Xác định một số thành phần hóa học trong sữa tươi tiệt trùng

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu đã giúp phát triển phương pháp xác định các chỉ tiêu trong sản phẩm sữa tươi tiệt trùng, phù hợp với điều kiện của phòng thí nghiệm hiện tại.

Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong sữa tiệt trùng cho phép đánh giá chất lượng sản phẩm, đảm bảo đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của con người.

Nhiệm vụ đồ án

 Xác định độ acid tổng số của sữa tiệt trùng

 Xác định hàm lƣợng khoáng tổng số

 Xác định hàm lƣợng Canxi

 Xác định hàm lượng chất béo trong sữa theo phương pháp Adam-Rose- Gottlieb

 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Betrand

 Định lƣợng axit ascorbic (Vitamin C)

 Xác định axit amin trong sữa bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC).

Đối tƣợng nghiên cứu

Sữa tươi tiệt trùng TH True Milk Sữa tươi tiệt trùng Cô gái Hà Lan

Sữa tươi tiệt trùng Vinamilk Sữa tươi tiệt trùng Mộc Châu

TỔNG QUAN VỀ SỮA

Khái niệm sữa

Sữa là chất lỏng được tiết ra từ tuyến vú của động vật, cung cấp nguồn dinh dưỡng thiết yếu cho sự phát triển của động vật non Với thành phần dinh dưỡng phong phú và khả năng đồng hóa cao, sữa đã trở thành thực phẩm bổ dưỡng, đặc biệt quan trọng cho trẻ sơ sinh.

Sữa chứa nhiều thành phần dinh dưỡng quan trọng như lipit, gluxit, protein, chất khoáng, vitamin, và các chất khác Trong số này, chất khô của sữa, chiếm khoảng 10-20% tùy loại, bao gồm tất cả các thành phần không phải nước và chất bay hơi Hàm lượng chất khô càng cao thì giá trị dinh dưỡng của sữa càng lớn Nếu không tính lipit, chất khô trong sữa được gọi là chất khô không béo.

Tình hình phát triển ngành sữa việt nam

Việt Nam đang trải qua giai đoạn tăng trưởng kinh tế mạnh mẽ, với tốc độ phát triển nhanh chóng, dẫn đến sự cải thiện rõ rệt về thu nhập và mức sống của người dân Trước đây, thành ngữ “ăn no mặc ấm” phản ánh ước mơ của nhiều người, nhưng hiện nay, khi đất nước đã gia nhập WTO, ước mơ đã chuyển thành “ăn ngon mặc đẹp”.

Sữa và các sản phẩm từ sữa đã trở nên phổ biến hơn tại Việt Nam, từ chỉ 1-2 nhà sản xuất vào những năm 90, hiện nay đã có gần 20 hãng nội địa cùng nhiều doanh nghiệp phân phối, phục vụ cho thị trường 80 triệu dân Tổng lượng tiêu thụ sữa tại Việt Nam liên tục tăng trưởng mạnh mẽ, từ 15-20% mỗi năm, và dự báo sẽ tăng gấp đôi vào năm 2010 và tiếp tục tăng gấp đôi vào năm 2020.

Mức tiêu thụ sữa trung bình của Việt Nam hiện nay đạt khoảng 7,8 kg/người/năm, gấp 12 lần so với đầu thập niên 90 Dự báo trong thời gian tới, mức tiêu thụ sữa sẽ tăng từ 15-20% nhờ vào sự gia tăng thu nhập bình quân Sữa được xem là sản phẩm dinh dưỡng bổ sung quan trọng ngoài các bữa ăn hàng ngày, đặc biệt đối với trẻ em, thanh thiếu niên và người trung tuổi, giúp hỗ trợ sức khỏe hiệu quả Mặc dù thị trường hiện có nhiều loại bột ngũ cốc và đồ uống tăng cường sức khỏe, nhưng chất lượng và giá trị dinh dưỡng của chúng không thể hoàn toàn thay thế sữa.

Việt Nam, một quốc gia nông nghiệp, đã chứng kiến sự phát triển mạnh mẽ của ngành chăn nuôi bò sữa trong vài thập kỷ qua Qua nhiều dự án, bò sữa đã trở nên phổ biến và đóng góp quan trọng cho sản xuất Theo chiến lược phát triển chăn nuôi của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, mục tiêu đến năm 2020 là tăng số lượng bò sữa từ 104.000 con năm 2005 lên 200.000 con vào năm 2010, đồng thời sản lượng sữa cũng dự kiến tăng từ 200.000 tấn lên 377.000 tấn.

Đến cuối năm 2006, nguồn cung nguyên liệu đầu vào trong nước chỉ đạt khoảng 20%, và nhiều dự án nuôi bò đã thất bại, dẫn đến tình trạng khan hiếm nguyên liệu Hai trung tâm nghiên cứu và nuôi bò quy mô lớn cũng không đủ để cải thiện tình hình này.

Khu vực Ba Vì – Hà Tây, Mộc Châu – Sơn La và các trung tâm nuôi bò sữa xung quanh TP HCM hiện đang phụ thuộc vào 80% nguyên liệu sữa nhập khẩu từ các quốc gia như Úc, New Zealand, Mỹ và Ấn Độ, chủ yếu là sữa bột Một trong những nguyên nhân chính dẫn đến sự thất bại của các dự án bò sữa tại Việt Nam là giá thu mua sữa của các nhà máy luôn thấp hơn giá thị trường thế giới Khi các dự án không thành công, giá thu mua nguyên liệu lại tăng gấp đôi trong thời gian ngắn.

Tính chất vật lý và hóa lý của sữa

Sữa là một chất lỏng màu trắng đục, có độ nhớt gấp hai lần nước, với vị ngọt nhẹ và mùi hương không quá mạnh Những đặc điểm này làm cho sữa trở thành một thức uống phổ biến và bổ dưỡng.

Độ acid của sữa được xác định bằng số ml dung dịch NaOH hoặc KOH nồng độ 0.1N cần thiết để trung hòa lượng acid có trong 100ml sữa tươi, sử dụng chất chỉ thị phenolphthalein Đơn vị đo độ acid của sữa được ký hiệu là o T.

Độ acid của sữa tươi mới vắt thường nằm trong khoảng 16-18 o T, nhưng có thể có loại sữa có độ acid thấp hơn 16 o T hoặc cao hơn 18 o T Sau khi vắt, vi khuẩn lactic trong sữa phát triển, dẫn đến sự gia tăng lượng acid lactic và độ acid của sữa cũng tăng dần theo thời gian Trong quá trình bảo quản và vận chuyển, đặc biệt là trong điều kiện khí hậu nóng ẩm của Việt Nam, độ acid của sữa có thể tăng lên tới 20-25 o T hoặc thậm chí cao hơn.

Sữa tươi dùng để uống trực tiếp có độ acid không vượt quá 20 o T, trong khi sữa tươi chế biến các sản phẩm khác có thể có độ acid cao hơn, tối đa từ 23-25 o T.

Độ acid của sữa không chỉ được tính theo độ T mà còn dựa vào lượng acid lactic có trong 100ml sữa tươi Để chuyển đổi từ độ acid theo độ T sang độ acid tính theo lượng acid lactic, ta sử dụng công thức: Độ acid = T x 0.009(%).

1.3.2.2 Tính oxy hóa của sữa

Sữa chứa nhiều chất có khả năng oxy hóa nhƣ ascobic acid, riboflavin, và các enzyme…

Khối lượng riêng của sữa, nằm trong khoảng từ 1,027 đến 1,032, phụ thuộc vào các thành phần tan trong sữa và có sự biến đổi theo giống và thời kỳ cho sữa, trong đó sữa đầu có khối lượng riêng lớn hơn so với sữa thường.

1.3.2.4 Áp suất thẩm thấu và nhiệt độ đóng băng Ở 0 o C áp suất thẩm thấu của sữa thường là 6,6 atm Áp suất thẩm thấu của sữa đƣợc tạo bỡi chất phân tán cao nhƣ lactose, muối

Sữa đóng băng ở nhiệt độ -0,55 o C

Trong điều kiện bình thường sữa mới vắt vi sinh vật không thể phát triển được mà có thể bị tiêu diệt vì trong sữa có kháng thể

Fa 3 kháng thể có tính chất diệt khuẩn, và hiệu quả của nó phụ thuộc vào nhiệt độ bảo quản Mối liên hệ giữa nhiệt độ bảo quản và Fa 3 kháng thể được thể hiện rõ qua bảng dữ liệu.

Bảng 1.3 mối liên quan giữa nhiệt độ bảo quản và Fa 3 kháng thể

Nhiệt độ bảo quản ( o C) Fa 3 kháng thể (giờ)

Thành phần hóa học của sữa

Thành phần hóa học của sữa từ các loài động vật khác nhau có sự biến đổi đáng kể, phụ thuộc vào nhiều yếu tố như thời kỳ tiết sữa, chế độ ăn uống, phương pháp vắt sữa, điều kiện chăn nuôi, sức khỏe, tuổi tác, kích thước và giống loài Việc phân tích thành phần hóa học của sữa rất quan trọng, đặc biệt khi nó được sử dụng làm thực phẩm.

Bảng 1.4 Thành phần hóa học của một số loại sữa

Tổng chất khô (%) Béo (%) Protein (%) Casein (%) Lactose (%)

Nước tự do chiếm 96-97% tổng lượng nước trong sản phẩm và có thể được tách ra trong quá trình cô đặc hoặc sấy do không có liên kết hóa học với chất khô Chẳng hạn, trong bơ pho mát tươi, nước tự do tồn tại dưới dạng các hạt kích thước khác nhau, phân bố tương đối đồng đều trong sản phẩm.

Nước tự do có thể bay hơi hoặc ngưng tụ trên bề mặt trong quá trình bảo quản, dẫn đến việc sữa bột bị vón cục do sự xâm nhập của nước này.

Nước liên kết chiếm khoảng 3-4% trong hệ keo, và hàm lượng này phụ thuộc vào các thành phần như protein, phosphatit và polysacarit Nước liên kết thường gắn với các nhóm chức như -NH2, -COOH, -OH, =NH và -CO-NH-.

Hàm lượng nước liên kết trong các sản phẩm sữa có sự khác biệt rõ rệt; chẳng hạn, sữa gầy chứa từ 2,13-2,59% nước liên kết, trong khi sữa đầu có 4,15% và nước tách ra trong quá trình sản xuất bơ chỉ chiếm 1,75% nước liên kết.

- Nước liên kết đóng băng ở nhiệt độ nhỏ hơn 0 o C, không hòa tan muối, đường Dạng đặc biệt của nước liên kết là nước kết tinh với lactoza dưới dạng

- Trừ nước ra, chất khô của sữa bao gồm tất cả các thành phần của sữa

Có thể xác định chất khô của sữa bằng cách sấy đến trọng lƣợng không đổi hoặc bằng công thức tính toán

- Có nhiều cách tính toán hàm lƣợng chất khô của sữa một cách khá chính xác bằng các công thức kinh nghiệm

Ví dụ công thức của Richmond (Anh):

Hoặc công thức đƣợc sử dụng rộng rãi ở Mỹ:

Trong đó: S- hàm lƣợng chất khô của sữa tính bằng (%);

F- hàm lƣợng chất béo của sữa (%); a- tỷ trọng của sữa theo độ lactometer

Ví dụ: tỷ trọng của sữa đo đƣợc theo tỷ trọng kế lactometer là 1,026 g/ml thì a= 26

Chất béo là thành phần quan trọng trong sữa, với hàm lượng thay đổi từ 3g đến 6g trong 100ml Sữa bò có hàm lượng béo khoảng 3.9%, và chất béo tồn tại dưới dạng hạt hình cầu nhỏ, kích thước phụ thuộc vào nhiều yếu tố như giống loài và thời gian tiết sữa Hạt chất béo lớn dễ tách ra hơn hạt nhỏ, và khi để yên, chúng sẽ nổi lên tạo thành lớp váng sữa Trong chất béo sữa có khoảng 20 loại acid béo, trong đó 2/3 là acid béo no và 1/3 là acid béo chưa no, với một số acid béo dễ hòa tan trong nước như acid caproic Chất béo sữa dễ bị phân hủy qua các quá trình như thủy phân và oxy hóa, dẫn đến giảm chất lượng và có thể làm hỏng sữa.

Sữa không chỉ chứa chất béo thuộc nhóm lipit mà còn có photphatit và một số chất khác, mặc dù hàm lượng không nhiều Cụ thể, trong một lít sữa có khoảng 0.5-0.7g photphatit, chủ yếu là lexithin.

Sữa chứa một nhóm hợp chất hữu cơ quan trọng nhất là protein, với hàm lượng protein thường dao động từ 3.0-4.6% Đặc biệt, sữa bò có hàm lượng protein khoảng 3.3-3.5% Các protein trong sữa được coi là hoàn thiện, bao gồm 19 loại axit amin khác nhau, trong đó có đầy đủ các axit amin thiết yếu như valin, lecithin, izolecithin, metionin, treonin, phenylalanin, triptophan và lyzin.

Sữa chứa ba loại protein chính: Casein chiếm khoảng 80%, lactalbumin chiếm 12% và lactoglobulin chiếm 6% Ngoài ra, còn có một số loại protein khác nhưng với hàm lượng không đáng kể.

Casein là nhóm protein chủ yếu trong sữa, bao gồm nhiều loại khác nhau như α-casein, β-casein và κ-casein Trong đó, β-casein là thành phần chính trong sữa bò nhưng lại là thứ yếu trong sữa người κ-casein, một glycoprotein, có mặt trong toàn bộ micelle casein, giúp duy trì trạng thái ổn định của micelle Cả α-casein và β-casein đều không tan trong sữa tươi, và chúng chứa nhóm phosphate, trong đó photpho chiếm khoảng 0.8% tổng lượng casein, kết hợp với ion Ca²⁺.

Sự trung hòa điện tích âm đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa α casein và β casein kết khối và kết tủa Sự ổn định của hai phân tử casein trong sữa nhờ vào sự hiện diện của ﻻ casein, mà không tồn tại tự do mà ở dạng các hạt micelle có kích thước từ 0.003 đến 0.3 µm Mỗi hạt micelle chứa hàng ngàn phân tử α casein và β casein, với hiệu quả bảo vệ của ﻻ casein góp phần gia tăng điện tích âm mà không kết hợp với ion Ca²⁺ Thành phần của mỗi hạt casein bao gồm khoảng 70% nước và 30% chất khô, trong đó casein chiếm khoảng 93% và muối, chủ yếu là canxi photphat, chiếm khoảng 7%.

Globulin sữa, hay còn gọi là lactoglobulin, chiếm khoảng 0,1% khối lượng sữa và 3% tổng lượng protein trong sữa Loại protein này chủ yếu có mặt trong sữa non, thuộc nhóm protein đơn giản và hoàn chỉnh Trong sữa, globulin tồn tại dưới dạng keo với độ phân tán kém hơn so với albumin sữa, khoảng 18.000 Globulin có ba dạng đồng phân chính: β-lactoglobulin, epglobulin và pseudoglobulin, mỗi loại có tính chất hòa tan khác nhau Cụ thể, β-lactoglobulin không tan trong nước nhưng hòa tan tốt trong dung dịch muối loãng, epglobulin tan trong nước khi có muối, trong khi pseudoglobulin hòa tan trong nước nguyên chất.

Còn gọi là albumin của sữa Hàm lƣợng lactoalbumin trong sữa không nhiều khoảng 0.5-1.0% tùy từng loại sữa Trong sữa non có nhiều lactoalbumin hơn sữa thường

Khác với casein, lactoalbumin trong sữa tồn tại dưới dạng hòa tan Khi chịu tác động của nhiệt độ cao, lactoalbumin sẽ bị đông tụ, và quá trình này diễn ra nhanh chóng trong môi trường acid khi nhiệt độ tăng Các enzym làm đông tụ casein không có khả năng làm đông tụ lactoalbumin Sau khi đông tụ, lactoalbumin không thể hòa tan lại trong nước mà chỉ có thể hòa tan trong một số dung môi nhất định.

Gluxit có ở trong sữa chủ yếu là lactose Hàm lƣợng lactose trong sữa khoảng 4.5-5.1% tùy theo từng loại sữa Đối với sữa bò hàm lƣợng này khoảng 4.9%

Lactose có mặt trong sữa dưới dạng hòa tan và khó bị thủy phân hơn so với các loại đường khác Khi lactose được thủy phân, nó sẽ tạo ra một phân tử glucose và một phân tử galactose.

Lactose, khi ở nhiệt độ cao, có khả năng chuyển hóa thành caramen, dẫn đến màu sắc sữa sau khi khử trùng thường sẫm hơn so với trước Ngoài ra, lactose có thể kết hợp với các nhóm amin của protein sữa (casein) để tạo thành hợp chất melanoidin có màu tối Dưới tác động của vi khuẩn lactic, lactose được lên men thành acid lactic, một quá trình gọi là lên men lactic Vi khuẩn propionic có thể chuyển hóa acid lactic thành acid propionic, acid acetic và khí cacbonic, tạo nền tảng cho việc chế biến một số loại phô mai Lên men lactic được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất các sản phẩm chế biến từ sữa như sữa chua và phô mai.

Giới thiệu về hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

HPLC là viết tắc của 4 chữ cái đầu bằng tiếng anh của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (high performance liquid chromatography)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp tách chất dựa trên pha động là chất lỏng và pha tĩnh là chất rắn hoặc chất lỏng phủ lên chất mang rắn, với cơ chế hoạt động dựa trên hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc phân loại theo kích cỡ HPLC là phương pháp phổ biến nhất để xác định axit amin, trong đó axit amin sau khi thủy phân sẽ được dẫn xuất để tạo sản phẩm phát huỳnh quang Các dẫn xuất này được tách biệt thông qua hệ thống HPLC, với phát hiện và định lượng bằng detector UV và detector huỳnh quang Ưu điểm của HPLC bao gồm tốc độ tách nhanh, độ phân giải tốt, độ nhạy cao, và khả năng phân tích đồng thời nhiều chất Đặc biệt, trong phân tích axit amin, HPLC có những lợi thế riêng như quá trình tách và xác định diễn ra trong hệ thống kín, sử dụng dung môi đệm, và thủy phân mẫu bằng axit vô cơ tiết kiệm chi phí.

Lipase, phospholipase ưu điểm trên mà nhiều tác giả cho rằng phương pháp HPLC là phương pháp tốt nhất để tách và phân tích axit amin

1.5.2 Nguyên tắc của quá trình sắc ký trong cột

Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất và loại sắc ký, bao gồm sắc ký hấp phụ, sắc ký trao đổi ion, sắc ký phân bố và sắc ký Gel Để tách các chất phân tích như A, B, C ra khỏi cột, cần có một pha động kết hợp với pha tĩnh Hiệu quả của quá trình tách sắc ký phụ thuộc vào tổng hợp các tương tác F1, F2 và F3.

Tổng ba tương tác F1, F2 và F3 quyết định thứ tự rửa trôi các chất ra khỏi cột, với F1 là lực giữ chất phân tích và F2 là lực kéo của pha động F1 và F2 đóng vai trò quan trọng trong sự lưu giữ, trong khi F3 có ảnh hưởng không lớn Do đó, các chất khác nhau sẽ có giá trị F1 và F2 khác nhau, dẫn đến việc chúng di chuyển và tách ra khỏi nhau với tốc độ khác nhau khi ra khỏi cột.

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người ta chia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Hiện nay, sắc ký hấp phụ chủ yếu được ứng dụng trong phân tích mẫu, với quá trình này dựa vào sự khác biệt trong khả năng hấp phụ của pha tĩnh đối với các chất tan và quá trình rửa giải của pha động để tách chất tan ra khỏi cột Sự tách biệt của hỗn hợp phụ thuộc vào tính chất động học của chất hấp phụ, và trong phương pháp này có hai kiểu hấp phụ chính.

- Sắc ký hấp phụ pha thuận (NP-HPLC): Pha tĩnh phân cực, pha động không phân cực

- Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP-HPLC): Pha tĩnh không phân cực, pha động phân cực

Sắc ký hấp phụ pha đảo (RP) là phương pháp phổ biến và hiệu quả trong việc tách các hỗn hợp chất có tính chất tương tự, bao gồm các vitamin và thuốc hạ nhiệt giảm đau Phương pháp này được áp dụng rộng rãi cho các chất không phân cực, phân cực yếu hoặc trung bình.

1.5.4 Cấu tạo của hệ thống HPLC

Thiết bị HPLC có thể hình dung gồm 3 phần chính:

 Phần đầu vào cấp pha động có thành phần mong muốn và mẫu phân tích

 Phần tách: phần trung gian của hệ sắc ký, gốm cột tách, đôi khi có cột phụ trợ

Phần phát hiện và xử lý số liệu bao gồm các thiết bị phát hiện, hệ thống khuếch tán, máy tính và phần mềm xử lý dữ liệu, cùng với bộ phận ghi tín hiệu.

Hình 1.5.4 Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC

1 Bình chứa dung môi pha động

4 Bộ phận tiêm mẫu (bằng tay hay autosample)

5 Cột sắc ký (pha tĩnh) (để ngoài môi trường hay trong bộ điều nhiệt)

7 Hệ thống máy tính gắn phần mềm nhận tín hiệu và xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống HPLC

Máy HPLC hiện nay được trang bị 4 đường dung môi vào đầu bơm cao áp, cho phép sử dụng đồng thời 4 bình chứa dung môi Điều này giúp tối ưu hóa quá trình rửa giải theo tỷ lệ mong muốn, với tổng tỷ lệ dung môi của 4 đường đạt 100%.

Theo kinh nghiệm, chúng ta thường chỉ sử dụng tối đa 3 hoặc 2 đường dung môi cùng một lúc Việc này giúp hệ pha động luôn được pha trộn đồng nhất hơn và đơn giản hơn, từ đó làm cho quá trình rửa giải ổn định hơn.

Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải Gradial dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn

Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động

Bơm pha động có vai trò quan trọng trong quá trình chia tách sắc ký, yêu cầu tạo ra áp suất cao từ 3000 đến 6000 PSI (tương đương 250 đến 500 at), với khả năng duy trì dòng chảy liên tục Lưu lượng bơm thường dao động từ 0.1 đến 9.999 ml/phút, và hiện nay đã có nhiều loại bơm đạt áp suất lên đến 1200 bar.

Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 Bar Tốc độ dòng: 0.1-9.999 ml/phút

Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã đƣợc cài đặt Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục

 Bộ phận tiêm mẫu (injection)

Dùng để đƣa mẫu vào cột phân tích Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: Bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng tay) và tiêm mẫu tự động(Autosample)

Trên thị trường hiện có nhiều nhãn hiệu cột khác nhau, được phân loại theo mục đích sử dụng Trong đó, cột pha đảo RP C18 (ODS) và cột pha thường C8 là hai loại phổ biến, thường được áp dụng cho hầu hết các hợp chất thông thường Ngoài ra, còn có các loại cột chuyên dụng dành cho từng nhóm chất cụ thể.

Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10- 30cm, đường kính trong 1-10mm

Chất nhồi cột thường được sử dụng là Silicagel (pha thuận) hoặc Silicagel đã được Silan hóa, cũng như các loại hạt khác như nhôm Oxit, polyme xốp và chất trao đổi ion Đối với những phương pháp phân tích yêu cầu nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng, cột sẽ được đặt trong bộ phận điều nhiệt (Oven column).

Detector là thiết bị quan trọng trong sắc ký, giúp phát hiện và ghi nhận các chất khi chúng ra khỏi cột, từ đó hỗ trợ định tính và định lượng Việc lựa chọn loại Detector phù hợp phụ thuộc vào tính chất của các chất cần phân tích và phải đáp ứng yêu cầu trong một khoảng nồng độ nhất định của chất phân tích.

- A: là tín hiệu đo đƣợc

- C : Nồng độ chất phân tích

- K : là hằng số thực nghiệm của Detector đã chọn

Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất …

Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai Detector sau:

- Detector quang phổ tử ngoại 200 - 380 nm để phát hiện UV

- Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV - VIS): 190 - 900 nm để phát hiện các chất hấp thụ quang và đây là loại thông dụng nhất

Detector huỳnh quang có khả năng phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên và các dẫn chất huỳnh quang, đồng thời sở hữu độ chọn lọc cao nhất trong các loại detector hiện có.

Detector Diod Array và ELSD (Detector tán xạ bay hơi) là những công nghệ hiện đại, cho phép quét chồng phổ để định tính các chất dựa trên độ hấp thu cực đại của chúng.

Ngoài ra còn có một số loại Detector khác là:

- Detector điện hóa: Đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lƣợng…

- Detector chiết suất vi sai: Detector khúc xạ (thông thường dùng cho đo các chất đường)

- Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt…

 Bộ phận ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát hiện do Detector truyền sang

Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của Peak, chiều cao…

Các máy thế hệ mới sử dụng phần mềm trên máy tính để lưu trữ tất cả các thông số của Peak, bao gồm tính đối xứng và hệ số phân giải Trong quá trình phân tích, phần mềm này còn có khả năng xử lý và tính toán các thông số theo yêu cầu của người dùng, như nồng độ và RSD.

Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện

1.5.5 Chọn điều kiện sắc ký

Muốn có một kết quả tách tốt nhất ta phải tìm đƣợc các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết bị, dụng cụ

- Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Agilent 1100

- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g

- Lò nung, bếp điện, bếp cách thuỷ

- Các bình định mức: 2, 5, 10, 20, 50, 100 ml

- Bình tam giác 250ml, 100ml

- Đũa thuỷ tinh, ống nhỏ giọt

- Chén nung bằng sứ có nắp

Hóa chất, pha chế hóa chất

- Dung dịch NaOH 0,1N: cân 4,15g NaOH định mức lên 1 lít

- Dung dịch (NH 4 ) 2 C 2 O 4 10% pha trong nước cất

- Dung dịch NH 3 1%: rót vào ống đong 50 mL NH 3 đậm đặc , sau đó cho vào chai nhựa có sẵn 1.5 L nước cất

- Dung dịch H 2 SO 4 (1:1): rót từ từ 50 mL dung dịch H 2 SO 4 đậm đặc vào becher chứa sẵn 50 mL nước cất được ngâm trong thau nước

- Dung dịch KMnO 4 0.1 N: cân 3,16g KMnO 4 định mức lên 1 lít

- Dung dịch KMnO 4 0.02 N: rút 50.00 mL KMnO 4 0.1 N định mức lên 250 mL

- Dung dịch H 2 C 2 O 4 0.02 N: rút 10.00 mL H 2 C 2 O 4 0.1 N định mức lên 50 mL

- Dung dịch cồn-amoniac: trộn 208,5ml cồn 90 0 với 7,5ml amoniac, thêm nước cất đến 250ml

- PP 1%: cân 1g PP pha trong 70ml cồn với 30ml nước

- Dung dịch Kaliferoxianua K 4  Fe (CN ) 6  15%: Cân 15g K 4  Fe (CN ) 6  đinh mức lên 100ml

- Dung dịch Zn  CH 3 COO  2 30%: Cân 30g Zn  CH 3 COO  2 định mức lên 100ml

- Thuốc thử FelingI: Hòa tan 69,28 g CuSO 4 5H 2 O trong 1 lít nước, nếu không tan hết thì cho thêm một ít H 2 SO 4

Thuốc thử Feling II được chuẩn bị bằng cách hòa tan 346g Kali Natri tactrat trong 400-500ml nước cất và 100g NaOH trong 200-300ml nước cất Để sử dụng, lấy 10ml dung dịch Feling I và trộn với 10ml dung dịch Feling II.

- Dung dịch sắt(III) sunfat: Hòa tan 50g Fe 2 (SO 4 ) 3 , 20ml H 2 SO 4 đặc, định mức đến 1000ml bằng nước cất Hoặc hòa tan 86g  NH 4  2 SO 4 Fe 2 (SO 4 ) 3 24H 2 O với 108,7ml

H đậm đặc, thêm nước cất vừa đủ đến 1000ml

- Dung dịch tinh bột 5g/lít

- Dung dịch chuẩn: amino acid nồng độ 10pmol/μl, 25pmol/μl, 50pmol/μl, 100pmol/μl

- Chất tạo dẫn xuất: o-phthalaldehyd (OPA) và 3 – mercaptopropionic acid trong đệm borate

- Sodium acetate trihydrate CH 3 COONa

- Thuốc thử FMOC ( 9- fluorenylmethylchloro for mate in acetonitrile).

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xác định chỉ số Acid tổng số

Nguyên tắc xác định dựa vào phản ứng trung hoà:

Dùng dung dịch NaOH 0,1N để chuẩn độ hết lƣợng acid có trong mẫu với chỉ thị phenolphtalein

- Lấy 10ml sữa cho vào bình nón thêm vào bình nón 20ml nước cất và 3 giọt phenolphtalein, lắc đều

- Chuẩn độ dung dịch trong bình nón bằng NaOH 0,1N cho đến khi xuất hiện màu hồng bền trong 30 giây là dừng

2.3.1.3 Kết quả Độ acid của sữa tính bằng độ Thorner: Số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn 100ml sữa

2.3.2 Định lƣợng khoáng tổng số

Dựa vào khối lƣợng mẫu còn lại sau khi hoá tro trong lò nung

- Cân một khối lƣợng mẫu đã sấy khô tuyệt đối

- Cho mầu vào chén sứ và cho vào lò nung

- Tăng dần nhiệt độ lò nung lên đến 500-520 độ C, giữ trong thời gian 4-5 giờ, cho đến khi khối lƣợng không đổi

- Lấy mẫu ra, để nguội Sau đó cân mẫu + chén sứ sau khi nung

A: Khối lượng mẫu + chén sứ trước khi nung (g)

B: Khối lƣợng mẫu + chén sứ sau khi nung (g)

2.3.3 Xác định hàm lƣợng Canxi

Canxi là khoáng chất thiết yếu cho cơ thể, giúp duy trì sức khỏe, hỗ trợ trẻ em phát triển chiều cao và ngăn ngừa bệnh lý xương khớp ở người lớn Ngoài ra, canxi còn góp phần vào hoạt động cơ bắp, lưu thông máu, truyền tín hiệu cho tế bào thần kinh và điều tiết hormone Do đó, canxi luôn có mặt trong sữa dành cho cả trẻ em và người lớn, với hàm lượng canxi trong sữa là mối quan tâm hàng đầu của người tiêu dùng Việc xác định chính xác hàm lượng canxi là cần thiết, và có hai phương pháp chính để thực hiện điều này: phương pháp định lượng dưới dạng oxalate và phương pháp Complexon III Trong bài viết này, chúng tôi sẽ xác định hàm lượng canxi trong sữa thông qua phương pháp chuẩn độ oxy hóa khử với permanganat.

Mẫu sữa sau khi vô cơ hoá sẽ chuyển canxi thành ion Ca 2+, và ion này được tủa ở dạng canxi oxalate (CaC 2 O 4) Lượng kết tủa canxi oxalate có thể xác định bằng hai phương pháp: nung ở nhiệt độ cao để cân lượng CaO sinh ra, hoặc hoà tan kết tủa bằng acid H 2 SO 4 để giải phóng anion C 2 O 4 2- Cuối cùng, tiến hành chuẩn độ oxy hoá khử bằng phương pháp permanganat để xác định chính xác lượng canxi.

C 2 O 4 2- được giải phóng từ tủa, cho phép xác định chính xác hàm lượng canxi trong mẫu sữa ban đầu Quy trình xác định này bao gồm ba giai đoạn chính.

 Kết tủa đồng thể Ca 2+ dưới bằng (NH 4 ) 2 C 2 O 4

 Hoà tan kết tủa CaC 2 O 4 bằng H 2 SO 4

Chuẩn H 2 C 2 O 4 sinh ra bằng KMnO 4

Phương pháp xử lý mẫu khô được sử dụng để đốt cháy nền mẫu, chuyển canxi trong mẫu thành muối hòa tan Quy trình này bao gồm hai bước: than hóa mẫu trên bếp điện và tro hóa mẫu trong lò nung Thí nghiệm được thực hiện với bốn mẫu sữa, trong đó có hai mẫu trắng với 1 mL nước cất.

Để thực hiện quá trình than hóa mẫu, trước tiên cần chuẩn bị 6 chén sứ sạch và khô Cân chính xác khoảng 2 gram sữa cho vào 4 chén sứ, trong khi 2 chén sứ còn lại thêm 1 mL nước cất làm mẫu trắng Đặt tất cả chén sứ lên bếp điện và nung mẫu ở nhiệt độ vừa phải để tránh hiện tượng bốc khói mạnh, có thể làm mất mẫu hoặc gây nhiễm bẩn chéo Tăng dần nhiệt độ cho đến khi tất cả mẫu cháy thành than đen và không còn khói trắng.

Tro hoá mẫu được thực hiện bằng cách cho mẫu đã than hoá vào lò nung, gia nhiệt đến 350 độ C trong 1 giờ và duy trì nhiệt độ này thêm 1 giờ Sau đó, nhiệt độ sẽ được tăng dần để hoàn thành quá trình.

Để đạt được mẫu tro trắng hoàn toàn, cần nung ở 550 độ C trong 1 giờ và giữ nhiệt độ này trong 2 giờ Tro thu được trong chén sứ thường có màu trắng hoặc hơi xám Sau đó, lấy mẫu ra, thêm 1 mL HNO3 đặc, đun nhẹ đến khô và tiếp tục đun trong 2 giờ.

Sau khi quá trình tro hoá hoàn tất, để chén nguội hoàn toàn, thêm 1 mL nước cất để thấm ướt mẫu, sau đó cho thêm 3 mL HCl (1:1) và đun nhẹ để hòa tan hoàn toàn lượng mẫu tro trắng Cuối cùng, chuyển dung dịch vào bình định mức 50 mL, rửa kỹ chén sứ vài lần và định mức đến vạch.

- Kết tủa canxi oxalate: lấy chính xác 20.00 mL từ bình định mức cho vào becher

Thêm 2 giọt methyl đỏ vào 100 mL dung dịch, sau đó nhỏ từng giọt NH3 loãng và khuấy nhẹ cho đến khi dung dịch chuyển sang màu vàng cam Nếu dung dịch có màu vàng, sử dụng HCl loãng để điều chỉnh đến khi xuất hiện màu vàng cam Đặt becher lên bếp cách thuỷ, thêm từ từ 10 mL dung dịch (NH4)2C2O4 10%, khuấy đều và tiến hành kết tủa trong bể cách thuỷ trong 2 giờ Tủa thu được sẽ có màu trắng và kích thước nhỏ Cần thêm nước cất vào becher để tránh hiện tượng dung dịch cạn, gây ra tinh thể hình kim ammonium oxalate.

Lọc và rửa tủa canxi oxalate bằng cách sử dụng phễu kết hợp với rút áp suất kém Đầu tiên, đổ từ từ dung dịch trong becher xuống phễu, sau đó dùng NH3 để tráng rửa becher và chuyển mẫu vào phễu Tiếp tục xịt rửa tủa nhiều lần cho đến khi không còn ion C2O4 2- trong mẫu.

Để hòa tan kết tủa canxi oxalate và thực hiện chuẩn độ, chuyển phễu sang bình rút chân không sạch khác Sử dụng ống nhỏ giọt để thêm 7 mL dung dịch H2SO4 (1:1) nóng vào cốc nhằm hòa tan kết tủa CaC2O4, để trong 2-3 phút và lặp lại với vài mL H2SO4 (1:1) Cẩn thận tráng đều phễu G4 bằng nước cất và tiến hành chuẩn độ bằng KMnO4 0.02 N cho đến khi màu hồng xuất hiện bền vững trong 30 giây.

Hàm lƣợng canxi trong sữa đƣợc tính theo công thức:

) ( dm Ca oxalate mt m KMnO

N : nồng độ đương lượng KMnO 4 0.02 N (17,778.10  3 )

Vm : thể tích KMnO 4 0.02 N dùng để chuẩn độ mẫu phân tích

V mt : thể tích KMnO 4 0.02 N dùng để chuẩn độ mẫu phân trắng oxalate

V : thể tích dùng để kết tủa oxalate (20ml)

V dm : thể tích định mức (50ml)

2.3.4 Xác định hàm lượng chất béo theo phương pháp Adam-Rose-Gottlieb

2.3.4.1 Tiến hành a) Chuẩn bị mẫu:

Để tiến hành chiết xuất, cho vào phiễu chiết 1ml sữa, sau đó hòa tan mẫu bằng 10ml nước cất Tiếp theo, thêm 1ml cồn-amoniac, 3ml ete và 2 giọt PP Bắt đầu lắc nhẹ nhàng, sau đó tăng dần cường độ lắc cho đến khi lắc mạnh.

Sau khi để yên 30 phút trong phiễu chiết, hỗn hợp sẽ phân tầng thành hai lớp: lớp dưới chứa amoniac hòa tan protein, nước và các thành phần khác của thực phẩm, trong khi lớp trên là ete hòa tan chất béo, nước và một số chất khác.

- Tách bỏ lớp dưới, lấy lớp trên Thực hiện thao tác tách lipit sang dung môi ete 2 lần Gom toàn bộ lƣợng ete chứa lipit lại b) Xác định lipit:

Thêm 2ml ete dầu hỏa vào phần dưới và lắc mạnh trong 5 phút, sau đó để yên trong 15 phút Các chất không phải chất béo sẽ lắng xuống dưới, trong khi các chất béo sẽ nổi lên phía trên Cuối cùng, chiết thu phần chất lỏng ở trên.

Chuyển ete chứa chất béo vào cốc đã được sấy khô và cân trước đến khi đạt khối lượng không đổi Tiến hành tráng phiễu chiết hai lần với 2ml ete mỗi lần, sau đó dồn toàn bộ ete vào cốc.

- Để bốc hơi ở nhiệt độ thường, sau đó cho vào sấy, sấy ở 100 đến 105 0 C trong 30 phút Lấy ra để nguội trong bình hút ẩm Cân và tính kết quả

A: Khối lƣợng mẫu + chén sứ (g)

B: Khối lƣợng mẫu + chén sứ sau khi sấy (g)

2.3.5 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp Betrand

2.3.5.1 Tiến hành a) Chuẩn bị mẫu:

- Hút 10ml mẫu, cho vào 30ml nước cất nóng 70-80 0 C để hòa tan mẫu, chuyển toàn bộ dịch vào bình hình nón 100ml

- Đun cách thủy ở 80 0 C trong 15 phút, thỉnh thoảng lắc đều trong khi đun Để nguội đến nhiệt độ phòng

- Khử tạp chất: cho vào 5ml Kaliferoxianua 15%, lắc đều, để yên trong 2-3 phút Cho thêm 5ml Zn  CH 3 COO  2 30%, lắc mạnh

- Tiến hành lọc kết tủa bằng giấy lọc băng vàng, rửa kết tủa bằng nước nóng cho sạch