Nhiệm vụ của đồ án
Trong khóa luận này tôi có các nhiệm vụ sau :
- Nghiên cứu tổng quan về chất màu, giá trị và thành phần, cấu tạo của chất màu chlorophyll
- Nghiên cứu các tính chất vật lý, hóa học và các phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll
- Tách chiết chất màu với các dung môi tương ứng : methanol,ethanol, axeton và lựa chọn dung môi thích hợp để tách chiết
- Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết chất màu chlorophyll
- Tối ưu các điều kiện trong quá trình tách chiết bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm để thu được chất màu chlorophyll lớn nhất trong lá chè xanh
Luận văn này nhằm bổ sung và hoàn thiện dữ liệu của bảng thành phần thực phẩm Việt Nam, đồng thời cung cấp thông tin quan trọng cho các nghiên cứu về chất màu chlorophyll.
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây chè
1.1.1 Giới thiệu về cây chè
Hình 1.1 Hình ảnh lá chè xanh
Cây chè, hay còn gọi là cây trà, có tên khoa học là Camellia sinensis, là loài cây được sử dụng để sản xuất trà từ lá và chồi của nó Tên "sinensis" trong tiếng Latinh có nghĩa là "Trung Quốc" Các danh pháp khoa học cũ của cây này bao gồm Thea bohea và Thea viridis.
Chè xanh là cây công nghiệp lâu năm, có tuổi thọ từ 30 đến 40 năm và cho phép thu hoạch nhiều lần trong năm, mang lại hiệu quả kinh tế cao Loại cây này thường mọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, với chiều cao tự nhiên từ 6 đến 20 mét Tuy nhiên, trong các khu vực trồng chè để lấy lá, người ta thường xén tỉa cây xuống chỉ còn cao hơn hông người.
1.1.2 Đặc điểm sinh vật học của cây chè a.Thân và cành
Cây chè phát triển trong môi trường tự nhiên với cấu trúc đơn trục, tức là chỉ có một thân chính và các cành phân nhánh Dựa vào đặc điểm sinh trưởng và hình dạng phân cành, thân chè được phân loại thành ba loại chính: thân gỗ, thân nhỡ (thân bán gỗ) và thân bụi.
Cành chè được hình thành từ sự phát triển của mầm dinh dưỡng, với mỗi cành được chia thành nhiều đốt Chiều dài của các đốt này có thể thay đổi từ 1-10 cm, tùy thuộc vào giống chè và điều kiện sinh trưởng Đặc biệt, đốt chè dài là một trong những dấu hiệu cho thấy cây chè có năng suất cao.
Thân và chè cấu thành khung tán của cây chè, với số lượng cành hợp lý trên tán giúp cây đạt sản lượng cao Khi vượt quá giới hạn này, sản lượng không tăng và chất lượng giảm do xuất hiện nhiều búp mù Mối quan hệ giữa mật độ cành và sản lượng búp không chặt chẽ.
Cây chè có hai loại mầm chính: mầm dinh dưỡng và mầm sinh thực Mầm dinh dưỡng sẽ phát triển thành cành lá, trong khi mầm sinh thực hình thành nụ hoa và quả.
Búp chè, phần non của cành chè, được hình thành từ các mầm dinh dưỡng bao gồm tôm và hai hoặc ba lá non Sự phát triển của búp chè bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố nội tại, với kích thước thay đổi tùy thuộc vào giống Quá trình sinh trưởng của búp chè diễn ra theo quy luật nhất định, tạo ra các đợt sinh trưởng theo thứ tự thời gian, và thời gian mỗi đợt phụ thuộc vào giống, chế độ dinh dưỡng và điều kiện khí hậu.
Búp chè là nguyên liệu để chế biến ra các loại chè vì vậy nó quan hệ trực tiếp đến năng suất và phẩm chất của chè d Lá chè
Lá chè mọc trên cành, mỗi đốt có một lá và có hình dạng đa dạng tùy thuộc vào giống Gân lá chè rất rõ ràng, nhưng gân chính thường không kéo dài đến rìa Rìa lá chè có hình dạng rang cưa, khác nhau giữa các giống Số đôi gân lá là một trong những tiêu chí quan trọng để phân biệt các giống chè.
Cây chè là loại cây sống lâu năm, phát triển trên một vị trí cố định, vì vậy việc nghiên cứu đặc điểm bộ rễ của nó rất quan trọng để áp dụng các biện pháp kỹ thuật trồng trọt hiệu quả Rễ chè phát triển mạnh mẽ sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của các bộ phận trên mặt đất, bao gồm cả hoa chè.
Hoa chè có màu trắng với nhiều nhị vàng Mỗi hoa gồm 7 cánh và hàng tá nhị vàng h Quả chè
Quả thường mọc thành từng chùm ba, bắt đầu với màu xanh của chồi Sau đó, chúng phát triển và cứng lại thành quả màu nâu chứa hạt bên trong Khi quả chín, vết rảnh sẽ mở ra, cho phép hạt bên trong được sử dụng để gieo trồng.
1.1.3 Các sắc tố có trong lá chè xanh
Có 3 nhóm sắc tố chính được tìm thấy là : chlorophyll, anthocyanidins, carorenoids
Chlorophylls là chất màu đầu tiên được nhắc đến, đóng vai trò quan trọng trong việc tạo màu xanh lục cho lá chè Chất này có khả năng hòa tan trong nước nóng hơn so với khi hòa tan với các chất màu khác trong dung môi hữu cơ.
Hàm lượng chlorophyll trong lá chè xanh ảnh hưởng xấu đến chất lượng của lá chè
Hàm lượng chlorophyll được tăng lên cùng với các loại chè thô Chè càng có phẩm chất thấp thì hàm lượng chlorophyll càng cao
Delphenidin và cyaniding là thành phần anthocyanidin chính được tìm thấy trong lá chè
Trong trà xanh : làm xấu màu nước trà, làm tăng vị đắng
Có 14 loại được tìm thấy trong lá chè Những thành phần chính : Xanthophylls, β-carotene, violaxathine và neoxanthine
Hàm lượng của cả 4 carotenoid trên đáng kể trong suốt quá trình sản xuất trà đen.
Tổng quan về chất màu
1.2.1 Tổng quan về chất màu thực phẩm trong sản xuất
Chất màu thực phẩm là các hợp chất màu tự nhiên hoặc tổng hợp được sử dụng để cải thiện màu sắc của thực phẩm, giúp khôi phục hoặc tăng cường màu sắc tự nhiên và tính thẩm mỹ hấp dẫn trong quá trình sản xuất.
Màu sắc bên ngoài đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng thực phẩm của người tiêu dùng Những ảnh hưởng của màu sắc này bao gồm việc tạo ấn tượng ban đầu, kích thích cảm giác thèm ăn, và góp phần vào sự nhận diện thương hiệu.
Về cảm quan: việc lựa chọn và đánh giá chất lượng thực phẩm sẽ vô cùng khó khăn nếu không có màu sắc
Màu sắc giúp cho thực phẩm trở nên hấp dẫn hơn
Màu sắc của thực phẩm có thể kích thích, giúp ngon miệng hơn
Mặc dù chỉ cần một lượng nhỏ, màu thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng thực phẩm từ phía khách hàng Do đó, phẩm màu được coi là một thành phần thiết yếu trong thực phẩm.
Trong kỹ thuật sản xuất thực phẩm, việc bảo vệ màu sắc tự nhiên là rất quan trọng, bên cạnh đó, các nhà sản xuất còn thêm các chất màu mới để tạo ra màu sắc phù hợp với tính chất và trạng thái của sản phẩm.
Dựa vào quá trình hình thành có thể chia chất màu thành 2 loại
Có nhiều quan niệm khác nhau về việc phân loại chất màu thực phẩm
Việc phân loại chất màu thực phẩm không mang tính tuyệt đối, mà dựa vào nguồn gốc xuất hiện Chất màu thực phẩm được chia thành ba loại: chất màu có sẵn trong nguyên liệu, chất màu hình thành trong quá trình chế biến, và chất màu được thêm vào như phẩm màu phụ gia.
Chất màu tự nhiên là các hợp chất màu có nguồn gốc từ thực vật hoặc động vật, được hình thành trong quá trình sống để thích ứng với môi trường Chất màu tự nhiên được phân loại thành ba nhóm chính.
Chất màu carotenoid xuất hiện không chỉ trong thực vật như cà rốt, cà chua, ớt đỏ và cam, mà còn có mặt ở vi khuẩn, nấm, tảo và động vật Đến nay, đã có hơn 600 carotenoid được phân lập và xác định.
Carotenoid bền vững dưới tác động của pH và chất khử, nhưng không chịu được nhiệt độ cao và ánh sáng mạnh Chúng tan trong chất béo và dung môi hữu cơ, nhưng không tan trong nước Carotenoid có khả năng huỳnh quang, cho phép năng lượng ánh sáng mà chúng hấp thụ được truyền cho chlorophyll để phục vụ cho quá trình quang hợp Chức năng chính của carotenoid là hấp thụ và chuyển giao năng lượng ánh sáng cho chlorophyll, đồng thời bảo vệ chlorophyll khỏi sự phân hủy do tia bức xạ có năng lượng lớn Nhờ vào khả năng này, carotenoid hoạt động như một bộ lọc ánh sáng, giúp giảm thiểu năng lượng từ các tia bức xạ mạnh, bảo vệ chlorophyll khỏi tổn thương.
Anthocyan và flavon là hai loại sắc tố quan trọng trong thực vật, với anthocyan mang màu sắc từ đỏ tím đến xanh, trong khi flavonoid chủ yếu có màu vàng Ngoài ra, còn có các chất màu xanh tím đỏ hoặc không màu Những sắc tố này xuất hiện ở tất cả các bộ phận của thực vật bậc cao, đặc biệt là ở hoa, giúp tạo ra màu sắc rực rỡ thu hút côn trùng, từ đó hỗ trợ quá trình thụ phấn cho cây.
Flavonoid trong cây có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ và chống oxy hóa, giúp bảo tồn acid ascorbic trong tế bào Chúng ngăn chặn tác nhân gây hại như vi khuẩn, virus và côn trùng, đồng thời một số flavonoid còn có tác dụng điều hòa sự sinh trưởng của cây.
Chlorophyll là sắc tố màu xanh có mặt trong tất cả các loại cây xanh và tảo xanh, đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp của thực vật Màu sắc của chlorophyll có thể dao động từ xanh oliu đến xanh lục thẫm, tùy thuộc vào hàm lượng magie (Mg) trong cấu trúc của nó.
Chất diệp lục bao gồm các loại chlorophyll a, b, c, d, trong đó chlorophyll a và b là chủ yếu Chlorophyll a có màu xanh lam, trong khi chlorophyll b có màu xanh vàng, với tỉ lệ giữa hai loại này là 3:1 Hàm lượng chất diệp lục càng cao thì màu xanh của thực vật càng đậm.
Chlorophyll là yếu tố quan trọng trong quang hợp, đóng vai trò chính trong việc sản xuất hợp chất hữu cơ và là nguồn duy nhất tạo ra oxy tự do.
Các chất màu nhân tạo rất ổn định trong nhiều điều kiện môi trường, dễ sử dụng và bảo quản, đồng thời có thể sản xuất với số lượng lớn để đáp ứng nhu cầu của con người Tuy nhiên, nhược điểm lớn của chúng là có thể tồn dư trong thực phẩm và gây độc hại cho người tiêu dùng Chúng chủ yếu được sử dụng trong sản xuất bánh kẹo, nước giải khát và đồ hộp, do đó cần tuân thủ các quy định và giới hạn liều lượng cho phép khi sử dụng.
Trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm, màu sắc thường bị biến đổi hoặc mất đi Để duy trì màu sắc cho các sản phẩm thực phẩm, có bốn biện pháp hiệu quả cần áp dụng.
Chất màu chlorophyll
Chlorophyll lần đầu tiên được phân lập bởi Joseph Bienaime Caventou và Pierre Joseph Pelletier vào năm 1817 Năm 1913, nhà hóa học Richard Willstatter đã chỉ ra rằng tất cả năng lượng sống đều bắt nguồn từ mặt trời, và cây xanh có khả năng lưu trữ năng lượng này Đến năm 1919, ông giải thích rằng chất giữ năng lượng mặt trời chính là chlorophyll Thực vật bậc cao với lá xanh hấp thụ năng lượng bức xạ và chuyển hóa thành năng lượng dự trữ qua quá trình quang hợp Quá trình này sử dụng năng lượng mặt trời do chlorophyll hấp thụ, phân tách nước thành hydro và oxy, và tổng hợp các chất hữu cơ, cung cấp dinh dưỡng cho bản thân và hầu hết sinh vật trên Trái Đất, đồng thời tạo ra oxy và duy trì sự cân bằng oxy-nitro-carbon trong khí quyển.
Cấu trúc tổng quát của chlorophyll được Hans Fischer tìm ra vào năm
1940 và đến năm 1960 cấu trúc lập thể chlorophyll a đã được làm sáng tỏ hoàn toàn và hầu hết các lập thể của chlorophyll đã được biết đến
Năm 1967, Ian Fleming đã hoàn thành việc giải thích lập thể cuối cùng Vào năm 2010, chlorophyll d (hay f) được công bố là tồn tại trong vi khuẩn lam và các vi sinh vật hiếu khí khác, có khả năng hình thành stromatolites Công thức phân tử của chlorophyll d là C55H70O6N4Mg.
Hình 1.2 Cấu tạo của chlorophyll và haemoglobin
Cấu trúc hóa học của chlorophyll tương tự như hemoglobin trong máu người, đều bao gồm 4 nhóm hem gắn với một nguyên tố kim loại Trong khi hemoglobin chứa sắt, chlorophyll ở thực vật và tảo lại có nguyên tố magie (Mg) thay thế Chính vì vậy, chlorophyll thường được gọi là "máu của thực vật".
Cấu trúc cơ bản của chlorophyll là nhân porphyrin, được hình thành từ 4 vòng pyrol nối với nhau bằng các cầu metyl, tạo thành một vòng khép kín Nhân porphyrin chứa 8 nguyên tử carbon với các nhóm thay thế có khả năng chuyển hóa lẫn nhau Vòng pyrol thứ IV ở trạng thái khử không có nối đôi giữa C7 và C8, và có một gốc acid Cầu γC nối vòng pyrol III và IV tạo nên một vòng khử V không chứa nitrogen, với gốc acid có thể ester hóa bằng rượu metylic, tạo thành gốc COOCH3 Nguyên tử magiê nằm giữa nhân, tạo nên cấu trúc dạng hem, là yếu tố quyết định màu xanh của diệp lục.
Bên cạnh các vòng pyrol, chlorophyll còn có vòng phụ thứ 5, điều này rất quan trọng Nhân porphyrin của chlorophyll có 10 nối đôi, tạo điều kiện cho hoạt tính quang hóa Từ nhân porphyrin, có hai gốc rượu metol (CH3) và fytol (C20H39OH) nối tại vị trí C10 và C7.
Có nhiều loại phân tử chlorophyll với cấu trúc chung gồm nhân porphyrin và 2 gốc rượu, nhưng mỗi loại lại có các nhóm bên khác nhau, tạo ra những tính chất đặc trưng riêng Chlorophyll có khả năng hấp thụ năng lượng ánh sáng một cách chọn lọc, với quang phổ hấp thụ cực đại ở vùng tia xanh (λ: 430-460nm) và vùng ánh sáng đỏ (λ: 620-700nm) Nhờ vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh, chlorophyll có hoạt tính quang hóa, và khi hấp thụ năng lượng từ các lượng tử ánh sáng, nó chuyển đổi thành trạng thái giàu năng lượng, hay còn gọi là trạng thái kích động điện tử, để thực hiện các phản ứng quang hóa tiếp theo.
Chlorophyll có một đặc tính quan trọng là khả năng huỳnh quang, cho phép năng lượng được truyền qua các hệ sắc tố và tập trung vào hai tâm quang hợp.
Chlorophyll là sắc tố quan trọng trong quang hợp nhờ vào khả năng tiếp nhận và chuyển đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng điện tử Quá trình này cho phép chlorophyll biến đổi năng lượng điện tử thành năng lượng hóa học, được lưu trữ trong ATP, cung cấp năng lượng cần thiết cho việc tổng hợp các chất hữu cơ.
Chlorophyll a là sắc tố quang hợp có mặt trong tất cả các sinh vật nhân chuẩn và chủ yếu được tìm thấy ở vi khuẩn lam trong số các sinh vật nhân sơ Mặc dù một số vi khuẩn anoxygenic, vi khuẩn lưu huỳnh màu xanh lá cây và heliobacteria cũng chứa dấu vết chlorophyll a, nhưng vai trò chính của nó là trung gian trong chuỗi vận chuyển điện tử Một số prochlorophytes có chứa divinyl chlorophyll a, với các nhóm thế tại vị trí C-8 trên vòng B là vinyl thay vì ethyl Chlorophyll a hấp thụ ánh sáng xanh và đỏ, trong khi tia lục không được hấp thụ mà phản chiếu, khiến lá cây có màu xanh.
Công thức cấu tạo của chlorophyll a
Hình 1.3.Cấu tạo của chlorohyll a
Chlorophyll b tương tự như chlorophyll a, nhưng khác biệt ở vị trí C-7, nơi nhóm formyl (-CHO) thay thế nhóm methyl (-CH3), dẫn đến sự thay đổi trong khả năng hấp thu bước sóng ngắn hơn Chlorophyll b chủ yếu có mặt trong các sinh vật nhân chuẩn quang hợp, ngoại trừ tảo đỏ và tảo nâu, và trong sinh vật nhân sơ quang hợp, nó chỉ xuất hiện ở prochlorophytes.
Công thức cấu tạo của chlorophyll b
Hình1 4 Cấu tạo của chlorophyll b
Chất diệp lục c là một hợp chất hiếm, không chứa đuôi isoprenoid và vòng D, thiếu gốc phyto tại (C20H39OH) Do đó, nó được phân loại hóa học như porphyrin, không phải chlorin Chlorophyll c được tìm thấy trong các nhóm tảo biển khác nhau, đặc biệt là tảo cát, và hoạt động như một phụ kiện thu ánh sáng trong sắc tố phức hợp protein tương tự chlorophyll b ở thực vật và tảo xanh Ngoài ra, có một số biến thể cấu trúc của chlorophyll c khác nhau ở nhóm thế vòng ngoại vi.
Chlorophyll d khác chlorophyll a chỉ một vài điểm : các nhóm thế ở vị trí
Chlorophyll d là một dạng chlorophyll đặc biệt, trong đó nhóm formyl thay thế nhóm vinyl của chlorophyll a Dù trước đây được cho là không tồn tại, chlorophyll d đã được phát hiện trong một loài cyanobacteria acaryochloris, sống cộng sinh với một số động vật không xương sống biển vào năm 1996 Loài vi khuẩn này sử dụng chlorophyll d làm sắc tố chính, bên cạnh chlorophyll a và sắc tố bilin Chlorophyll d được xem như một cầu nối giữa chlorophyll a và bacteriochlorophyll a, và có thể đóng vai trò quan trọng trong quá trình quang hợp anoxyenic.
1.3.4 Hàm lượng và thành phần chlorophyll trong rau quả
Chlorophyll, một sắc tố quan trọng, có mặt trong các phần xanh của cây và được phân bố trong lục lạp (Chloroplast) hay hạt diệp lục Hàm lượng chlorophyll trong cây xanh chiếm khoảng 1% chất khô, đóng vai trò thiết yếu trong quá trình quang hợp.
Trong hầu hết các loài thực vật bậc cao, tỷ lệ chlorophyll a và chlorophyll b thường là 3/1 Tuy nhiên, tỷ lệ này có thể thay đổi do nhiều yếu tố như loài thực vật, trạng thái sinh trưởng và điều kiện môi trường, bao gồm độ ẩm, độ sáng và hàm lượng khoáng chất.
Thực vật sống ở nơi có nhiều ánh sáng thường có tỷ lệ chlorophyll a cao hơn so với những thực vật ở nơi tối, mát Khi trái cây chín, tỷ lệ chlorophyll a và b (3/1) có xu hướng giảm, tuy nhiên, trong một số trường hợp đặc biệt, tỷ lệ này lại tăng lên do chlorophyll b bị phân hủy nhanh hơn chlorophyll a.
1.3.5 Tính chất và các yếu tố ảnh hưởng đến sự ổn định của chlorophyll 1.3.5.1 Tính chất vật lí
Chlorophyll hấp thu mãnh liệt ánh sáng có bước sóng từ đỏ đến xanh[28]
Hình 1.5 Quang phổ hấp thu của chlorophyll
1.3.5.2.1 Tác dụng của nhiệt độ và acid
Các phương pháp xác định chlorophyll từ thực vật
Có 4 phương pháp chủ yếu để xác định hàm lượng chlorophyll[17]
- Phương pháp săc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Phương pháp huỳnh quang có độ nhạy cao hơn so với phương pháp trắc quang, vì vậy khi phân tích mẫu có hàm lượng chlorophyll thấp, phương pháp huỳnh quang sẽ được ưu tiên sử dụng.
Phương pháp HPLC với thiết bị phức tạp nhưng vẫn dự trên nguyên tắc của phương pháp huỳnh quang và trắc quang
Phương pháp điện hóa xác định chlorophyll sử dụng cực phổ tuần hoàn trực tiếp với điện cực màng carbon, cho phép thu được mũi đơn thuận nghịch oxy hóa tại cực dương ở điện thế EV = +400mV, sử dụng điện cực so sánh Ag/AgCl.
Trong quá trình nghiên cứu người ta thường sử dụng phương pháp huỳnh quang và trắc quang để xác đinh hàm lương chlorophyll
1.4.1.1 Phương pháp đo trực tiếp
Phương pháp này cho phép xác đinh chlorophyll trong nhiều sinh vật mà không cần chiết hay xử lí hóa học
Phương pháp đo huỳnh quang trực tiếp này có thể thực hiện theo 2 cách:
- Đo trên dòng chảy liên tục áp dụng cho giám sát môi trường
Đo mẫu nước có thể thực hiện tại hiện trường hoặc trong phòng thí nghiệm bằng máy đo huỳnh quang Thiết bị phù hợp cho phương pháp đo trực tiếp là máy đo huỳnh quang 10-AU dành cho hiện trường và máy DT-700 dành cho phòng thí nghiệm.
1.4.1.2 Phương pháp ngâm chiết (gián tiếp)
Các phép đo huỳnh quang trong dung môi ngâm chiết từ tế bào bị phá vỡ được sử dụng để xác định lượng chlorophyll tuyệt đối có mặt và lượng sản phẩm chlorophyll bị phân hủy là pheophytin.
Trong quá trình chiết tách chlorophyll, các dung môi thường được sử dụng bao gồm acetone, ethanol, methanol và DMSO Chlorophyll không ổn định khi có mặt acid và ánh sáng, với lượng acid nhỏ có thể chuyển chlorophyll thành pheophitin Do đó, dụng cụ cần được trung hòa và không có acid Ánh sáng mặt trời hoặc ánh sáng huỳnh quang cũng làm chlorophyll phân hủy nhanh chóng, vì vậy thí nghiệm nên được thực hiện dưới ánh sáng dịu và trong dụng cụ cản sáng Nghiên cứu cho thấy việc nghiền mẫu trước khi chiết có thể tăng lượng chlorophyll tách được từ 5-60%.
Phương pháp quang trắc quang phân tử, hay còn gọi là quang phổ hấp thụ phân tử, là một trong những kỹ thuật phổ biến với nhiều loại máy khác nhau, từ các máy đơn giản được gọi là máy so màu đến các máy hiện đại tự động hóa như máy quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis Các thiết bị này hoạt động trong vùng tử ngoại (UV) và khả kiến (VIS) với dải bước sóng từ 190nm đến khoảng 900nm.
Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch màu:
Dung dịch màu xuất hiện khi dung dịch hấp thụ một phần quang phổ của ánh sáng trắng, trong khi phần còn lại phản xạ ra màu sắc của dung dịch Màu sắc này chính là màu phụ của ánh sáng trắng đã bị hấp thụ Bảng 1.1 trình bày sự hấp thụ màu của dung dịch theo các màu sắc khác nhau.
Bảng 1.1 Sự hấp thụ màu của các dung dịch màu
TIA SÁNG ĐƠN SẮC BỊ HẤP THỤ MÀU CỦA DUNG DỊCH
400nm ÷ 450nm : vùng tím Lục ánh vàng
450nm ÷ 480nm :vùng chàm vàng
480nm ÷ 490nm :vùng chàm lục Da cam
490nm ÷ 510nm :vùng lục chàm Đỏ
510nm ÷ 560nm :vùng lục Đỏ tía
560nm ÷ 575nm :vùng lục ánh vàng Tím
575nm ÷590nm :vùng vàng Chàm
590nm÷ 640nm :vùng đa cam Chàm lục
640nm ÷ 720nm :vùng đỏ Lục chàm
720nm ÷ 800nm :vùng đỏ tí Lục
Sự hấp thụ bức xạ đơn sắc của dung dịch còn phụ thuộc vào nồng độ của chất hấp thụ
Nguyên tắc chiết xuất chlorophyll a, b, c, d sử dụng các dung môi như acetone, ethanol và methanol Mỗi loại chlorophyll sở hữu phổ hấp thu ánh sáng riêng biệt với các đỉnh hấp thu đặc trưng Phần chiết xuất từ dung môi sẽ được phân tích bằng máy so màu, tương ứng với các đỉnh hấp thu đã xác định.
Phương pháp trắc quang để xác định chlorophyll bao gồm việc phá vỡ tế bào và ngâm chiết chlorophyll, sau đó đo độ hấp thụ tại các bước sóng khác nhau Phương pháp này có những ưu điểm và nhược điểm riêng khi xác định chlorophyll a, so với phương pháp huỳnh quang.
Phương pháp huỳnh quang nổi bật với độ nhạy vượt trội, lớn hơn 1000 lần so với các phương pháp khác Kỹ thuật xử lý mẫu cho phương pháp này sử dụng phương pháp ngâm chiết tương tự như trắc quang, nhưng với độ nhạy cao hơn và lượng mẫu cần thiết ít hơn.
- Tốc độ : phương pháp trắc quang phải đo mẫu ở một vài bước sóng, trong khi phương pháp huỳnh quang chỉ cần đo ở một bước sóng
- Chọn bước sóng đo: với máy huỳnh quang không phụ thuộc vào việc chọn bước sóng
- Cuvet : phương pháp huỳnh quang không phụ thuộc quá nhiều vào vị trí cũng như sự tương thích của cuvet
1.4.3 Một số loại dung môi tách chiết
Dung môi acetone được sử dụng phổ biến trong các phương pháp trắc quang và huỳnh quang Trong phương pháp trắc quang, cần thực hiện ly tâm để loại bỏ ảnh hưởng của độ đục, trong khi phương pháp huỳnh quang có thể không cần kỹ thuật này vì nó ít nhạy cảm với độ đục ở mức độ bình thường Nếu mẫu trắng có giá trị đo huỳnh quang cao, việc đánh giá giá trị có thể gặp khó khăn.
Khi máy huỳnh quang bị 0 do sử dụng dung môi acetone trắng, điều này cho thấy acetone đã bị nhiễm bẩn Nguyên nhân phổ biến của sự nhiễm bẩn này thường là do sự sánh dầu trong quá trình sản xuất các bình chứa kim loại.
Methanol tỏ ra hiệu quả hơn acetone trong một số trường hợp, đặc biệt khi không yêu cầu độ chính xác cao và hàm lượng pheophytin thấp Để đạt được độ chính xác cao hơn, đặc biệt khi có sự hiện diện đáng kể của pheophytin, dịch chiết methanol thường được làm khô và chuyển sang acetone 90% Phổ pheophytin a và b nhạy với pH trong dung môi methanol, nhưng lại không nhạy trong dung môi acetone 90%, do đó, việc xác định lượng chlorophyll chính xác hơn khi áp dụng phương pháp trắc quang và phương pháp đo huỳnh quang.
Dung môi này rất hiệu quả trong việc ngâm chiết tảo nâu, loại tảo khó tách chiết chlorophyll bằng các dung môi khác Nó cho phép ngâm chiết gần như hoàn toàn các loại tảo mà không để lại sắc tố trong bã thải DMSO có khả năng phá vỡ các thể hạt bên trong và cấu trúc màng của tảo nâu và tảo lam.
Ethanol là một dung môi tách chiết hiệu quả, thường được sử dụng để đánh giá chlorophyll trong sinh khối vi tảo So với acetone, ethanol còn cho kết quả tốt hơn trong quá trình chiết tách và định lượng các sắc tố từ các tế bào tự dưỡng.
Thiết bị
- Cân phân tích( độ chính xác 0.001)
- Máy li tâm : Máy li tâm EBA 21 sản xuất ở Đức
- Tủ lạnh điều chỉnh nhiệt độ 4-6 0 C
- Máy đo quang UV-Vis
Dụng cụ
- Vial (lọ đựng mẫu 1,5 ml có nắp)
- Các bình định mức: 10,50, 100 ml
Kỹ thuật thực nghiệm
2.3.1 Các dung môi dùng để tách chiết
2.3.2 Cở sở lý thuyết của phương pháp tách chiết
Mg trong vòng pyron có tính tan trong nước và kết hợp với protein màng, trong khi đuôi dài cacbon của gốc rượu phytol lại có tính kỵ nước, hướng tới cấu trúc lipit của màng tilacoit, khiến chlorophyll chủ yếu hòa tan trong dung môi hữu cơ Để tách chlorophyll hiệu quả từ lá, người ta không sử dụng ether petrol hay benzene, mà thay vào đó dùng cồn hoặc acetone pha với một ít nước để chiết xuất hoàn toàn phân tử chlorophyll, cùng với các sắc tố carotenoid.
Chlorophyll, khi tách rời khỏi hệ sắc tố, vẫn duy trì khả năng hoạt động quang hóa, có nghĩa là nó có thể bị kích thích bởi ánh sáng Trong trạng thái này, chlorophyll thực hiện vai trò chuyển H+ và electron, hiện tượng này được gọi là tính chất cảm quang của chlorophyll.
2.3.3 Khảo sát các yếu tố : thời gian, nồng độ dung môi và thể tích dung môi
- Thời gian : Để chọn thời gian xác định hàm lượng chlorophyll tốt nhất,tôi tiến hành thí nghiệm ở 3 thời gian khác nhau: 16 giờ, 20 giờ, 24 giờ
- Nồng độ dung môi: để chọn được nồng độ dung môi thích hợp tôi chọn khảo sát 40, 50, 60, 70, 80, 90
- Thể tích dung môi: để chọn thể tích dung môi phù hợp tôi chọn khảo sát 50, 60, 70, 80
2.3.4 Quy trình tách chiết chlorophyll
Chlorophyll được sử dụng làm phẩm màu phụ gia thực phẩm dưới dạng magie chlorophyll hoặc phaeophytin, được chiết xuất từ lá cây bằng các dung môi phù hợp Sau khi loại bỏ dung môi, sản phẩm thu được chứa các phaeophytin và magie chlorophyll, cùng với các chất màu khác như carotene, sáp và chất béo từ nguyên liệu Để đạt được chất màu tinh khiết hơn, người ta áp dụng phương pháp kết tinh.
Quá trình tách chiết chlorophyll từ lá chè xanh với hệ dung môi ( ethanol, methanol, aceton) được tiến hành như sau:
Ly tâm 3500/phút trong 10 phút
Nghiền nhỏ Ủ lạnh ở nhiệt độ 4-6ᴼC Hòa trộn dung môi
Cân Đo độ hấp thụ quang
Lá chè xanh được lấy ở xã Thanh Tiên, huyện Thanh Chương Tiến hành rửa sạch với nước để loại bỏ các tạp chất bụi bẩn
- Sau đó vớt ra và để ráo nước hoàn toàn
- Tiếp theo, lá chè được thái nhỏ và đưa vào cối nghiền nhỏ để phá vỡ các tế bào tạo cho quá trình chiết được tốt hơn
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên, cân 2g mẫu và cho vào cốc thủy tinh cùng với 60 ml dung môi (axetone, methanol, ethanol) để đạt nồng độ mong muốn Sau đó, cốc thủy tinh được bọc kín và bảo quản trong điều kiện tối ở nhiệt độ từ 4-6 độ C trong khoảng thời gian từ 16 đến 24 giờ.
- Dịch thu được sau khi chiết được đem ly tâm 3500/phút trong 10 phút Dịch trong được đem đi đo độ hấp phụ quang ở máy đo UV-Vis
+ Đối với dung môi axeton mẫu được đo độ hấp thu ở bước sóng 664 nm và 646nm
+ Đối với dung môi methanol và ethanol mẫu đo độ hấp thu ở bước song 665nm và 652nm
2.3.5 Thiết kế thí nghiệm để tối ưu hóa các điều kiện tách chiết chlorophyll
Trong quá trình tách chiết chlorophyll trong lá chè chịu tác động của nhiều yếu tố nhưng ở đây tôi chọn 3 yếu tố:
- B: thời gian ngâm chiết ( giờ)
Đối với chất màu chlorophyll, có nhiều chỉ số để đánh giá, nhưng trong nghiên cứu này, tôi chọn nồng độ chlorophyll (chl-ab) làm hàm mục tiêu, với thể tích dung môi được tính bằng mililit (ml).
Để xác định hướng đi của đề tài và nhanh chóng đạt được kết quả tối ưu, tôi đã chọn phương án quy hoạch trực giao cấp I (TYT 2 k) với thực nghiệm yếu tố toàn phần hai mức và k yếu tố ảnh hưởng.
Từ quá trình khảo sát chúng tôi chọn mức quy hoạch cho 3 yếu tố như sau:
- Thể tích dung môi (X 3) : 50÷ 70 ml
Tổ chức các thí nghiệm trực giao cấp I
Theo [13] [14] số thí nghiệm trong phương án là N=2 k =8(k=3) và 3 thí nghiệm tại tâm
Bảng 2.1 Các mức của các yếu tố ảnh hưởng
Các mức Các yếu tố ảnh hưởng
Từ cách chọn phương án và điều kiện thí nghiệm, tôi xây dựng được ma trận thực nghiệm theo biến mã và tiến hành thí nghiệm theo ma trận
Bảng 2.2 : Ma trận quy hoạch với biến ảo TYT 2 3
STT Biến thực Biến mã
- x 3 : thể tích dung môi, ml
Hàm mục tiêu (Y) được xác định là nồng độ chlorophyll, được đo bằng phương pháp quang Phương trình hồi quy thực nghiệm theo mô hình bậc hai được thiết lập theo công thức cụ thể.
Sử dụng phần mềm thống kê Design-Expert 7.1 (Stat-Ease, Inc, Minneapolis, USA) để xử lý số liệu thực nghiệm, phân tích các hệ số hồi quy, bề mặt đáp ứng và tối ưu hóa thông qua thuật toán hàm mong đợi.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Ảnh hưởng của các loại môi đến nồng độ chlorophyll thu nhận được sau quá trình tách chiết
- Đối với dung môi axetone, mẫu được đo độ hấp thu ở các bước song
664 và 646 nm (Robert J Porra, 2006) [20] Nồng độ chlorophyll a (Chl-a) và nồng độ chlorophyll b(Chl-b) được tính theo công thức:
Đối với methanol và ethanol, độ hấp thu được đo ở bước sóng 665 nm và 652 nm (Zapata Garrido & Jeffrey, 2006) Nồng độ chlorophyll a (Chl-a) và chlorophyll b (Chl-b) được xác định theo công thức cụ thể.
Số liệu được trình bày dưới dạng trung bình hoặc trung bình ± độ lệch chuẩn
Xử lí số liệu bằng phương pháp phân tích phương sai ANOVA với phần mềm SPSS version 17.0
Kết quả được xử lý như sau:
Bảng 3.1 Nồng độ chlorophyll của các dung môi ở các nồng độ khác nhau
Chl-a, Chl-b, Chl-ab: nồng độ (àg/l, trung bỡnh ± độ lệch chuẩn, n=9) chlorophyll a, chlorophyll b và chlorophyll tổng số trong 2 g mẫu chè xanh được tách chiết ở 4-6 0 C trong thời gian 24 giờ
- Mật độ quang của các dung môi ( Bảng PL1,PL2,PL3)
- Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn ( Bảng PL4)
3.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến dịch chiết chlorophyll (Chl-ab)
25 axetone ethanol methanol n ồn g đ ộ ch l- ab ( à g/ l) dung môi Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến dịch chiết Chl- ab
Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến dịch chiết chrophyll(Chl-ab)
Qua biểu đồ và kết quả tính toán ta thấy :
Nồng độ chlorophyll (Chl-ab) thay đổi tùy thuộc vào loại dung môi sử dụng Trong số các dung môi, axetone cho nồng độ chlorophyll (Chl-ab) cao nhất, đạt 23,30 (àg/l) ở nồng độ 90% Tiếp theo là ethanol, trong khi methanol có nồng độ chlorophyll (Chl-ab) thấp nhất.
- Đối với dung môi methanol và axeton thì nồng độ dung môi càng lớn thì nồng độ Chl-ab càng tăng
- Đối với dung môi ethanol thì ta thấy nồng độ chlorophyll (Ch-ab) lớn nhất ở nồng độ 80% sau đó ở nồng độ 90% thì nồng độ chlorophyll giảm dần
3.1.2 Ảnh hưởng của dung môi đến tỉ lệ chlorophyll a trong dịch chiết
70 80 90 tỉ lệ chl-a (%) nồng độ dung môi axetone ethanol methanol
Hình 3.2 Ảnh hưởng của dung môi đến tỉ lệ chl-a
Qua biểu đồ và kết quả tính toán ta thấy:
Tỉ lệ chlorophyll a thay đổi tùy thuộc vào loại dung môi sử dụng Biểu đồ cho thấy dung môi ethanol cho tỉ lệ chl-a cao nhất, trong khi tỉ lệ chl-a ở dung môi axeton và methanol lại thấp và gần như tương đương nhau.
3.1.3 Sự khác nhau giữa nồng độ chl-a và chl-b trong các dung môi
Hình 3.3 Sự khác nhau giữa nồng độ chl-a và chl-b trong các dung môi ở nồng độ 70%
Biểu đồ cho thấy sự khác biệt rõ rệt về nồng độ chl-a và chl-b trong các dung môi khác nhau ở nồng độ 70% Cụ thể, trong dung môi axetone và methanol, nồng độ chl-b cao hơn chl-a Ngược lại, trong dung môi ethanol, nồng độ chl-a vượt trội hơn hẳn so với chl-b, với tỷ lệ gần 3:1.
Theo nghiên cứu của Barrett & Jeffrey (1964), enzyme chlorophyllase vẫn duy trì hoạt tính ở các nồng độ dung môi khác nhau, dẫn đến sự chuyển đổi chlorophyll sang các dạng đồng phân khác nhau Đồng thời, chlorophyll b reductase cũng chuyển chlorophyll b thành chlorophyll a Sự hoạt động của hai enzyme này trong quá trình tách chiết, bao gồm giai đoạn ngâm, nghiền mẫu và lưu trữ trong các dung môi khác nhau, có thể tạo ra sự khác biệt về lượng và tỷ lệ chlorophyll thu được Nghiên cứu về cấu trúc chlorophyll cho thấy chlorophyll a có nhóm methyl (CH3) tại vị trí C7, trong khi chlorophyll b có nhóm formyl (-CHO) (Woodward RB, 1960) Acetone (CH3)2CO, cùng với methanol (CH3OH) và ethanol (C2H5OH), là những dung môi chứa nhóm methyl và hydroxyl (-OH), có khả năng chuyển đổi dễ dàng sang nhóm formyl Hơn nữa, khả năng hòa tan của chlorophyll cũng khác nhau dựa trên tỷ lệ dung môi, điều này dẫn đến sự khác biệt trong kết quả thí nghiệm.
3.1.4 Lựa chọn dung môi tách chiết
Dựa trên khảo sát nồng độ chlorophyll trong ba loại dung môi và các điều kiện an toàn thực phẩm, tôi đã chọn dung môi ethanol để tối ưu hóa quá trình tách chiết nồng độ chlorophyll Dung môi ethanol đảm bảo các tiêu chí an toàn và hiệu quả trong nghiên cứu.
- Nồng độ cholorophyll tách chiết của dung môi ethanol ở mức cao
Kết quả khảo sát cho thấy nồng độ chlorophyll đạt mức cao nhất trong quá trình tách chiết ở nồng độ 80% Tuy nhiên, khi tăng lên nồng độ 90%, nồng độ chlorophyll lại giảm, cho thấy nồng độ 80% là khoảng tối ưu nhất cho quá trình tách chiết này.
- Dung môi ethanol là dung môi rẻ tiền dễ kiếm, an toàn trong quá trình tách chiết
3.2 Ảnh hưởng của thời gian ủ dịch chiết trong dung môi và tỉ lệ chlorophyll thu đƣợc sau quá trình tách chiết
- Mật độ quang được đo ở thời gian 16, 20, 24 giờ trong điều kiện nhiệt độ 4-6 0 C đối với dung môi là ethanol
Kết quả được tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 3.2 Nồng độ chlorophyll qua các khoảng thời gian khác nhau
Thời gian Chl-a Chl-b Chl-ab Tỉ lệ chl-a
Chl-a,Chl-b, Chl-ab là nồng độ chlorophyll (àg/l)trong 2g ở nhiệt độ 4-6
0 C ở nồng độ 80% của dung môi ethanol
Kết quả cho thấy sự thay đổi nồng độ chlorophyll (Ch-ab) qua các thời gian ủ dịch khác nhau Nồng độ Chl-ab cao nhất đạt 21.52 (àg/l) sau 20 giờ, nhưng sau đó giảm xuống còn 20.46 (àg/l) ở thời gian 24 giờ.
Xác định điều kiện tối ưu trong quá trình tách chiết chlorophyll bằng dung môi ethanol
- Nồng độ chlorophyll trong quá trình tối ưu được tính như sau :
Bảng 3.3 Nồng độ chlorophyll trong quá trình tối ưu
Thể tích dung môi(V) Chl-ab
Bảng 3.4 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu quá trình tổng hợp các yếu tố
Yếu tố Tổng bình phương
Trung bình bình phương Giá trị F Giá trị p prob>F
Mô hình 220.88 7 31.55 2.760E+0.05