MỞ ðẦU
ðặt vấn ủề
Khoai tây là cây trồng lý tưởng cho vụ đông tại đồng bằng Sông Hồng, nhưng diện tích trồng khoai tây ở Việt Nam chỉ đạt dưới 50.000 ha Nhiều nguyên nhân hạn chế sự phát triển của khoai tây, trong đó nguyên nhân chính là vấn đề giống khoai tây Công tác giống khoai tây đóng vai trò quyết định trong sự phát triển của ngành sản xuất khoai tây tại Việt Nam.
2 vấn ủề bức xỳc của cụng tỏc giống khoai tõy là:
Hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh tại chỗ chưa được xây dựng, dẫn đến việc phụ thuộc vào giống khoai tây nhập khẩu, trong khi các giống cũ đang bị thoái hóa do virus Việc phát triển giống khoai tây sạch bệnh là cần thiết để cải thiện chất lượng sản xuất và giảm thiểu rủi ro từ bệnh tật.
Việc chọn tạo giống khoai tây phù hợp với điều kiện sinh thái Việt Nam vẫn gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là trong việc phát triển giống có năng suất cao, chất lượng tốt và khả năng kháng bệnh, nhất là các virus PVX, PVY Hiện tại, nghiên cứu về chọn tạo giống khoai tây chủ yếu dựa vào các phương pháp truyền thống, dẫn đến nhiều hạn chế và chưa áp dụng các công nghệ sinh học hiện đại Một trong những hướng đi tiềm năng là kết hợp các đặc tính kháng bệnh từ khoai tây dại vào giống khoai tây trồng thông qua phương pháp dung hợp tế bào Dự án hợp tác giữa Viện SHNN và Viện chọn tạo giống cây trồng JKI-CHLB Đức đã đạt được nhiều kết quả khả quan trong việc tạo ra các thể tỏi sinh mới.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang tiến hành nghiên cứu luận văn thạc sĩ về khoa học nông nghiệp, đặc biệt là trong lĩnh vực dung hợp tế bào trần Việc xác định và đánh giá các con lai soma là rất quan trọng để đảm bảo tính khả thi và hiệu quả của nghiên cứu này Chúng tôi tập trung vào việc phát triển các phương pháp và kỹ thuật mới nhằm nâng cao chất lượng và năng suất trong nông nghiệp.
“Nghiờn cứu xỏc ủịnh cỏc con lai soma khoai tõy và cỏc ủặc tớnh nụng sinh học của cỏc dũng con lai ủú”.
Mục ủớch và yờu cầu
Xác định đặc tính của con lai soma heterozygous sau dung hợp là rất quan trọng, nhằm đánh giá các đặc điểm có lợi như khả năng kháng virus PVX, PVY Việc này giúp chọn lọc các dòng giống triển vọng để phát triển thành giống kháng virus, phục vụ cho sản xuất nông nghiệp hiệu quả.
Nghiờn cứu xỏc ủịnh con lai soma
- đánh giá ựược ựộ bội của con lai sau dung hợp
- Xỏc ủịnh con lai soma bằng kỹ thuật Isozyme, bằng chỉ thị phõn tử đánh giá con lai
- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, tạo củ in vitro
- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển hình thành năng suất trong ủiều kiện chậu vại
- đánh giá các phẩm chất chế biến và ăn tươi
- đánh giá khả năng kháng virus PVX, PVY thông qua việc kiểm tra gen kháng và phương pháp lây nhiễm nhân tạo
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp những dữ liệu khoa học mới và giá trị về khả năng sinh trưởng, phát triển, hình thành củ và khả năng kháng virus của các con lai soma từ việc dung hợp protoplast của các giống khoai tây nhị bội mang gen kháng virus.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3
Kết quả là tài liệu tham khảo cho việc nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua dung hợp tế bào trần
Tạo ủược cỏc dũng khoai tõy tứ bội cú khả năng khỏng virus PVX, PVY làm vật liệu khởi ủầu cho cỏc nghiờn cứu chọn tạo giống tiếp theo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 4
VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ðối tượng, vật liệu, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu
- 5 dòng khoai tây nhị bội: A15, A16, A56, B186, B208 (Viện nghiên cứu Tài nguyên cây trồng – Bavaria – Công hòa liên bang ðức cung cấp)
Trong nghiên cứu tại Viện SHNN và Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng Đức, 82 dòng lai soma tỏi đã được sinh ra thông qua phương pháp dung hợp bằng xung điện giữa 5 dòng khoai tây nhị bội Kết quả của nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong bảng dưới đây.
Bảng 3.1 Cỏc dũng lai soma tỏi sinh ủược từ 4 tổ hợp dung hợp nghiên cứu
Các tổ hợp dung hợp A16+B208 A15 + A56 B208 + B186 A15 + B208
Các dòng lai soma tái sinh sau dung hợp
Các dòng lai soma khoai tây được tái sinh dưới dạng cây in vitro trong môi trường MS cơ bản, với chế độ chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày và nhiệt độ ủ từ 18 đến 22 độ C Các dòng "bố mẹ" cũng được nuôi cấy trong điều kiện tương tự để làm vật liệu đối chứng.
- Các hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu:
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26
+ Hóa chất nuôi cấy mô (Phụ lục 1)
+ Húa chất dựng ủể tỏch chiết DNA (Phụ lục 2)
+ Húa chất dựng ủể tỏch chiết protein (Phụ lục 3)
+ Thành phần cho phản ứng PCR (Phụ lục 6)
- Các dụng cụ và máy móc cần thiết cho các thí nghiệm: Cối sứ, pipet, cõn vi lượng, mỏy ủiện di, mỏy PCR, mỏy ly tõm, mỏy xung ủiện
• ðịa ủiểm ðề tài ủược tiến hành tại phũng Cụng nghệ sinh học khoai tõy thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp – Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội
• Thời gian nghiên cứu ðề tài tiến hành từ tháng 8/2011 – 8/2012
Nội dung nghiên cứu
Nội dung nghiờn cứu ủược thể hiện theo sơ ủồ sau:
Cây lai soma khoai tây tái sinh sau dung hợp
Chọn lọc các con lai tứ bội (phương pháp flow cytometry)
PP Isozyme Xỏc ủịnh con lai heterozygous
(Con lai soma dị nhân)
PP chỉ thị ADN đánh giá con lai soma dị nhân
Trong ủiều kiện in vitro
- Khả năng sinh trưởng phát triển
- Kiểm tra sự có mặt của gen kháng virus PVX, PVY
Trong ủiều kiện chậu vại
- Khả năng sinh trưởng phát triển
- Kiểm tra tính kháng virus PVX, PVY bằng lây nhiễm nhân tạo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 27
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Các phương pháp nghiên cứu trong phòng
3.3.1.1 Phương pháp nuôi cấy mô hiện hành:
Cỏc giống khoai tây nhị bội (diploid) được nuôi cấy in vitro trong môi trường MS Cây in vitro được đặt trong phòng nuôi theo chế độ nhiệt độ ổn định.
21 0 C, cường ủộ chiếu sỏng 3000 – 4000 lux, quang chu kỳ 16h chiếu sáng/ngày
3.3.1.2 Phương phỏp xỏc ủịnh con lai bằng ủếm ủộ bội flow cytometry
Nguyên lý của công nghệ này là phát hiện và xác định các hạt siêu nhỏ như tế bào và nhiễm sắc thể bằng cách làm nổi chúng trong một dung dịch chảy và dẫn qua bộ từ trường Phương pháp này cho phép đo các thông số quang học (huỳnh quang) của các hạt siêu nhỏ trong dịch huyền phù, với kích thước từ 0,2 – 150 micromet Khi các hạt này đi qua tia sáng, chất huỳnh quang sẽ phát hiện và tính toán các hạt hoặc lực hút của chúng Khi chạy qua nguồn sáng UV, chất nhuộm huỳnh quang sẽ tương ứng với hàm lượng ADN, và dấu hiệu của chất nhuộm sẽ biến đổi tùy thuộc vào tín hiệu electron Các giá trị thu được sẽ được tính toán và tóm tắt trên một biểu đồ, với số lượng nhân tế bào tương ứng với hàm lượng ADN.
Quy trỡnh ủỏnh giỏ mức ủa bội của tế bào thực vật (phụ lục 4)
3.3.1.3 Phương phỏp xỏc ủịnh con lai bằng chỉ thị ISOZYME (theo Thach và cs, 1993)
Dựa trên kết quả phân tích qua máy Flow cytometry, chúng ta có thể lọc ra những dòng tứ bội Tuy nhiên, không phải tất cả các dòng tứ bội đều là con lai dị nhon (heterozygous) Để xác định chính xác con lai dị nhon, cần áp dụng nhiều phương pháp khác nhau Nghiên cứu này sử dụng hai loại isozym là esteraza và peroxidaza để xác định con lai soma Phương pháp và hóa chất được mô tả chi tiết trong phụ lục 3.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 28
3.3.1.4 Phương phỏp xỏc ủịnh con lai soma bằng chỉ thị phõn tử SSR: dựa trờn chỉ thị phõn tử SSR kết hợp sử dụng hệ thống phõn tớch di truyền ủa năng GenomeLab GeXP 8800 (Beckman GenomeLab Coulters)
Phương pháp chiết tách ADN
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN tổng số của GS Hans – Joerg Jacobsen trường ðại học Hannover (Phụ lục 5)
Sau khi tách chiết DNA, cần kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA tổng số bằng cách điện di trên gel agarose 1% Nếu đạt yêu cầu, tiến hành thực hiện thí nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu.
Phương pháp sử dụng mồi SSR:
- Cỏc mồi SSR sử dụng ủược trỡnh bày ở bảng như trong phần vật liệu
Cỏc mồi ủỏnh dấu và khụng ủỏnh dấu được cung cấp bởi Biomers net GmbH (Đức) là rất quan trọng trong nghiên cứu ADN Phản ứng ủỏnh dấu các đoạn ADN sử dụng chất nhuộm huỳnh quang với ba loại mồi: một mồi xuụi với ủuụi M13 ở đầu 5’, một mồi ngược và một mồi M13 chung, theo nghiên cứu của Schuelke (2000).
- Sử dụng mỏy MJ Research Thermocycler (PTC-200) ủể tăng cường nồng ủộ của cỏc ủoạn chỉ thị
Thể tích dung dịch phản ứng PCR là 20 µl, bao gồm 25 ng DNA, 1x dung dịch ủ PCR, 2.5 mM MgCl2, 200 µM cho mỗi dNTP, 0.1 µM mồi xuôi, 0.17 µM mồi ngược, 0.07 µM mồi đánh dấu M13 và 0.5 đơn vị enzyme Taq DNA polymerase.
Chu kỳ PCR bao gồm các bước sau: đầu tiên là bước ủ 5 phút, sau đó thực hiện 30 chu kỳ với mỗi chu kỳ kéo dài 30 giây ở 94 độ C, 45 giây ở 60 độ C và 45 giây ở 72 độ C Tiếp theo là 8 chu kỳ với 30 giây ở 94 độ C, 45 giây ở 56 độ C và 45 giây ở 72 độ C Cuối cùng, có một bước kéo dài ở 72 độ C trong 10 phút.
Sản phẩm PCR được đưa vào ống mao quản và phân tích bằng thiết bị GenomeLab GeXP 8800 của Beckman Coulter Kích thước của các đoạn ADN được xác định tự động bởi phần mềm phân tích chuyên dụng đi kèm với máy.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 29
3.3.1.5 Phương phỏp ủỏnh giỏ khả năng khỏng virus bằng phương phỏp DAS – ELISA (Double Antibody Sandwich Enzyme – linked imunosorbent assay) Bước 1: Cố ủịnh khỏng thể IgG ủặc hiệu của virus vào bản ELISA
Để thực hiện thí nghiệm ELISA, hãy hòa tan IgG trong dung dịch carbonate và cho vào mỗi giếng 200 µl Đặt bản ELISA vào hộp ẩm có nắp đậy và ủ ở nhiệt độ 37°C trong 2 giờ Sau khi ủ, tiến hành rửa các giếng bằng dung dịch rửa (PBS-T) 4 lần.
Bước 2: Cố ủịnh dịch cõy vào bản ELISA
Nghiền mỗi mẫu 1g trong dung dịch chiết với tỷ lệ pha loãng 1/10 Sau đó, cho 200µl dịch chiết vào từng giếng của bản ELISA Đồng thời, thêm 200µl dung dịch đối chứng âm và 200µl dung dịch đối chứng dương vào các giếng đánh dấu riêng Ủ bản ELISA ở nhiệt độ 37°C trong 2 giờ Sau khi ủ, rửa các giếng bằng dung dịch rửa (PBS-T) 4 lần, mỗi lần trong 5 phút.
Bước 3: Cố ủịnh IgG liờn kết Enzyme
Hũa IgG liờn kết enzyme (IgG – E) trong dung dịch ủệm liờn kết Cho vào mỗi giếng 200àl Bản ELISA ủược ủ trong 2 giờ và rửa như bước 2
Bước 4: Cố ủịnh chất nền vào bản ELISA
Hũa chất nền NPP (nitrophenol phosphate) vào dung dịch ủệm subtra theo tỷ lệ ủó cho, sau đó nhỏ vào mỗi giếng 200µl Bản ELISA được ủ trong hộp ẩm ở nhiệt độ phòng Quan sát sự phản ứng màu ở các giếng, sau 1 giờ các giếng có màu vàng là dương tính, trong khi giếng không có màu là âm tính Kết quả được đọc chính xác hơn trên máy đọc ELISA ở bước sóng 405nm.
3.3.1.6 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu chất lượng
* ðịnh lượng ủường khử (phương phỏp iod-Ixekutz)
Nguyờn liệu: Dịch chiết ủược chuẩn bị theo phương phỏp Bertrand (phụ lục 7)
Tiến hành: lấy 2 bỡnh tam giỏc:bỡnh 1 (ủối chứng), bỡnh 2 (thớ nghiệm)
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 30
Cho vào bình 1: 5ml nước cất và bình 2: từ 2 – 5ml dịch chiết ủường Tiếp theo, cho vào mỗi bình 10ml K3Fe(CN)6 0.05N, đun sôi trong 1 phút trên bếp điện rồi để nguội Cuối cùng, thêm vào mỗi bình 10ml hỗn hợp (ZnSO4 + KI) và 10ml CH3COOH 10%.
Chuẩn ủộ bằng Na2S2O3 0.05N sẽ cho màu vàng rơm Thêm 3 giọt tinh bột (dung dịch sẽ chuyển sang màu xanh), tiếp tục chuẩn ủộ cho đến khi đạt màu trắng sữa hoàn toàn.