Luận văn thạc sĩ nghiên cứu xác định con lai soma khoai tây đánh gá đặc điểm sinh trưởng phát triển và khả năng chống chịu virus của chúng

ðặt vấn ủề

Khoai tây (Solanum tuberosum) là một trong những cây lương thực có giá trị cao, đứng thứ 5 thế giới về diện tích trồng và thứ 4 về sản lượng Tại Việt Nam, khoai tây đóng vai trò quan trọng trong vụ đông, thường được trồng theo chu kỳ luân canh với lúa xuân và lúa mùa sớm, là cây trồng lý tưởng cho vụ đông ở Đồng bằng Bắc Bộ.

Hầu hết các giống khoai tây ở Việt Nam hiện nay có năng suất thấp và phẩm chất ngày càng kém, chủ yếu do thoái hóa giống, với hai nguyên nhân chính là virus và sự lão hóa của giống Việc khắc phục tình trạng này sẽ góp phần quan trọng vào việc phát triển sản xuất khoai tây tại nước ta.

Phương pháp chọn tạo giống khoai tây truyền thống gặp nhiều khó khăn do tính chất tứ bội (2n=4xH), làm cho quá trình lai tạo và chọn lọc sau lai phức tạp hơn so với các cây trồng nhị bội Tuy nhiên, sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ tế bào thực vật, đã mở ra hướng đi mới để khắc phục những vấn đề này Theo Wenzel (1979), quá trình này bao gồm việc giảm độ bội xuống monoploid, chọn lọc cá thể lưỡng bội diploid và cuối cùng là dung hợp tế bào trần của hai tế bào thể diploid đã chọn lọc để tạo ra giống khoai tây mong muốn Sau khi dung hợp, việc xác định thể lai và tái sinh các thể lai thành cây hoàn chỉnh sẽ dẫn đến việc nhân giống mới có khả năng kháng virus.

Trên toàn cầu, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về việc tạo giống khoai tây kháng virus thông qua phương pháp dung hợp tế bào trần Nghiên cứu của N Fish, A Karp và M G K Jones (1988) đã tập trung vào việc áp dụng phương pháp xung điện để thực hiện dung hợp tế bào trần.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu về sự dung hợp giữa Solanum tuberosum và S brevidens, nhằm tạo ra con lai thông qua phương pháp isoenzyme để đánh giá khả năng kháng virus PLRV (Potato Leaf Roll Virus) Nghiên cứu của Naoto Kadotani và Keisuke Kasaoka (2004) cũng đã đạt được thành công trong việc dung hợp giữa Solanum tuberosum cv May Queen và S etuberosum, qua các bước tạo giống và xác định con lai.

RFLPs , ủỏnh giỏ tớnh khỏng virus, cuối cựng tạo cõy lai cú tớnh khỏng dũng virus PVY

Hiện nay, nghiên cứu về dung hợp tế bào trần và ứng dụng của nó ở Việt Nam vẫn còn ở giai đoạn đầu, chủ yếu tập trung vào quy trình tách, nuôi cấy, dung hợp, và tạo micro callus cũng như macro callus Để hoàn thiện nghiên cứu con lai soma sau dung hợp nhằm tạo giống khoai tây kháng bệnh virus, việc xác định con lai và đánh giá các chỉ tiêu sinh trưởng phát triển in vitro và in vivo, cũng như các đặc tính kháng virus là rất quan trọng Do đó, chúng tôi thực hiện luận văn: “Nghiên cứu xác định con lai soma khoai tây, đánh giá đặc điểm sinh trưởng và khả năng chống chịu virus của chúng.”

Mục ủớch và yờu cầu

Mục ủớch

Xỏc ủịnh ủược con lai soma sau dung hợp nhằm đánh giá các đặc tính có lợi theo tình trạng mong muốn, từ đó chọn lọc các giống để phát triển thành giống kháng virus phục vụ sản xuất.

Yêu cầu

+ Nghiờn cứu xỏc ủịnh con lai soma

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 3

- Xỏc ủịnh ủược ủộ bội con lai thụng qua phương phỏp Flow Cytometry

- Xỏc ủịnh con lai bằng kỹ thuật Iso enzym

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, tạo củ in vitro

- đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển, hình thành năng suất ủồng ruộng

- đánh giá các chỉ tiêu hóa sinh

- đánh giá khả năng kháng virus PVY của con lai soma, các dòng bố mẹ bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo và test ELISA

- đánh giá khả năng kháng virus (PVX, PVY) của con lai soma, các dòng bố mẹ bằng phương pháp chỉ thị phân tử.

í nghĩa khoa học và thực tiễn của ủề tài

Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu xác định chính xác con lai soma và đánh giá các đặc điểm nông sinh học, tính chống chịu virus là rất cần thiết để chọn lọc ra các giống khoai tây có phẩm chất tốt Điều này không chỉ giúp phát triển các giống khoai tây tiềm năng mà còn là cơ sở để hoàn thiện quy trình tạo giống khoai tây kháng bệnh virus thông qua dung hợp tế bào trần.

Ý nghĩa thực tiễn

Đề xuất thực hiện thử nghiệm rộng rãi các con lai soma nhằm đánh giá tính kháng bệnh và năng suất, từ đó tuyển chọn các dòng giống phù hợp nhất để phát triển thành giống sản xuất.

Giới hạn phạm vi nghiờn cứu ủề tài

Nghiên cứu sử dụng các dòng khoai tây bố mẹ có khả năng kháng virus PVX và PVY, nguồn gốc từ CHLB Đức, cùng với các con lai soma được tạo ra tại Viện Sinh học Nông nghiệp Mục tiêu của đề tài là đánh giá các đặc điểm sinh trưởng và phát triển của con lai soma so với bố mẹ mà chưa so sánh với các dòng giống khoai tây trồng trọt phổ biến.

Đề tài nghiên cứu xác định con lai soma được tạo ra, từ đó đánh giá các đặc điểm sinh trưởng phát triển và khả năng kháng virus của chúng Mục đích là giới thiệu các giống làm vật liệu cho công tác chọn giống khoai tây kháng virus PVX và PVY.

Giới thiệu chung về cây khoai tây

Nguồn gốc

Nghiên cứu tuổi carbon phúng xạ cho thấy khoai tây được trồng cách đây khoảng 8.000 năm trên bình nguyên Đông Nam Peru và Tây Bắc Bolivia Các cuộc thám hiểm của Liên Xô trước đây cũng xác nhận rằng trung tâm thứ hai của khoai tây có nguồn gốc từ Mexico, nơi hiện nay vẫn còn nhiều khoai tây dại được tìm thấy.

Trong các loài hoang dại họ hàng thì phức hợp S canasense/S Leptophys có mối quan hệ gần gữi nhất với các loài khoai tây trồng nhị bội

Phức hợp S tenotomum/S phureja là dạng nguyên thủy nhất trong các loài khoai tây trồng nhị bội (Nguyễn Văn Hiển, 2000)(4)

Khoai tây trồng trọt, thuộc loài S tuberosum, là một loài tứ bội Giống khoai tây này được du nhập vào Châu Âu vào năm 1570 và nhanh chóng lan rộng ra khắp thế giới Hiện nay, có tới 151 quốc gia trồng khoai tây (Hồ Hữu An, 2005).

Khoai tây được du nhập vào Việt Nam từ năm 1890 và chủ yếu trồng ở vùng đồng bằng Sông Hồng Loại cây này được trồng trong 11 phương thức luân canh với lúa và rau màu trong hệ thống canh tác tại đây Diện tích trồng khoai tây đã tăng từ 25.748 ha vào năm 1992 lên 35.000 ha vào niên vụ 2002 – 2003 Mức tiêu thụ khoai tây hàng năm tại Việt Nam khoảng 555.827 tấn, trong khi năng suất khoai tây có sự gia tăng chậm, dao động từ 10 – 12 tấn/ha.

Phân loại

Khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc loài S tuberosum, chi

Solanum, họ cà Solanaceae, bộ Solanales, phân lớp Asteridae, lớp

Magnoliopsida, thuộc ngành Magnoliophyta, bao gồm hơn 200 loài phân bố rộng rãi trên toàn cầu Sự đa dạng về loài và giống chủ yếu tập trung ở khu vực Trung-Nam Mỹ và Australia, trong đó có loài S tuberosum cùng với khoảng 7 loài trồng trọt khác.

Có nhiều cách để phân loại khoai tây, dựa vào đặc điểm hình thái thân, lá, hoa hoặc số lượng nhiễm sắc thể Theo J.G Hawker (1991), khoai tây được phân thành 18 nhóm, trong đó có 68 loài dại, nhưng chỉ có 8 loài được trồng trọt Các loài này được chia thành 4 nhóm chủ yếu dựa vào số lượng nhiễm sắc thể.

Trong các loài trên, loài S phueja Juz.et Buk có ý nghĩa lớn nhất với trồng trọt

S.x chaucha Juz Et Buk là dạng lai tự nhiên giữa S tuberosum subp.Andigena và

S.xjuzepczukii Buk Là dạng lai tự nhiên giữ S acuale và S snenotomum, phõn bố ở trung Peru ủến Nam Bolivia, cú khả năng khỏng bệnh

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 7 sương mai

Có 1 loài là : S tuberosum L Và 2 loài phụ là :

Subspecies Andigena (juz Et Buk) Hawkes

Có 1 loài là : S x curtilobum juz et Buk.

ðặc ủiểm thực vật học

Khoai tây trồng từ củ giống phát triển rễ chùm và có rễ cọc khi trồng bằng hạt, từ rễ cọc này sẽ phát triển nhiều rễ phụ khác Các thân ngầm dưới mặt đất, còn gọi là tia củ, cũng có khả năng ra rễ, mặc dù rễ này thường ngắn và ít phân nhánh Bộ rễ chủ yếu phân bố trên mặt đất canh tác từ 0 đến 40 cm, nhưng cũng có thể ăn sâu tới 1.5 – 2m.

Thân khoai tây mọc thẳng, có cấu tạo zích zắc với 3-4 cạnh, cao trung bình từ 40-70cm đến 1-1,2m Chiều cao của cây phụ thuộc vào giống và thời kỳ chăm sóc Thân cây thường có màu xanh, xanh nhạt hoặc xanh đậm, đôi khi có màu phớt hồng hoặc tím, tùy thuộc vào giống.

Lá cây hình thành và phát triển theo sự tăng trưởng của cây, có kích thước lớn với dạng lá kộp và xẻ lụng chim Lá thường mọc đối xứng qua trục, trong đó có một lỏ lẻ trên cùng lớn hơn được gọi là lỏ chột ủỉnh Màu sắc của lá phụ thuộc vào giống cây, thời vụ và điều kiện chăm sóc, có thể là màu xanh, xanh đậm hoặc xanh nhạt.

Hoa khoai tây thường mọc thành chùm và có cấu trúc lưỡng tính với 5 cánh hoa Chúng thường có màu trắng, nhưng cũng có thể là phớt hồng, tím, hồng, vàng hoặc các màu khác tùy thuộc vào từng loại và giống cây.

Quả khoai tây là loại quả mọng, có hình dạng cầu, hình trứng hoặc hình nún Vỏ của quả khoai tây có màu xanh nhạt, thường có sọc vằn hoặc màu vàng Bên trong quả có hai ngăn chứa hạt và thịt quả.

Hạt khoai tây rất nhỏ, với trọng lượng từ 0,7g đến 1g cho 1000 hạt Hạt có hình dạng ovan dẹt, bên ngoài là vỏ, bên trong chứa nội nhũ và phôi Phôi khoai tây có hình chữ U, bên trong chứa hai lá mầm phôi và rễ mầm.

Củ khoai tây, còn gọi là thận củ hay thận ngầm, là phần phát triển dưới đất trong điều kiện bóng tối Hình dạng của củ khoai tây có thể là tròn, ellip, tròn dài, hoặc hình vuông Màu sắc của củ phụ thuộc vào từng giống, có thể là màu trắng, trắng nhạt, vàng, hoặc vàng nhạt.

Mầm khoai tây phát triển từ điểm sinh trưởng của mắt củ, là cơ quan sinh sản vô tính của cây Màu sắc của mầm có thể khác nhau giữa các giống, thường là màu trắng hoặc tím, và khi tiếp xúc với ánh sáng, mầm sẽ chuyển sang màu xanh.

2.1.4 Giá trị dinh dưỡng khoai tây

Khoai tây được xem như “kho báu” không chỉ vì là thực phẩm cao cấp mà còn nhờ vào thành phần dinh dưỡng phong phú Củ khoai tây chứa tinh bột, protein, lipit, cùng nhiều loại vitamin như B1, B2, B3, B6, PP và C, cũng như các khoáng chất và axit amin tự do Ngoài ra, khoai tây còn có nhiều tính chất quý giá khác.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội cung cấp chương trình thạc sĩ khoa học nông nghiệp, tập trung vào các loại cây dễ trồng và dễ phát triển Những cây này không chỉ có chất lượng cao mà còn phong phú về giá trị sử dụng, bao gồm chế biến thực phẩm và làm thuốc chữa bệnh cho nhiều bệnh lý như viêm loét dạ dày, hành tá tràng, bệnh thần kinh, bỏng và quai bị.

Khoai tây là một loại cây dễ thích nghi và có năng suất cao, đồng thời phù hợp với chi phí đầu vào thấp Tất cả các bộ phận trên củ khoai tây đều chứa giá trị dinh dưỡng cao.

Theo nguồn: United States Department of Agriculture, National

Nutrient Database, 2008 cho biết thành phần dinh dưỡng trong 100 gam củ khoai tây sau khi luộc cả vỏ và nướng

Khoai tây không chỉ có giá trị lương thực và thực phẩm, mà còn là nguyên liệu quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp, bao gồm dược phẩm và mỹ phẩm Việc sử dụng khoai tây trong các lĩnh vực này cho thấy tầm quan trọng của nó đối với đời sống con người.

Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và trong nước

Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới

Vào thế kỷ XIX, khoai tõy thực sự ủược trồng phổ biến ở cỏc chõu lục với khoảng 151 nước Ngày nay, khoai tõy ủược trồng chủ yếu ở khu vực

Chõu Á, Chõu Âu cho năng suất và sản lượng lớn Số liệu ủược thể hiện qua bảng sau

Bảng 2.1 Diện tích, năng suất và sản lượng khoai tây các khu vực trên thế giới năm 2007 (FAOSTAT)

Diện tích thu hoạch (ha)

Theo bảng 2.1, khu vực Châu Á có diện tích trồng khoai tây lớn nhất với khoảng 8.732.961 ha, tiếp theo là Châu Âu với 7.473.628 ha, trong khi Bắc Mỹ có diện tích trồng ít nhất là 615.878 ha Tuy nhiên, Bắc Mỹ lại đạt năng suất khoai tây cao nhất với 41,2 tấn/ha, sản lượng đạt 25.345.305 tấn Châu Á đứng đầu về sản lượng khoai tây với 137.343.664 tấn, nhưng năng suất chỉ đạt 17,4 tấn/ha, trong khi Châu Âu xếp thứ ba về sản lượng với 15.682.943 tấn và năng suất 16,3 tấn/ha.

Khoai tây có nguồn gốc từ Nam Mỹ và đã được mở rộng trồng trọt sang các nước phát triển Hiện nay, khoai tây chủ yếu được trồng ở những quốc gia có khí hậu thuận lợi và nền nông nghiệp phát triển, nhờ vào giá trị dinh dưỡng cao và khả năng thích ứng với nhiều loại đất.

Khoai tây được xem là cây lương thực tiềm năng cho các nước nghèo và đang phát triển, đặc biệt khi giá lúa gạo và lúa mì tăng cao Theo FAO (2006), khoai tây cung cấp nguồn dinh dưỡng phong phú với chi phí thấp, giúp cải thiện an ninh lương thực Hơn nữa, FAO (2005) cũng chỉ ra rằng khoai tây tạo ra khối lượng sinh học và năng lượng cao hơn bất kỳ loại cây trồng lương thực nào (trừ lúa gạo, ngô, lúa mì) trong thời gian ngắn trên cùng một đơn vị diện tích.

Khoai tây là cây trồng có tiềm năng phát triển lớn trong tương lai, với diện tích trồng ngày càng mở rộng và năng suất, chất lượng ngày càng cao, đặc biệt tại các nước đang phát triển cũng như những quốc gia nghèo.

Bảng 2.2 Sản lượng khoai tõy trờn thế giới giai ủoạn 1991 – 2007 (triệu tấn) (FAOSTAT)

Qua bảng 2.2 cho biết: Từ năm 1991- 2003 sản lượng khoai tây ở các nước ủang phỏt triển tăng liờn tục từ 84,86 triệu tấn (1991) – 152,11 triệu tấn

Từ năm 2003, sản lượng khoai tây ở các nước đang phát triển đã tăng trưởng mạnh mẽ hơn so với các nước phát triển, mặc dù sản lượng của họ thấp hơn Các nước đang phát triển mở rộng diện tích trồng nhưng năng suất không cao, trong khi các nước phát triển có diện tích thu hẹp nhưng năng suất cao hơn nhờ vào vốn đầu tư lớn và kinh nghiệm trồng trọt lâu năm Đến năm 2005, sản lượng khoai tây ở các nước đang phát triển lần đầu tiên vượt qua sản lượng ở các nước phát triển, trong đó Trung Quốc dẫn đầu với 72 triệu tấn vào năm 2007, chiếm 1/3 sản lượng khoai tây toàn cầu Mặc dù có diện tích trồng lớn, năng suất ở các nước đang phát triển vẫn kém do nguồn giống không đảm bảo chất lượng, củ giống không rõ nguồn gốc và dễ bị nhiễm bệnh, đặc biệt là virus, sau vài năm trồng, dẫn đến sự thoái hóa giống nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất và chất lượng củ.

Các nhà nghiên cứu đang xây dựng chiến lược sản xuất giống khoai tây sạch bệnh và chất lượng cao nhằm phục vụ cho việc sản xuất khoai tây thương mại.

Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam

Khoai tây được người Pháp đưa vào Việt Nam vào năm 1890 và đã được trồng rộng rãi, chủ yếu ở lưu vực Đồng Bằng Sông Hồng Tuy nhiên, trong vài năm gần đây, diện tích và sản lượng khoai tây tại khu vực này và một số địa phương khác đã giảm đáng kể, nguyên nhân chủ yếu là do thiếu nguồn giống tốt.

Ngành sản xuất khoai tây hiện đang đối mặt với thách thức lớn nhất là vấn đề giống Hiện tại, giống khoai tây trong nước chỉ đáp ứng khoảng 20 - 25% nhu cầu, trong khi phần còn lại phải được nhập khẩu từ Trung Quốc, Hà Lan và các quốc gia khác.

Hiện nay, giống khoai tây mà người dân sử dụng hầu hết do nông dân tự

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội cho thấy rằng việc duy trì giống khoai tây từ vụ này sang vụ khác hoặc sử dụng giống không rõ nguồn gốc đã dẫn đến tình trạng thoái hóa giống và tỷ lệ nhiễm virus cao từ 54-65% Thêm vào đó, hao hụt trong quá trình bảo quản giống lên đến 45-60% Khoai tây chủ yếu được trồng bằng củ giống vụ trước, do đó tỷ lệ nhiễm virus vẫn cao Trong điều kiện sản xuất tại Việt Nam, củ giống thường được bảo quản trong khoảng 9 tháng (từ tháng 2 đến tháng 10), và trong điều kiện nóng ẩm của mùa hè, củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, dẫn đến khả năng sinh trưởng kém và ảnh hưởng tiêu cực đến năng suất cũng như chất lượng củ.

Việc sản xuất và cung ứng giống khoai tây ở Việt Nam hiện nay còn nhỏ lẻ và thiếu tính hệ thống Do đó, cần thiết phải xây dựng các chương trình nhân giống khoai tây sạch bệnh, đảm bảo chất lượng và phẩm chất tốt để phục vụ cho nông dân.

Bệnh virus hại khoai tây và biện pháp khắc phục

Tác hại của bệnh virus

Virus khoai tây được đánh giá là một tác nhân gây bệnh nguy hiểm, làm giảm đáng kể năng suất và chất lượng củ Bệnh virus này có những đặc tính đặc trưng gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sự phát triển của cây trồng.

Bệnh khô héo do virus gây ra không thể chữa trị khi cây trồng đã bị nhiễm Virus xâm nhập vào cây khiến chúng không thể thực hiện quá trình trao đổi chất bình thường và dẫn đến sự chết dần của cây.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội nghiên cứu về luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, tập trung vào tác động của virus đến tế bào ký chủ Tế bào ký chủ có vai trò quan trọng trong việc nhận virus, do đó, bất kỳ tác nhân nào ngăn chặn sự sao chép của virus cũng sẽ ức chế quá trình tổng hợp của tế bào ký chủ.

Bệnh virus khoai tây có tính di truyền, với khả năng lây lan khác nhau giữa các giống cây Ở những giống cây truyền thống, virus thường lây qua hạt, trong khi ở giống cây hiện đại, virus có mặt trong mọi tế bào, dễ dàng lây lan Khi virus xâm nhập, chúng nhân lên và di chuyển theo dòng nhựa, ảnh hưởng đến tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả củ con Một củ mẹ bị nhiễm sẽ tạo ra cây bệnh, dẫn đến việc các thế hệ củ con cũng bị nhiễm virus Sự lây lan của bệnh diễn ra âm thầm, khó phát hiện trong suốt quá trình sống của cây, gây ra sự gia tăng nhanh chóng qua các năm.

Bệnh virus được lây lan qua các vector truyền bệnh và tiếp xúc cơ giới Tùy thuộc vào từng kiểu truyền bệnh của côn trùng, virus có thể được truyền ngay lập tức hoặc có thời gian tiềm ẩn trong cơ thể côn trùng từ khi tiếp nhận virus cho đến khi lây sang cây mới.

Nhiễm virus ở khoai tây dẫn đến hiện tượng thoái hóa giống, làm giảm năng suất gieo trồng, củ nhỏ lại về kích thước và trọng lượng, chất lượng củ kém và hàm lượng dinh dưỡng giảm Thân lá bị biến dạng, giảm khả năng quang hợp, và nếu hiện tượng này kéo dài, có thể dẫn đến tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây Bên cạnh đó, củ giống bị già sinh lý do bảo quản lâu trong điều kiện ẩm ướt cũng góp phần vào sự thoái hóa Virus là nguyên nhân chính gây ra hiện tượng này, với các loại virus như PLRV, PVY và PVX gây thiệt hại nghiêm trọng ở Anh.

Trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 17 trung bình từ 30 – 50 triệu pound mỗi năm

Khoai tây khi nhiễm virus PLRV làm sản lượng củ bị giảm khoảng 20 triệu tấn/ha mỗi năm trên thế giới

Theo Banttari et al (1993)(14) khi củ khoai tây bị nhiễm virus PVY và PLRV dẫn tới năng suất giảm 80%

Người trồng khoai tây hiện nay sử dụng nhiều thuốc trừ sâu để tạo ra củ sạch bệnh và kiểm soát côn trùng truyền bệnh Tuy nhiên, nghiên cứu của Jones et al (1982), Debok và Vander want (1987), và Valkonen et al (1992) cho thấy việc dùng thuốc trừ sâu để kiểm soát virus không hiệu quả Việc này không chỉ không mang lại hiệu quả trong việc phòng bệnh mà còn làm tăng tính kháng thuốc của côn trùng, dẫn đến sự xuất hiện của nhiều loài mới và gây hại cho hệ sinh thái nông nghiệp cũng như môi trường sống Đặc biệt, dư lượng thuốc trên củ khoai tây có thể ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng.

Hướng ủi theo con đường tạo giống khoai tây không virus và không vector truyền bệnh được xem là giải pháp tối ưu Phương pháp này đang nhận được sự quan tâm, chú ý từ nhiều nhà nghiên cứu nhằm bảo vệ cây khoai tây cũng như các loại cây trồng khác.

Giải pháp khắc phục

2.3.3.1 Các giải pháp về canh tác

Để đối phó với tác hại của bệnh virus trên cây khoai tây, các nhà nghiên cứu đã đề xuất một số giải pháp nhằm canh tác phòng trừ sự nhiễm bệnh virus khoai tây hiệu quả.

• Loại bỏ nguồn cây, củ bị nhiễm virus

• Hạn chế tối ủa sự nhõn lờn và lan rộng của phõn tử virus

Trồng xen canh và luân canh các loại cây trồng có khả năng kháng virus là một phương pháp hiệu quả để xua đuổi côn trùng truyền bệnh virus Bên cạnh đó, việc áp dụng biện pháp dựng côn trùng để kiểm soát vector truyền virus cũng là một lựa chọn, tuy nhiên phương pháp này có chi phí khá cao (Corsini et al 1994; Valkonen et al 1992).

• Hay sử dụng giải pháp phun xịt dầu khoáng dể ngăn chặn vector truyền virus theo kiểu không bền vững (R.M.Solomon-blackburn và H.Barker, 2000)(48)

Ngoài ra, việc áp dụng biện pháp trồng trọt cũng có hiệu quả khắc phục sự thoái hóa khoai tây do nhiễm virus (Guilley và Lehingrat,1986 )(17)

Chọn vùng trồng cây phù hợp với khí hậu ôn hòa và mát mẻ, nơi có gió thường xuyên giúp ngăn ngừa rệp Nên tránh trồng lại ở các khu vực đã từng trồng cây họ cà trước đây.

• Sử dụng các giống sạch thay cho giống bị bệnh trước, thường xuyên kiểm tra và vệ sinh ủồng ruộng, nhổ bỏ cõy bị bệnh

Chủ động phòng chống mũi truyền bệnh là rất quan trọng, vì vậy cần áp dụng các biện pháp kỹ thuật cạnh tác, biện pháp phòng trừ tổng hợp và biện pháp sinh học để đạt hiệu quả cao trong việc phòng trừ.

2.3.3.2 Giải pháp công nghệ sinh học

A Tạo giống khoai tây chuyển gen kháng virus

- Tính kháng bắt nguồn từ gen Cp (CPMR-Coat Protein Mediated Resistance)

Việc chuyển gen sinh protein vỏ virus vào khoai tây nhằm tạo ra giống khoai tây kháng virus là một nghiên cứu tiên tiến trong lĩnh vực nông nghiệp Hướng nghiên cứu này không chỉ giúp tăng cường khả năng chống chịu của cây trồng mà còn mở ra tiềm năng phát triển giống khoai tây mới, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng nông sản.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu về luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp, đặc biệt là việc chuyển nạp gen Cp của virus PVX vào cây khoai tây Nghiên cứu của Hemenway (1988) cho thấy rằng việc này giúp tạo ra giống khoai tây có khả năng chống chịu với virus PVX, góp phần nâng cao năng suất và chất lượng cây trồng.

Cơ chế của tính kháng là chống lại sự tích lũy virus trong cây Kawchuk et al (1991)(28) chứng minh nồng ủộ virus PLRV ở cõy chuyển gen

Cp rất thấp chỉ khoảng 1% giống như cõy ủối chứng trong giai ủoạn tiền xõm nhiễm

Tính khả dụng của CPMR thường liên quan đến khả năng chống virus, nhưng không phải tất cả các loại virus đều bị ảnh hưởng (Okanoto et al 1996) Cụ thể, nhiều loại virus khác nhau có thể không bị ảnh hưởng, đặc biệt là với các virus mang gen chuyển đổi.

Một số giống cây chuyển gen đã được kiểm tra về khả năng kháng virus trên đồng ruộng và xác nhận khả năng kháng virus PLRV tại Australia (Graham et al, 1993), Mỹ (Thomas et al, 1997) và Canada (Kawchuk et al, 1991).

(28) và kháng virus PVX ở Switzerland (Mal noe et al, 1994)(32), ở Hà Lan (Van Den Elzen et al, 1993)(54)

Tính kháng CPMR chỉ hiệu quả đối với nhóm virus xâm nhập qua lỗ nhiễm cơ giới, không có tác dụng với virus truyền qua tuyến nước bọt, đặc biệt là trong trường hợp virus PVY (Lawson et al).

1990) và kháng TRV (Ploeg et al, 1993)(44)

-Tính kháng bắt nguồn từ protein di chuyển

Virus mã hóa một số loại protein di chuyển, hỗ trợ sự lây lan của virus trong cây Việc ức chế các phân tử protein này là mục tiêu chính trong việc tạo giống kháng virus.

Năm 1996, Tacke đã chuyển gen ORF của virus PLRV vào cây khoai tây, gen này mã hóa protein pr17, giúp virus di chuyển trong mạch phloem Cây khoai tây đã được chuyển gen có biểu hiện đột biến protein, mang lại tiềm năng mới trong nghiên cứu và ứng dụng di truyền cây trồng.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu về tính kháng của cây chuyển gen đối với virus PLRV, PVX và PVY Kết quả cho thấy, cây chuyển gen có khả năng kháng virus PLRV, với lượng virus trong cây giảm rõ rệt, trong khi không có khả năng kháng PVX và PVY Nghiên cứu chỉ ra rằng tính kháng đối với PLRV được kiểm soát ở mức RNA, trong khi tính kháng đối với PVX và PVY lại phụ thuộc vào protein gây bệnh Do đó, những cây tích lũy protein này có thể không bị lây nhiễm bởi nhiều loại virus khác nhau, nhưng cơ chế kháng này không đặc hiệu với từng loại virus.

- Tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản (Replicase (polymerase) mediated resistance)

Vào năm 1990, nhà khoa học Golemboski đã chuyển gen polymerase của virus TMV vào cây khoai tây, tạo ra tính kháng virus thông qua cơ chế "tính kháng bắt nguồn từ gen tái bản polymerase" Nhiều nghiên cứu sau đó đã chuyển các kiểu gen polymerase của RNA virus, áp dụng cơ chế tương tự để chống lại nhiều loại virus khác nhau như virus PVX và PVY Nguyên lý phản ứng kháng là ức chế quá trình tái bản của virus Nghiên cứu của Monsanto vào năm 1994 đã chuyển gen polymerase PLRV vào khoai tây, cho ra các dòng chuyển gen biểu hiện toàn bộ gen polymerase và kháng tốt với virus PLRV Tuy nhiên, cơ chế kháng này vẫn chưa được hiểu rõ ràng.

- Tính kháng theo cơ chế làm câm gen hậu phiên mã (PTGS-

Trong một số trường hợp tính kháng chuyển gen bắt nguồn từ quá trình

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đang nghiên cứu luận văn thạc sĩ về khoa học nông nghiệp, trong đó nhấn mạnh rằng phiên mã RNA có ưu thế hơn so với phương pháp gen mã hóa protein và một số phương pháp khác Theo Dougherty (1994), các cây chuyển gen đã được áp dụng trong nghiên cứu này.

Virus TEV (Tobacco etch potyvirus) không thể phát hiện được sự kháng hoặc nhiễm sau vài tuần lây nhiễm do sự phân giải RNA của gen chuyển xảy ra trong cây, dẫn đến giảm lượng RNA mặc dù gen chuyển vẫn được phiên mã Nghiên cứu của Mueller (1995) cho thấy rằng cây có tính kháng cao nhất với virus PVX lại có lượng polymerase thấp nhất, trong khi số bản sao của gen chuyển nhiều Tính kháng không ảnh hưởng đến sự phiên mã của gen chuyển, mà cơ chế ở đây là sự làm câm gen sau phiên mã (PTGS) PTGS không chỉ được kích thích bởi gen chuyển mà còn bởi virus (Baulcombe 1996), và dường như là phản ứng phòng thủ chung của cây trồng, có thể được giải thích qua nhiều cơ chế bảo vệ xuất phát từ tác nhân gây bệnh Nguyên lý của cơ chế PTGS được mô tả qua quá trình phân giải đặc hiệu gen chuyển mRNA và RNA mục tiêu, yêu cầu hai trình tự RNA có mức tương đồng cao (English et al.).

Các nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần

Nghiên cứu về tạo giống khoai tây kháng virus bằng dung hợp tế bào trần trên thế giới

Việc phát triển các giống khoai tây kháng virus là giải pháp lý tưởng để chống lại sự thoái hóa do virus gây ra Điều này không chỉ giúp bảo vệ cây trồng mà còn nâng cao năng suất và chất lượng nông sản.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu về việc tạo giống khoai tây chống chịu virus trong gần một thế kỷ Các nghiên cứu tập trung vào việc phát triển giống chống virus Y và virus cuốn lá (PLRV), do khó khăn trong việc phòng chống các mô giới truyền bệnh như rệp Quá trình chọn tạo giống khoai tây Solanum tuberosum L gặp nhiều thách thức về di truyền, đặc biệt với tỷ lệ phân ly lớn sau lai tạo, khiến việc chọn lọc trở nên khó khăn Việc tạo ra một giống mới tốn ít nhất 10 năm và thường gặp mất mát về đặc tính di truyền trong quá trình lai tạo Chase đã đề xuất một phương pháp tạo giống khoai tây nhị bội (2n=2x NST) từ giống tứ bội, giúp đơn giản hóa tỷ lệ phân ly và tạo ra giống mới hiệu quả hơn Kỹ thuật nuôi cấy hạt phấn từ giống nhị bội cũng cho phép thu được giống đơn bội (1n=1x NST), là nguyên liệu quan trọng cho việc phát triển giống khoai tây chống chịu.

Tuy nhiên chọn tạo giống trên cơ sở những dòng nhị bội này gặp phải hai khó khăn chính :

+ Khả năng thụ tinh của cỏc thể nhị bội bị giảm mạnh ,ủụi khi bất thụ

Khi trở lại hình thức trồng trọt tứ bội bằng cách nhân giống đơn giản các thể nhị bội, sẽ dẫn đến giảm độ heterozygote, từ đó làm giảm sức sống và năng suất của cây tứ bội (Nguyễn Quang Thạch, 1993).

Hầu hết khoai tây hiện nay thuộc nhóm cây tứ bội (2n=4xH) Để thực hiện lai soma bằng kỹ thuật nuôi cây bao phấn, cần giảm độ bội xuống mức nhị bội trước.

Sơ ủồ tạo giống khoai tây áp dụng các kỹ thuật hiện đại như lai tạo, nuôi cấy bao phấn, nhị bội hóa và dung hợp tế bào trần để phát triển giống cây trồng chất lượng cao (Wenzzel et al 1976)(58).

Cỏc dũng tứ bội khởi ủầu (4x )

Sự ra đời của sơ đồ tạo giống tổng hợp phân tích của Wenzel et al (1979) đánh dấu một bước ngoặt quan trọng trong việc kết hợp các phương pháp kinh điển và hiện đại trong công tác giống khoai tây.

Tạo dòng nhị bội nhờ kỹ thuật parthenogen etic a * 1 a a * 2 a a * 3 a a * 4 a

Tạo dũng ủơn bội bằng nuụi cấy hạt phấn – nhị bội húa tạo 2x a * 1 a * 1 a * 2 a * 2 a * 3 a * 3 a * 4 a * 4

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội nghiên cứu về sự dung hợp tế bào trần nhị bội (2x) để tạo ra con lai soma tứ bội (4x), giúp hình thành giống cây ổn định (Diemling, 1989) Phương pháp này không chỉ cải thiện khả năng nhân giống mà còn khắc phục rào cản di truyền giữa các loài cây xa nhau.

Nghiên cứu về tỏi sinh tế bào trần khoai tây đã thu hút sự quan tâm của nhiều tác giả (Binding và Nehls, 1977; Binding et al, 1978; Bokemaln và Roest, 1983; Schuchman, 1985) Theo giáo sư Wenzel, các công trình nghiên cứu về dung hợp tế bào trần ngày càng gia tăng Một nghiên cứu nổi bật của Melchers et al (1978) về lai soma giữa loài khoai tây S tuberosum và cà chua Lycopersicon esculentum đã mở ra hướng đi cho hàng loạt nghiên cứu về dung hợp giữa khoai tây dại và khoai tây trồng, điều mà trước đây không thể thực hiện bằng phương pháp lai hữu tính Butenko và Kuchko (1980) cũng đã đóng góp vào lĩnh vực này.

Nghiên cứu về việc dung hợp tế bào trần S tuberosum với S chacoense đã tạo ra con lai soma có khả năng kháng virus PLRV, như được chỉ ra bởi Browwn và Thomas (1979) Nhiều tác giả, bao gồm Barsby et al (1984), Austin et al (1985), Helgeson et al (1986) và Fish et al (1987), đã tập trung vào việc sử dụng S brevidens như một đối tác nghiên cứu do giống này có khả năng chống chịu tốt với virus PVX và PVY Các nghiên cứu tiếp theo đã tiến hành lai soma giữa S brevidens và S tuberosum nhằm tạo ra con lai có khả năng kháng cả hai loại virus này.

Việc xác định các con lai soma heterozygote là rất quan trọng sau quá trình dung hợp tế bào trần Đầu tiên, cần xác định độ bội của các thể lai bằng các phương pháp di truyền như AFLP, RAPD, RELP, PCR, và Isozym, giúp xác định chính xác con lai soma heterozygote với sự kết hợp bộ genome của cả bố và mẹ Ngoài ra, để xác định con lai soma, một số tác giả cũng đã đề xuất nghiên cứu thành phần và hàm lượng alkaloid trong cây lai.

Nghiên cứu của Pehu et al (1990) về dung hợp protoplast giữa S tuberosum và S brevidens đã tạo ra con lai soma Để xác định thành phần SGAA (Steroidal Glycoalkaloid Aglycone) của cây lai, các nhà nghiên cứu đã tiến hành phân tích Kết quả cho thấy các thành phần alkaloid từ bố mẹ, bao gồm solanidine và slanthrene của S tuberosum cùng tomatidine của S brevidens (Laurila et al 1996), đều có mặt trong cây lai So với bố mẹ, thành phần SGAA trong cây lai cao hơn S tuberosum nhưng hàm lượng chỉ khoảng 20 mg/100g tươi.

N.Q.Thach, U Frei và G Wenzel (1993)(42) ủó tạo thành cụng con lai soma mang ủặc tớnh khỏng virus giữa cỏc nhúm khoai tõy thuộc loài Solanum tuberosum L, xỏc ủịnh con lai soma bước ủầu ủỏnh giỏ ủộ bội bằng phương phỏp ủếm nhiễm sắc thể, sau ủú tiến hành phấn tớch isozym esterase và peroxidase (Deimling et al 1988), kỹ thuật RFLP (Enzyme cắt là EcoRI) Kết quả cho thấy cỏc con lai ủều cú sự biểu hiện của 2 allele trội ủơn gen Rx và

Ry từ bố mẹ dung hợp (partners)

Với tổ hợp lai ủiển hỡnh giữa S tarnii (2n=2x$) và S etuberosum cv

Việc tạo ra con lai soma thông qua dung hợp tế bào đã được thực hiện thành công Con lai soma được xác định bằng phương pháp Flow Cytometry và kỹ thuật SSR, kết hợp với chỉ thị AFLP và phân tích hình isozym Tất cả các cây lai soma đều thể hiện khả năng kháng mạnh mẽ đối với virus PVY và nấm P infestans, thể hiện qua phản ứng siêu nhạy (HR-hypersensitive reaction).

BC1 và BC2 thể hiện khả năng kháng virus và nấm mạnh mẽ, với tính kháng này duy trì ổn định ở cả con lai và thế hệ BC.

Bảng 2.4 Tổng hợp nghiên cứu dung hợp protoplast trên cây khoai tây

Các kiểu dung hợp Lý do dung hợp Tác giả

Tổ hợp ủặc tớnh tốt, trưởng thành muộn, sản lượng cao

Tổ hợp gen kháng Rx và Ry trong thể lai soma tứ bội

Tổ hợp tính chất sản lượng cao và hỡnh dạng củ ủẹp cùng với tính kháng tuyến trùng có khả năng kết bào xác

Solanum tuberosum dihaploid + Solanum tuberosum dihaploid

Tạo thể lai dị nhân tứ bội Austin et al 1985b,

Warra et al 1989, Karlsson and Eriksson 1988, Chaput et al 1990 (56)

Solanum tuberosum dihaploid + S brevidens dihaploid

Chuyển gen kháng bệnh thối mềm củ khoai tây do nấm Erwinia vào quỹ gen của khoai tây

Chuyển gen kháng bệnh virus PVY vào quỹ gen của khoai tây

Chuyển gen kháng bệnh virus PRLV sang quỹ gen của khoai tây trồng

Chuyển gen kháng bệnh virus PRLV tới quỹ gen của khoai tây trồng

S tuberosum + S nigrum Chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ atrazine sang quỹ gen của khoai tây

Tạo thể lai soma giữa khoai tây và cà chua

Nghiờn cứu sự ủào thải nhiễm sắc thể trong thể lai soma

Nghiên cứu sự mất nhiễm sắc thể trong thể lai soma

2.4.2 Một số kết quả nghiên cứu dung hợp tế bào trên trên cây khoai tây ở Việt Nam

Việt Nam đang từng bước tiếp cận và nghiên cứu kỹ thuật dung hợp tế bào trần nhằm tạo ra giống khoai tây kháng virus và các bệnh cũng như một số sâu hại nguy hiểm khác, trong bối cảnh thế giới đã có nhiều tiến bộ và thành tựu trong lĩnh vực cải tạo giống cây trồng.

ðối tượng, vật liệu, ủịa ủiểm và thời gian nghiờn cứu

Nghiên cứu được thực hiện trên 9 dòng khoai tây, bao gồm các dòng bố mẹ có nguồn gốc từ Bayer, CHLB Đức, và các con lai soma được tạo ra thông qua quá trình dung hợp tế bào trần tại Viện Sinh học Nông nghiệp thuộc Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội.

Tên dòng bố mẹ Tên dòng con lai

Dòng 76 và 79 là con lai soma giữa hai dòng A15 và A41

Dòng 81-2 là con lai soma giữa hai dòng A16 và B186

Dòng 21-1 là con lai soma giữa hai dòng B186 và B208 ðặc tính kháng virus của các dòng bố mẹ như sau:

Dòng Gen kháng virus X (PVX) Gen kháng virus Y (PVY)

Chú thích: (+): Có gen kháng

Các dòng lai cây in vitro được nuôi cấy trên môi trường MS cơ bản với chu kỳ chiếu sáng 16 giờ mỗi ngày và nhiệt độ ủ là 18 - 22 độ C Các dòng bố mẹ cũng được nuôi cấy trong điều kiện tương tự để làm vật liệu đối chứng cho các con lai soma.

- Cõy khoai tõy bị nhiễm virus ngoài ủồng ruộng

- Cây chỉ thị: cây thuốc lá

3.1.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng cho nghiên cứu

- Hóa chất nuôi cấy mô (phụ lục 1)

- Hóa chất dùng chiết tách DNA (phụ lục 2)

- Hóa chất dùng chiết isozyme (phụ lục 3)

- Thành phần cho phản ứng PCR (phụ lục 4)

- Thành phần cho kỹ thuật ủiện di (phụ lục 5)

- Hóa chất dùng cho lây nhiễm virus PVY (phụ lục 6)

- Hóa chất dùng cho test ELISA (phụ lục 7)

- Các dụng cụ và máy móc cần thiết cho các thí nghiệm: Cối xứ, pipet, cõn vi lượng, mỏy ủiện di, mỏy PCR, mỏy ly tõm, mỏy xung ủiện

Đề tài nghiên cứu được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học khoai tây, thuộc vườn thực nghiệm của Viện Sinh học Nông nghiệp (IAB) – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội.

Thời gian nghiờn cứu từ thỏng 8 năm 2010 ủến thỏng 5 năm 2011

Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Xỏc ủịnh con lai soma trong phũng thớ nghiệm

3.2.1 đánh giá ựộ bội bằng phương pháp Flow Cytometry

3.2.2 Xỏc ủịnh con lai bằng phương phỏp Iso enzym

Nội dung 2: đánh giá ựặc tắnh kháng virus PVX, PVY của con lai soma bằng phương pháp chỉ thị phân tử

3.2.3 đánh giá tắnh kháng virus PVX, PVY thông qua chỉ thị phân tử

Nội dung 3: đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển và hình thành củ trong in vitro của con lai soma

3.2.4 đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của con lại soma trong ủiều kiện in vitro

3.2.5 đánh giá khả năng hình thành củ in vitro của con lai soma

Nội dung 4: đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển và hình thành năng suất con lai soma trong ủiều kiện in vivo

3.2.6 đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển của con lai trong chậu vại

3.2.7 đánh giá khả năng hình thành năng suất của con lai trong chậu vại

Nội dung 5: đánh giá các chỉ tiêu hóa sinh dòng 76, 79 và bố mẹ

3.2.8 ðịnh lượng ủường khử, ủường tổng số, vitamin C…

Nội dung 6: đánh giá khả năng kháng virus PVY thông qua lây nhiễm nhân tạo, test ELISA

3.2.9 đánh giá khả năng kháng virus PVY qua lây nhiễm nhân tạo và test ELISA

Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương phỏp ủỏnh giỏ ủộ bội bằng phương phỏp ủịnh lượng DNA nhân nhờ sử dụng máy Flow Cytometry

Quy trỡnh ủỏnh giỏ mức ủa bội của tế bào thực vật (phụ lục 8)

3.3.2 Phương phỏp xỏc ủịnh con lai soma hetezygote bằng isozym

Kết quả từ phân tích qua máy Flow cytometry cho phép chúng ta lọc ra những dòng tứ bội Tuy nhiên, không phải tất cả các dòng tứ bội đều là con lai dị nhọn (heterozygous) Để xác định chính xác con lai dị nhọn, cần áp dụng nhiều phương pháp khác nhau Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xác định con lai soma heterozygous bằng phương pháp isozym với hệ enzyme esterase.

Sử dụng mẫu lá từ cây in vitro sau khoảng 3 tuần tuổi, cân khoảng 200

Để chuẩn bị mẫu, cho 300 mg vào cối sứ và bổ sung chất nghiền theo tỷ lệ 1:1, sau đó tiến hành nghiền đều cho đến khi hỗn hợp đồng nhất Cần lưu ý rằng dụng cụ, hóa chất và quy trình nghiền mẫu phải được giữ ở điều kiện lạnh Sau khi nghiền, chuyển toàn bộ dịch mẫu vào ống Eppendorf và ly tâm mẫu hai lần ở tốc độ 12000 rpm trong điều kiện lạnh (4°C) Ly tâm lần đầu trong 10 phút, sau đó dùng pipet hút dịch ở phía trên chuyển sang ống Eppendorf mới và tiếp tục ly tâm lần hai trong 5 phút Dịch enzyme thu được nên được bảo quản trong tủ lạnh sâu -20°C để sử dụng nhiều lần, và nên chia thành nhiều ống khác nhau để bảo quản dần.

Chuẩn bị gel polyacrylamide và ủiện di:

Ngày đầu tiên tiến hành ủ bản gel, cần chuẩn bị các dung dịch hóa chất cần thiết cho gel tách và gel cụ Sau đó, lắp các bản kính (thường sử dụng 2 bản gel) và tiến hành ủ lớp gel tách.

Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đang nghiên cứu về quy trình ủ gel trong lĩnh vực khoa học nông nghiệp Quá trình bắt đầu bằng việc phủ một lớp nước lên bề mặt, sau đó tạo ra lớp gel tách Tiếp tục bổ sung lớp gel cụ lên trên lớp gel tách và cắm lược Quá trình này được thực hiện cho đến khi lớp gel cụ hoàn thành, sau đó đưa bản gel vào buồng ủ, ngập nước và giữ trong tủ lạnh trong một khoảng thời gian nhất định.

Vào ngày thứ hai của quá trình chạy ủiện di, hãy lấy buồng ủiện di từ tủ lạnh và đổ nước ủi vào sao cho ngập bản gel Sau đó, rút lược từ từ khỏi bản gel và tra mẫu vào các giếng ủiện di Cuối cùng, thực hiện chạy ủiện di isozym trong điều kiện lạnh với thời gian đầu "chạy" ở 50V + 70mA trong 30 phút để ổn định, sau đó chuyển sang "chạy" trong điều kiện 200V + 70mA trong 4 giờ.

Sau khi hoàn tất thời gian chạy điện di, tiến hành nhuộm gel để thu được kết quả Tùy thuộc vào từng loại isozym, cần sử dụng các cơ chất và thuốc nhuộm đặc trưng, cùng với dung dịch điện di và thành phần gel phù hợp (phụ lục 3).

Sau khi lấy bản gel ra khỏi khuôn, cho gel vào đĩa thủy tinh và ủ với dung dịch I trong 30 phút ở nơi tối Sau đó, loại bỏ dung dịch I và tiếp tục thực hiện các bước cần thiết.

II vào ủ trong tối cho tới khi xuất hiện vạch thì bỏ dung dịch nhuộm, rửa bằng nước cất nhiều lần Cố ủịnh gel bằng dung dịch axit axetic 7%

Thành phần dung dịch trong phương pháp nhuộm isoenzym esterase như sau: Dung dịch I (cơ chất):

Hòa tan trong 1,6ml dung dịch axeton 50% lên thể tích tới 20ml bằng Tris-HCl 0,05M, PH=7,1

Dung dịch II (thuốc nhuộm):

Cân Fast blue RR hòa tan trong 2ml methanol trong 10 phút, lên thể tích 20ml bằng Tris-HCl 0,05M, PH=7,1

3.3.3 Phương phỏp ủỏnh giỏ ủặc tớnh khỏng virus PVX, PVY của con lai soma bằng chỉ thị (marker) phân tử

Phương pháp ủng giỏ tính không virus ở mức ủộ phõn tử sử dụng cặp mồi chung đặc hiệu của gen không ủú để phát hiện sự có mặt của gen kháng, cụ thể là gen Ry sto - gen kháng PVY trong con lai soma.

Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA tổng số của GS Hans – Joerg Jacobsen trường ðại học Hannover (phụ lục 9)

Sau khi tách chiết DNA, cần kiểm tra độ nguyên vẹn của DNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% Tiếp theo, thực hiện thí nghiệm chạy phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Cuối cùng, kiểm tra sự có mặt của gen mong muốn bằng kỹ thuật điện di phát hiện vạch băng.

Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) và ủiện di sản phẩm PCR

Cặp mồi STM 003-111 nhằm phát hiện gen kháng virus PVY (Ye-Su Song,

Trình tự mồi: PrimerF:AATTGTACTCTGTGTGTGTG

Cặp mồi GM339 nhằm phát hiện gen kháng virus PVX PVX (Marano MR,

- Thành phần cho 1 phản ứng PCR (phụ lục 4)

- Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR (phụ lục 4)

- ðiện di sản phẩm PCR

- Sản phẩm PCR ủược ủiện di trờn gel agarose 3% ủược chuẩn bị bằng dung dịch ủệm TAE và chứa 0,5 ml Ethidium bromide

Gel ủược chạy trờn thiết bị ủiện di Mini-Sub Cell (Biorad) với ủệm TAE ở ủiện thế 100 V trong 30 – 40 phỳt

Kết quả chạy ủiện di ủược kiểm tra trong buồng tối cú chiếu tia UV và ủược chụp lại bằng mỏy ảnh kỹ thuật số chuyờn dụng

3.3.4 Phương phỏp ủỏnh giỏ khả năng sinh trưởng phỏt triển của con lai soma trong ủiều kiện in vitro

Bốn dũng lai và năm dũng bố mẹ được nuôi cấy trong môi trường cơ bản MS Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên hoàn toàn (RCD) trong phòng nuôi, với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp có 2 bình tương ứng 5 cây/bình Sau đó, tiến hành theo dõi sự tăng trưởng chiều cao và số lá, chỉ tiêu theo dõi trong quá trình nghiên cứu.

+ Chiều cao (thõn chớnh): ðo từ gốc thõn chớnh tới ủỉnh sinh trưởng của cõy (cm)

+ Số lá: ðếm từ lá gốc tới lá ngọn (lá)

3.3.5 Phương phỏp ủỏnh giỏ khả năng tạo củ in vitro của con lai soma

Thí nghiệm được thực hiện bằng cách nhân giống các bệnh cây trong môi trường cơ bản MS Sau khoảng 5 tuần nuôi, cây đạt chiều cao từ 7-12 cm và được chuyển vào môi trường ủ với nồng độ 120 g/l Các bình mẫu sau khi chuyển vào môi trường ủ được giữ trong điều kiện tối hoàn toàn và thu hoạch sau 50 - 60 ngày.

Các chỉ tiêu theo dõi:

+ Số củ trong mỗi bỡnh: ðược xỏc ủịnh bằng phương phỏp ủếm số củ trong mỗi bình

+ Kớch thước củ phõn theo ủường kớnh củ chia làm 3 cấp: Loại 1 từ 0,5

- 0,7 cm, loại 2 từ 0,3 -

Tiêu đề	Nghiên Cứu Xác Định Con Lai Soma Khoai Tây, Đánh Giá Đặc Điểm Sinh Trưởng Phát Triển Và Khả Năng Chống Chịu Virus Của Chúng
Tác giả	Trần Văn Giáp
Người hướng dẫn	GS.TS Nguyễn Quang Thạch
Trường học	Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
Chuyên ngành	Di truyền và chọn giống cây trồng
Thể loại	luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản	2011
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	114
Dung lượng	6,99 MB