chứa fucose, sulfate và một lượng nhỏ monosaccharide như galactose, glucose, mannose, xylose và uronic acid, cùng với nhóm O-acetyl và các mạch nhánh, tạo nên cấu trúc đa dạng Các loại fucoidan chủ yếu gồm galactose, fucose và sulfate, được chiết xuất từ rong nâu như Laminaria angustata, Laminaria longissima, và Undaria pinnatifida Nhiều fucoidan có cấu trúc phức tạp hơn được tách từ các loài như Dictyota menstrualis và Hizikia fusiforme, với thành phần hóa học phong phú, bao gồm fucose, galactose, glucose, mannose, xylose, uronic acid và sulfate, cùng với khả năng có nhóm acetyl hóa Việc xác định cấu trúc của fucoidan gặp nhiều thách thức, đòi hỏi các nhà khoa học áp dụng nhiều kỹ thuật như phân tích methyl hóa, đề sulfate hóa, và các phương pháp hóa lý hiện đại như NMR và MALDI-TOF/MS/MS để giải quyết vấn đề này.
Việc áp dụng các phương pháp phân tích khối phổ hiện đại như MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS đã mang lại bước đột phá trong việc phân tích cấu trúc phức tạp của polysaccharide, đặc biệt là fucoidan từ rong biển Phương pháp này cho phép phân tích nhanh chóng và chính xác vị trí của nhóm sulfate cùng với trật tự giữa các gốc đường trong phân tử fucoidan Dựa trên kỹ thuật MS, Anastyuk và các cộng sự tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Liên bang Nga đã phát hiện thêm ba loại cấu trúc fucoidan mới từ các loài rong biển.
Nghiên cứu của Usov và cộng sự tại Viện Hóa Hữu cơ Liên bang Nga đã sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều kết hợp với biến đổi hóa học để xác định cấu trúc chi tiết của bốn loại fucoidan từ các loài rong nâu, bao gồm Laminaria saccharina, Fucus evanescen, Fucus serratus và Fucus distichus Các loài này bao gồm Costaria costata, Laminaria cichorioides và Coccophora langsdorfii.
Trong một thập kỷ trở lại đây, đã có các công bố đưa ra cấu trúc của phân đoạn Fucoidan dạng fucogalactan sulfate từ một số loài rong như
Sargassum duplicatum và Padina boryana chứa Fucoidan, được nghiên cứu bởi Roza V Usoltseva cùng các cộng sự người Nga Cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum duplicatum được xác định với mạch chính gồm các đơn vị lặp lại {→4)-α-L-Fuc-(1→4)-β-D-Gal-1→}n Các nhóm sulfate chủ yếu nằm ở vị trí C2, C4, với sự hiện diện ít hơn ở vị trí C3 trên gốc đường fucose.
Cấu trúc fucoidan từ rong Padina boryana bao gồm các gốc 1,4-α-L-fucopyranose và 1,3-β-D-Galactopyranose, cùng với các nhóm sulfate gắn tại các vị trí C2, C3 và C4 trên cả hai gốc đường fucose và galactose.
Tình hình nghiên cứu fucoidan ở Việt Nam
Fucoidan, một polysaccharide có nguồn gốc từ rong nâu, chỉ mới được nghiên cứu trong hơn 10 năm qua bởi các nhà khoa học tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Dù Việt Nam sở hữu nguồn tài nguyên rong nâu phong phú, nhưng các nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của fucoidan vẫn còn hạn chế.
Năm 2006, Phân viện Khoa học Vật liệu tại Nha Trang đã tiên phong trong việc phát triển quy trình công nghệ chiết xuất và phân lập fucoidan từ rong nâu Việt Nam Quy trình này sử dụng công nghệ màng siêu lọc, cho phép cô đặc và loại bỏ tạp chất khỏi dung dịch fucoidan ở nhiệt độ phòng, giữ nguyên hoạt tính sinh học tự nhiên của sản phẩm.
Nghiên cứu về fucoidan từ rong nâu Việt Nam chủ yếu tập trung vào cấu trúc và thành phần hóa học, đặc biệt là các nhóm đường và vị trí nhóm sulfate Năm 2008, nghiên cứu sinh Nguyễn Duy Nhứt đã công bố về phân đoạn fucoidan F20 chiết xuất từ rong Sargassum swartzii, cho thấy fucose chiếm tỷ lệ lớn (> 45%), cùng với các đường đơn khác như rhamnose, mannose và galactose với hàm lượng đáng kể (10,81 - 22,07%) Nghiên cứu cũng chỉ ra trình tự liên kết giữa các gốc đường hexose, uronic acid và fucose, với nhóm sulfate chủ yếu ở vị trí C4 trong phân đoạn F20.
Thành Thị Thu Thủy và cộng sự đã nghiên cứu và công bố rằng fucoidan từ rong Turbina ornata có hàm lượng sulfate cao, với thành phần đường chủ yếu là fucose và galactose theo tỉ lệ 3:1, tạo thành dạng galactofucan sulfate hóa Cấu trúc của chúng gồm các gốc α-L-Fucp liên kết 3, với sulfate chủ yếu ở vị trí C2 và một phần ở vị trí C4 Fucoidan trong rong nâu Việt Nam chiếm từ 0,5-2,7% khối lượng khô, thuộc nhóm galactofucan sulfate Nghiên cứu cho thấy fucoidan chiết xuất từ 5 loài rong như S polycystum, S microcystum, S swatzii, S denticarpum và Turbinaria ornata có hoạt tính chống ung thư gan và ung thư màng tim, trong khi fucoidan từ rong S mcclurei thể hiện hoạt tính chống ung thư vú Tất cả 6 loại fucoidan này đều có khả năng chống oxy hóa và kháng lại vi khuẩn P Aeruginosa.
S.polycystum và Turbinaria ornata có hoạt tính cao nhất Sử dụng các phương pháp phân tích hóa học, GLC, IR, NMR và ESI-MS nhóm tác giả đã bước đầu đưa ra được đặc điểm cấu trúc của các phân đoạn fucoidan từ loài rong
S.polycystum; S.swartzii và Turbina ornata [51].
Vị trí nhóm sulfate trong fucoidan chiết từ 03 loài rong thuộc chi rong
Sargassum và rong Turbina ornata có cấu trúc hóa học đặc biệt với vị trí C4 của vòng pyranose và chỉ một phần H4 bị sulfate hóa Nhóm sulfate tại vị trí C4 của hai monome fucose và galactose liên quan đến fucoidan từ rong Turbina ornata Liên kết glycoside chính trong mạch là (1→3) và có thể có nhánh Tuy nhiên, các cấu trúc hiện tại vẫn chỉ là dự đoán, và vẫn còn nhiều vấn đề cần giải quyết, đặc biệt là dữ liệu phổ về các kiểu liên kết và chuỗi oligosaccharide trong mạch chính và nhánh của fucoidan.
Năm 2013, các tác giả Bùi Minh Lý, Thành Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Usov và cộng sự đã tìm ra được cấu trúc của fucoidan từ
Hình 1 7 Cấu trúc của fucoidan từ Sargassum polycystum
Phạm Đức Thịnh và cộng sự đã chiết xuất fucoidan từ năm loài rong biển: S denticapum, S polycystum, S swartzii, S mcclurei và Turbina ornata, đồng thời nghiên cứu cấu trúc của các phân đoạn fucoidan đại diện cho từng loài Tất cả fucoidan thu được đều thuộc loại fucogalactan sulfate, với liên kết chính trong mạch là 1-3 Đặc biệt, đây là lần đầu tiên phát hiện sự hiện diện đồng thời của các gốc →3)-α-L-Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ rong biển.
Trong luận án của Hồ Đức Cường, fucoidan chiết từ rong nâu
Fucoidan từ Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii có thành phần chính là fucose và glucose, với cấu trúc hóa học đặc trưng gồm mạch chính từ α-(1→3)-L-fucose và sulfate hóa ở các vị trí C2, C4 và một phần C3 Glucose cũng bị sulfate hóa tại vị trí C4 và liên kết với mạch chính qua glycoside (1-4) Nghiên cứu của Hồ Đức Cường cho thấy fucoidan này có hoạt tính sinh học in vivo và in vitro, thể hiện tính độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư nhưng không có hoạt tính kháng vi sinh vật Ở liều 100mg/kgP/ngày, fucoidan giúp giảm một số chỉ tiêu sinh hóa mỡ máu và khối lượng mỡ trên chuột béo phì Năm 2017, Bùi Văn Nguyên đã chiết xuất và xác định cấu trúc fucoidan từ 6 loài rong nâu tại Nha Trang, trong đó nổi bật là fucoidan từ Sargassum duplicatum và Sargassum binderi.
Nghiên cứu sử dụng phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS đã chỉ ra rằng phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một galactofucan, bao gồm hai loại đường: (1→3)-α-L-Fuc có nhóm sulfate tại vị trí C2 và β-D-galactose có nhóm sulfate tại vị trí C6 Galactose kết nối với fucose thông qua liên kết glucoside 1→4, và cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề xuất như trên.
Hình 1 8 Mảnh cấu trúc cơ bản fucoidan chiết từ rong
Turbinaria decurrens Bảng 1 4 Hàm lượng, thành phần hóa học và khối lượng phân tử trung bình của các mẫu fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam [20].
Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã nghiên cứu hình dáng và kích thước của các mẫu fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ Phân tích đồ thị Kratky cho thấy các mẫu fucoidan có hình dáng kiểu que với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau Các mô hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài lên đến 5 gốc đường.
Tác giả Bùi Văn Nguyên đã nghiên cứu hoạt tính gây độc tế bào của fucoidan trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD Kết quả cho thấy tất cả các mẫu α đều có hoạt tính, trong đó hai mẫu Fto và Fsp thể hiện hoạt tính cao nhất với IC50 lần lượt đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 àg/mL cho Fto, và 5,5 và 5,7 àg/mL cho Fsp.
Bảng 1 5 Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD[20].
Năm 2017, nhóm nghiên cứu do Bilan dẫn đầu đã công bố cấu trúc của fucoidan từ Sargassum aquifolium thu hoạch tại Việt Nam Bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp với phổ NMR, nhóm đã xác định được ba polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sulfate deS-2, deS-4, và deS-6 Ngoài ra, họ cũng sử dụng phương pháp đo phổ NMR và HSQC để chứng minh rằng fucoidan từ rong Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate với cấu trúc phức tạp, bao gồm các thành phần chính như fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, với mức độ phân nhánh cao và bất thường Cấu trúc này chứa các gốc đường mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic acid và một lượng lớn nhóm sulfate gắn tại các vị trí khác nhau.
Hình 1 9 Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium