TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ ENZYME TYROSINASE
1.1.1 Melanin và sự hình thành melanin
Melanin là sắc tố quyết định màu sắc của da, tóc và mắt ở con người, được chia thành hai loại chính: eumelanin (màu đen) và pheomelanin (màu đỏ vàng) Tỷ lệ và sự hình thành giữa hai loại melanin này ảnh hưởng đến các sắc thái màu da khác nhau Nếu trong melanin có nhiều eumelanin, màu da sẽ được xác định là màu đen.
Melanin là chất được sản xuất bởi tế bào melanocyte, nằm ở lớp dưới cùng của biểu bì Chức năng của melanin là bảo vệ da khỏi tác hại của tia cực tím, ngăn ngừa các phản ứng viêm da và giảm nguy cơ ung thư da Khi melanin không bị tác động quá mức bởi tia tử ngoại, nó duy trì tỷ lệ bình thường và giúp da sáng trắng.
Enzyme tyrosinase đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp melanin bằng cách xúc tác quá trình oxy hóa tyrosine thành L-DOPA và sau đó chuyển đổi L-DOPA thành o-dopaquinone Tiếp theo, o-dopaquinone được chuyển hóa thành leukodopachrome thông qua phản ứng đóng vòng nội phân tử, trước khi nhanh chóng bị oxy hóa để tạo ra dopachrome.
Giai đoạn sau khi hình thành dopachrome dẫn đến tổng hợp eumelanin bắt đầu với phản ứng khử nhóm carboxyl của dopachrome, tạo ra 5,6-dihydroxyindole (DHI) Tiếp theo, DHI trải qua quá trình oxy hóa để hình thành indole-5,6-quinone (IQ) Ngoài ra, dopachrome cũng có thể chuyển đổi thành 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid (DHICA) nhờ enzyme hỗ biến DHICA tiếp tục bị oxy hóa để tạo ra indole-5,6-quinone-2-carboxylic acid (IQCA) Cuối cùng, các hợp chất IQ, DHICA và IQCA sẽ trải qua phản ứng polymer hóa để sản xuất eumelanin.
Trong quá trình hình thành pheomelanin, o-dopaquinone phản ứng với cysteine để chuyển thành cysteinylDOPA Các phản ứng đóng vòng và polymer hóa của cysteinylDOPA sẽ tạo ra pheomelanin Quá trình tổng hợp melanin được minh họa trong Hình 1.1.
Hình 1.1 Sơ đồ sinh tổng hợp melanin 1.1.2 Enzyme tyrosinase
Enzyme tyrosinase, một loại enzyme oxidase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp melanin, sắc tố chủ yếu có mặt trong tóc, da và mắt Enzyme này xúc tác cho hai phản ứng liên tiếp: đầu tiên là oxy hóa monophenol thành o-diphenol (EC 1.14.18.1), sau đó oxy hóa o-diphenol thành o-quinone (EC 1.14.18.1 và EC 1.10.3.1) Tiếp theo, o-quinone sẽ trải qua một loạt phản ứng để hình thành melanin cuối cùng.
Hình 1.2 Phản ứng chuyển hóa monophenol thành o-quinone
Enzyme tyrosinase có mặt trong mô thực vật và động vật, đóng vai trò quan trọng trong việc xúc tác quá trình sản xuất melanin từ tyrosine thông qua các phản ứng oxy hóa Quá trình này có thể quan sát thấy rõ trong hiện tượng thâm đen của củ khoai tây sau khi tiếp xúc với không khí Tyrosinase được tìm thấy bên trong melanosome và được tổng hợp trong tế bào melanocyte Ở con người, enzyme này được mã hóa bởi gene TYR.
Enzyme tyrosinase đã được nghiên cứu và phân lập từ nhiều nguồn thực vật, động vật và nấm, với nấm trắng Agaricus bisporus là nguồn chính cho các thí nghiệm Nấm A bisporus chứa gene mã hóa cho 6 loại enzyme tyrosinase (AbPPO1–AbPPO6), trong đó AbPPO3 và AbPPO4 là hai loại gene hoạt động mạnh nhất, cung cấp enzyme tyrosinase cho các ứng dụng thương mại.
Nghiên cứu về cấu trúc hóa học và quang phổ của enzyme tyrosinase cho thấy rằng hình dạng của enzyme này tương đồng với sắc tố hemocyanin ở động vật không xương sống Mặc dù sắc tố hemocyanin có cấu trúc tinh thể, trong khi enzyme tyrosinase không có, nhưng tâm hoạt động và các đặc tính hóa học của tyrosinase vẫn có sự tương đồng nhất định với hemocyanin.
Enzyme tyrosinase hoạt động thông qua các ion đồng được kết nối với nhau bằng cầu nối oxygen, mỗi ion đồng liên kết với ba nhóm histidine thông qua nguyên tử nitrogen.
Hình 1.3 Cấu trúc của enzyme tyrosinase của Agaricus bisporus
Enzyme tyrosinase có 3 dạng tồn tại khác nhau tùy thuộc cấu trúc của tâm hoạt tính là: Mettyrosinase, oxytyrosinase, và deoxytyrosinase (Hình 1.4) 89
Hình 1.4 Quá trình chuyển đổi trạng thái oxy hóa của vùng hoạt tính trong enzyme tyrosinase
Cấu trúc của mettyrosinase bao gồm hai ion đồng có hình dạng tứ giác, mỗi ion đồng tạo liên kết phối trí với hai nguyên tử nitrogen từ hai nhóm histidine theo phương xích đạo và một liên kết với một nguyên tử nitrogen của một nhóm histidine theo phương trục thẳng đứng Hai ion đồng (II) được kết nối với nhau qua một cầu nối đơn oxygen Chức năng của mettyrosinase chỉ giới hạn trong việc xúc tác phản ứng oxy hóa catechol thành o-quinone.
Cấu trúc deoxytyrosinase tương tự như deoxyhemocyanin, với hai ion đồng (I) làm tâm hoạt động nhưng không có cầu nối oxy Dạng deoxytyrosinase không có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa Khi có O2, quá trình tự hoạt hóa diễn ra, biến đổi deoxytyrosinase thành oxytyrosinase.
Hình 1.5 Enzyme oxytyrosinase xúc tác phản ứng oxy hóa phenol thành o-quinone
Hình 1.6 Enzyme oxytyrosinase xúc tác phản ứng oxy hóa catechol thành o-quinone
Cấu trúc oxytyrosinase tương tự như mettyrosinase, nhưng khác biệt ở chỗ oxytyrosinase có hai ion đồng (II) liên kết bằng cầu nối đôi oxygen Oxytyrosinase có khả năng xúc tác phản ứng oxy hóa phenol và catechol thành o-quinone.
1.1.3 Vai trò của enzyme tyrosinase
Enzyme tyrosinase tồn tại không chỉ trong cơ thể con người mà còn trong nhiều loại thực vật và động vật Đây là enzyme chủ chốt trong quá trình hình thành melanin.
Enzyme tyrosinase đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành melanin từ tyrosine ở nấm và động vật có xương sống Ở thực vật, enzyme này cũng tham gia vào quá trình chuyển hóa các hợp chất polyphenol dưới lớp biểu bì, dẫn đến sự hình thành những vết ố màu nâu khi lớp biểu bì bị tổn thương.
TỔNG QUAN VỀ DOCKING PHÂN TỬ
Phương pháp in silico sử dụng máy vi tính để hỗ trợ nghiên cứu và phát triển thuốc Phương pháp này được áp dụng từ việc tìm kiếm các hợp chất hóa học có tác dụng sinh học, tối ưu hóa cấu trúc để tăng cường hoạt tính sinh học và giảm độc tính, đến việc cải thiện các tính chất dược động học của thuốc, cũng như trong các giai đoạn nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng.
Docking phân tử là một phương pháp in silico dùng để mô hình hóa, nhằm dự đoán vị trí và cấu hình tối ưu mà một phân tử cơ chất có thể liên kết với một phân tử protein Phương pháp này cho phép phân tử cơ chất di chuyển trong không gian xung quanh phân tử protein, từ đó xác định vị trí có năng lượng gắn kết âm nhất thông qua các hàm đánh giá và kỹ thuật tìm kiếm cực trị toàn cục.
Khi cơ chất gắn kết với protein, hai yếu tố quan trọng cần xem xét là sự phù hợp về hình dạng và kích thước, cùng với năng lượng tương tác giữa chúng Sự phù hợp này tương tự như cơ chế ổ khóa-chìa khóa (Lock-Key) Tuy nhiên, cả cơ chất và protein đều có khả năng thay đổi hình dạng, với protein là phân tử lớn và mềm dẻo, cho phép nó linh hoạt điều chỉnh cấu trúc để tối ưu hóa sự gắn kết Điều này cũng tạo ra thách thức trong việc khảo sát toàn bộ khả năng tương tác của protein do kích thước và tính mềm dẻo của chúng.
Trong phương pháp docking, phân tử protein thường được đưa vào dưới dạng cứng nhắc, trong khi cơ chất có khả năng di chuyển và thay đổi hình dạng linh hoạt Đồng thời, các tương tác giữa cơ chất và phân tử protein cũng cần được xem xét để đánh giá phức hợp ligand-enzyme.
Giữa cơ chất và enzyme tồn tại nhiều loại tương tác, bao gồm tương tác Van der Waals, tương tác tĩnh điện, và trong một số trường hợp, còn có tương tác hóa học.
1.2.2 Ứng dụng của docking phân tử
Docking phân tử là công cụ quan trọng trong việc dự đoán ái lực và hoạt tính của dược chất đối với protein, từ đó xác định khả năng hoạt hóa và ức chế của chúng Phương pháp này cũng cho phép dự đoán vùng hoạt tính của protein, cũng như vị trí và cấu hình tối ưu của cơ chất khi tương tác với protein Nhờ vào những ưu điểm này, docking phân tử đã trở thành một trong những phương pháp phổ biến trong thiết kế thuốc, giúp giảm thiểu chi phí thực nghiệm Hơn nữa, phương pháp này còn cung cấp cái nhìn sâu sắc về các quy trình sinh hóa giữa dược chất và protein.
Docking phân tử là một phương pháp quan trọng trong nghiên cứu sinh học, phân chia các phân tử sinh học thành ba nhóm chính: phân tử nhỏ (ligand), protein và axit nucleic Phương pháp này giúp hiểu rõ hơn về tương tác giữa các phân tử và có thể được chia thành nhiều loại khác nhau.
3 loại quan trọng nhất, dựa trên các mô hình tương tác sau: Protein-ligand, protein- protein, và nucleic acid-protein
Tương tác giữa ligand và protein được phân thành hai loại chính: sự tương hợp về hình dạng và sự tương hợp về lý-hóa học Sự tương hợp về hình dạng là tiêu chí quan trọng nhất để đánh giá sự phù hợp trong quá trình docking giữa hai cấu trúc Bên cạnh đó, sự tương hợp về lý-hóa học, bao gồm các tương tác như hydrogen cho/nhận, tương tác giữa các nhân thơm, tương tác tĩnh điện và tương tác nhóm kỵ nước, cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình docking.
Quá trình docking giữa ligand và protein được phân loại dựa trên tính linh động của mô hình tương tác Sự phức tạp của quá trình này cũng được đánh giá theo tính linh động của cả phân tử ligand và protein Các mô hình docking đóng vai trò quan trọng trong việc hiểu rõ hơn về cơ chế tương tác này.
• Mô hình cứng nhắc: Bỏ qua tính linh động của các phân tử và xem chúng như những đối tượng cứng nhắc
• Thụ thể cứng nhắc-ligand linh động: Chỉ có phân tử ligand là linh động và thụ thể protein là cứng nhắc
• Thụ thể và ligand đều linh động: Cả phân tử protein và ligand đều được xem như linh động
Sự kết hợp giữa ligand và enzyme tạo ra một phức hợp có năng lượng thấp hơn tổng năng lượng của từng yếu tố riêng biệt, giúp các phân tử kết hợp hiệu quả Quá trình docking nhằm xác định mô hình không gian của phức hợp với mức năng lượng thấp nhất.
1.2.4 Các giai đoạn của quá trình docking phân tử
Ngân hàng dữ liệu protein là kho lưu trữ thông tin về cấu trúc ba chiều của các phân tử sinh học lớn như protein và nucleic acid Dữ liệu này được cung cấp miễn phí từ các nhà sinh học và hóa sinh toàn cầu thông qua các trang web như Viện Tin sinh học châu Âu, Ngân hàng dữ liệu protein Nhật Bản và Ngân hàng dữ liệu protein Hoa Kỳ Sau khi tải về, các file cấu trúc sẽ được xử lý và chỉnh sửa bằng các phần mềm chuyên dụng như PDBEditor, MGLTools, Molecular Operating Environment, Schrödinger, GOLD và BIOVIA Discovery Studio.
Các mô hình cấu trúc của ligand sẽ được thu thập từ nhiều nguồn cơ sở dữ liệu khác nhau Để loại bỏ các cấu trúc không có tiềm năng, ligand sẽ được đánh giá bằng nhiều công cụ khác nhau Những công cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính khả thi của ligand.
• ChemDraw (http://www.perkinelmer.com): Dùng để phác họa và mô tả công thức hóa học của các phân tử nhỏ (ligand)
• Molinspiration (http://www.molinspiration.com): Được dùng để đánh giá và kiểm tra ligand trong quá trình chọn lựa ligand theo quy tắc kinh nghiệm của Lipinski
The OSIRIS Property Explorer is a tool utilized for assessing and estimating the mutagenic and carcinogenic potential of ligand molecules.
pkCSM (http://biosig.unimelb.edu.au/pkcsm/) là một công cụ hữu ích trong việc dự đoán các đặc tính dược động học của ligand Nó giúp xác định các yếu tố quan trọng như sự hấp thu, sự phân bố, quá trình chuyển hóa, sự bài tiết và độc tính của các hợp chất.
• GUSAR (http://www.way2drug.com/gusar/): Dự đoán giá trị độc tính cấp trên chuột
Bước 3: Tiến hành docking phân tử
Quá trình docking của các phân tử ligand được tiến hành trên mô hình enzyme bởi các phần mềm chuyên dụng như:
✓ MOE (https://www.chemcomp.com)
✓ DOCK (http://dock.compbio.ucsf.edu/)
✓ Flex X (https://www.biosolveit.de/flexx/)
✓ FRED (https://www.eyesopen.com/oedocking)
✓ Glide (https://www.schrodinger.com)
✓ GOLD (https://www.ccdc.cam.ac.uk)
Vùng hoạt tính của enzyme sẽ được xác định thông qua công cụ tự động của phần mềm, giúp chọn lựa tâm xúc tác một cách chính xác Các phức hợp enzyme-ligand sẽ được đánh giá nhằm tìm ra các mô hình có năng lượng gắn kết cao nhất, từ đó tiến hành phân tích chi tiết các tương tác giữa phân tử ligand và vùng hoạt tính của enzyme.
TỔNG QUAN VỀ CÂY SƯNG CÓ ĐUÔI (SEMECARPUS CAUDATA)
Cây Sưng có đuôi, với tên khoa học là Semecarpus caudata Pierre, thuộc họ Đào lộn hột (Anacardiaceae) Theo phân loại khoa học, cây Sưng có đuôi được phân loại như trong Bảng 1.1.
Bảng 1.1 Phân loại khoa học của cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata)
Ngành Mangoliophyta (Thực vật có hoa)
Lớp Mangoliopsida (Thực vật hai lá mầm)
Họ Anacardiaceae (Đào lộn hột)
Loài S caudata Pierre Đồng danh S caudatus Pierre
1.3.2 Đặc điểm hình thái và phân bố
Hình 1.11 Lá và thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata)
Cây gỗ cao từ 10 đến 15 mét, với cành non có lông nhưng sau đó trở nên nhẵn, thẳng và dài đều Lá cây nhỏ, có cuống, mọc thành đôi, mép lá nguyên, đầu lá có mũi và gốc lá lệch Hoa của cây mọc thành cụm dạng chùy kép ở đầu.
Cây có 16 cành, hoa đơn tính và khác gốc, với cánh đài nhẵn và chỉ có lông ở mép Cánh tràng dài gấp 3 lần cánh đài, trong khi nhị đực hơi dài hơn cánh tràng Nhị có kích thước gấp 3–4 lần bao phấn, bao phấn hình mũi tên Quả hạch có hình trứng, hơi dẹt với vỏ ngoài mỏng và vỏ trong dài Cây ra hoa vào mùa hè (tháng 4 và 5) và cho quả vào mùa thu đông (tháng 9–11).
Hiện nay, loài S caudata được ghi nhận phân bố tại tỉnh Kiên Giang, An
Cây thường phát triển mạnh mẽ tại các khu vực như Giang, Đồng Nai, Lâm Đồng, Tây Ninh và Thanh Hóa, đặc biệt trong rừng khô rụng lá theo mùa Chúng thường mọc trên các đồi cỏ, đồi cây bụi, và trên đất basalt thoái hóa, cũng như trong rừng khộp ở độ cao từ 500 đến 600m.
Hiện tại, chưa có nghiên cứu nào về cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) ở cả trong nước và quốc tế Để hiểu rõ hơn về hóa thực vật của loài cây này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của chi Semecarpus Tất cả các tài liệu tham khảo liên quan đến chi này đều được xem xét kỹ lưỡng.
Semecarpus thì tài liệu về loài S anarcadium chiếm số lượng chủ yếu, ngoài ra có một số ít tài liệu về loài S kurzii
Loài S anarcadium được nghiên cứu nhiều tại Trung Quốc và Ấn Độ, trong đó các hợp chất phân lập được chủ yếu thuộc nhóm phenol và biflavanone (Hình 1.12) 90,100
Từ lá của loài S kurzii đã phân lập được một số flavonoid glycoside, bao gồm: kaempferol-3-O-β-D-glucopyranoside-4′-O-α-L-rhamnopyranoside, quercetin-3-O- rhamnoside, apigenin-7-O-neohesperidoside, scutellarein-7-O-β-D-xylopyranosyl (16)-β-D-galactopyranose, apigenin 6-C-galactopyranoside (Hình 1.12) 4,44,45
Hình 1.12 Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ loài S anarcadium và S kurzii
1.3.4 Công dụng dân gian và hoạt tính sinh học
Hiện nay, chưa có tài liệu nào đề cập đến công dụng dân gian và hoạt tính sinh học của cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) trên thế giới và trong nước Thông tin hiện có chỉ tập trung vào loài S anarcadium, thuộc cùng chi với S caudata.
Theo y học cổ truyền Ấn Độ, Semecarpus anacardium Linn là một dược liệu quý, với quả, hạt và dầu có giá trị chữa bệnh cao Loài cây này được sử dụng để điều trị nhiều bệnh lý, bao gồm kháng khuẩn, khử độc cho các bệnh ngoài da, ngăn ngừa sự phát triển của khối u ác tính, và điều trị các triệu chứng như sốt, ho ra máu, rối loạn kinh nguyệt, tiết dịch âm đạo, thiếu sữa, cũng như nhiễm ký sinh trùng đường ruột.
1.3.4.2 Hoạt tính sinh học a Hoạt tính kháng ung thư
Chiết xuất từ hạt S anacardium cho thấy khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú T47D và ung thư máu dòng tủy K-562 cũng như HL-60 Ngoài ra, cao chiết MeOH từ cây S anacardium có tác dụng gây độc tế bào ung thư tụy PANC-1 lên đến 97,9% ở nồng độ cao 100 µg/mL.
Bài thuốc dân gian Ấn Độ chứa hạt của loài S anacardium cho thấy độc tính đối với hai dòng tế bào ung thư vú MCF-7 và MDA 231, đồng thời kích thích quá trình chết theo chương trình ở tế bào MDA 231 Ngoài ra, nghiên cứu cũng chỉ ra hoạt tính bảo vệ hệ thần kinh của thành phần này.
Semecarpus anacardium được biết đến với khả năng bảo vệ hệ thần kinh, đặc biệt là vùng hồi hải mã, trong các trường hợp thoái hóa thần kinh do căng thẳng như bệnh Alzheimer Ngoài ra, S anacardium còn có tác dụng kéo dài thời gian bán hủy của acetylcholine bằng cách ức chế enzyme acetylcholinesterase, đồng thời thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa hiệu quả.
Cao chiết nước từ hạt S anacardium cho thấy khả năng kháng oxy hóa hiệu quả trên gan chuột Đặc biệt, dịch chiết EtOAc từ vỏ cây S anacardium có khả năng khử gốc tự do DPPH tốt hơn so với các loại chiết xuất khác như hexane, CHCl3 và MeOH, với giá trị IC50 lần lượt là 44.03 μg/mL, 103.69 μg/mL, 82.45 μg/mL và 60.23 μg/mL.
The extracts of S anacardium using water and petroleum ether at a concentration of 100 mg/mL demonstrated toxicity against Staphylococcus aureus and Shigella flexneri Additionally, the chloroform extract at the same concentration showed effectiveness against Bacillus licheniformis, Vibrio cholera, and Pseudomonas aeruginosa Conversely, the ethanol extract exhibited different properties.
100 mg mL -1 có khả năng kháng Pseudomonas aeruginosa và Staphylococcus aureus 71
Cao chiết nước của hạt S anacardium có tác dụng ức chế vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis, với giá trị MIC 6.25 g mL -1 103 e Hoạt tính hạ đường huyết
Chiết xuất ethanol từ hạt S anacardium có khả năng cân bằng đường huyết và hạ đường huyết, cho thấy hiệu quả trong điều trị bệnh tiểu đường trên chuột Ngoài ra, hoạt tính của nó còn giúp hạ lipid máu.
Cao chiết từ hạt S anacardium có khả năng giảm cholesterol tỉ trọng thấp và rất thấp, triglyceride, phospholipid, và acid béo tự do, đồng thời làm tăng cholesterol tỉ trọng cao Ngoài ra, nó còn giúp điều hòa các enzyme chuyển hóa lipid tại gan và thận, đồng thời mang lại hoạt tính kháng viêm hiệu quả.
Biflavonoid, tetrahydroamentoflavone, được cô lập từ hạt S anacardium thể hiện hoạt tính ức chế enzyme cyclooxygenase-1 với giá trị IC50 = 29.5 M 99 h Hoạt tính chữa lành vết thương
Cao chiết methanol của vỏ thân cây S anacardium có tác dụng chữa lành vết thương rất tốt trên chuột với liều 100 mg kg -1 60
TỔNG QUAN VỀ CÂY XUÂN THÔN NHIỀU HOA (SWINTONIA FLORIBUNDA)
1.4.1 Tên gọi và phân loại
Cây Xuân thôn nhiều hoa, có tên khoa học là Swintonia floribunda Griff., thuộc họ Đào lộn hột (Anacardiaceae) Phân loại khoa học của cây này được trình bày chi tiết trong Bảng 1.2.
Bảng 1.2 Phân loại khoa học của cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda)
Ngành Mangoliophyta (Thực vật có hoa)
Lớp Mangoliopsida (Thực vật hai lá mầm)
Họ Anacardiaceae (Đào lộn hột)
Loài S floribunda Griff Đồng danh S griffithii Kurz
Cây Xuân thôn nhiều hoa có tên gọi khác là Ưu hợp xuân thôn, Xuân thuôn nhiều hoa, hoặc Xoài quả cánh
1.4.2 Đặc điểm hình thái và phân bố
Cây gỗ lớn với thân thẳng, vỏ xám sẫm và nhẵn, có nhiều lỗ bì Cành nhánh lớn và chiều cao đáng kể Lá đơn mọc cách, nhẵn, có hình bầu dục với đầu nhọn và góc hình nêm, dài khoảng 10 cm.
Cây có lá dài 15 cm và rộng 4–5 cm, với gân bên rõ ở cả hai mặt, mép lá hơi gợn sóng và cuống lá tròn, dài 4–5 cm Cụm hoa hình chùy xuất hiện ở đầu cành, dài hơn lá, với cuống chung dài 5–6 cm và nhiều nhánh Mỗi nhánh thường mang 1–3 hoa nhỏ có cuống dài Hoa lưỡng tính, cánh đài hình tròn, dài 2 mm, trong khi cánh tràng có hình ngọn giáo, dài 6 mm và có lông ở đầu và gốc Nhị đực có chỉ nhị dẹt dài 1 mm, bao phấn ngắn (0.3–0.5 mm) Bầu nhẵn, kích thước tương đương với nhị, đầu nhụy hình đĩa Quả thuôn dài 1 cm, có cánh lớn, nhẵn, dài 3–4 cm.
Loài Xuân thôn nhiều hoa (S floribunda) phân bố rộng rãi ở Malaysia, Myanmar, Andaman, Sumatra và Việt Nam Tại Việt Nam, cây thường thấy ở các tỉnh Bắc Bộ và Nam Bộ, chủ yếu ở vùng núi dưới 1000 m, phổ biến nhất ở độ cao từ 200 đến 800 m Ở Nam Trung Bộ, cây mọc nhiều tại Tây Nguyên và Lâm Đồng, cũng như ở khu vực Tây Nam Bộ như Vĩnh An, Mã Đà, Hiếu Lâm thuộc tỉnh Đồng Nai, vườn Quốc gia Cát Tiên và vườn Quốc gia Bù Gia Mập.
Hình 1.13 Lá và trái của cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) 1.4.3 Thành phần hóa học
Hiện tại, chưa có tài liệu nghiên cứu nào về thành phần hóa học của cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) Tài liệu khoa học về hóa thực vật của chi Swintonia rất hạn chế, với chỉ một loài duy nhất là S foxworthyi đã được nghiên cứu Trong nghiên cứu này, ba hợp chất ester của acid gallic đã được phân lập, bao gồm methyl gallate, methyl m-digallate, và methyl p-digallate.
Hình 1.14 Cấu trúc các hợp chất phân lập được từ cây Swintonia foxworthyi
1.4.4 Công dụng dân gian và hoạt tính sinh học
Cây Xuân thôn là loại cây gỗ nặng trung bình, thường có nhiều hoa, nhưng dễ bị mối mọt Gỗ của cây có thể được sử dụng để lạng và sản xuất các đồ dùng thông thường, thường được áp dụng trong xây dựng.
1.4.4.2 Hoạt tính sinh học a Hoạt tính kháng ung thư
Cao chiết MeOH từ cây Xuân thôn nhiều hoa có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư vú MCF-7 và gây độc tế bào ung thư tụy PANC-1 với tỷ lệ lên tới 97.08% ở nồng độ 100 µg/mL Bên cạnh đó, cao chiết này cũng thể hiện hoạt tính kháng oxy hóa đáng kể.
Cao chiết nước từ cây Xuân thôn có hoạt tính khử gốc tự do DPPH mạnh với giá trị IC50 đạt 9.50 µg/mL, trong khi mẫu cao MeOH cho thấy hoạt tính với IC50 là 17.40 µg/mL Cả hai mẫu cao nước và MeOH đều thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh, với chỉ số tương ứng là 675.69 và 583.18 mg acid ascorbic/100 mg cao khô.
Bột cây Xuân thôn nhiều hoa thể hiện hoạt tính kháng một số dòng vi khuẩn
Bacillus cereus, B megaterium, B subtilis, Escherichia coli, và Pseudomonas aeruginosa 88
ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU
Tia tử ngoại (UV) từ ánh nắng mặt trời là nguyên nhân chính gây sạm nám da ở các nước nhiệt đới như Việt Nam, Ấn Độ, Thái Lan và Philippines Hiện nay, tầng ozone đang bị suy yếu, cho phép tia UV-C (bước sóng 100-280 nm) xâm nhập vào bề mặt trái đất, làm tăng nguy cơ nám da do ánh nắng Mặc dù nám da không phải là bệnh nguy hiểm, nhưng nó ảnh hưởng lớn đến thẩm mỹ, đặc biệt là ở phụ nữ.
Việc nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có khả năng ức chế enzyme tyrosinase để điều trị nám da luôn thu hút sự chú ý của các nhà khoa học toàn cầu Mối liên hệ giữa hoạt tính và cấu trúc của các hợp chất này cũng được xem xét kỹ lưỡng, nhằm đề xuất các cấu trúc có hoạt tính tốt, từ đó tạo nền tảng cho việc tổng hợp những hợp chất ức chế enzyme tyrosinase hiệu quả hơn.
Do đó, định hướng nghiên cứu chính của luận án như sau:
Chúng tôi đã tiến hành sàng lọc một số mẫu cây ở Đồng Nai dựa trên hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, nhằm xác định các mẫu cây có hoạt tính mạnh Mục tiêu của nghiên cứu này là phục vụ cho việc phân tích thành phần hóa học và khám phá khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu cây đã chọn.
Mẫu thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) và vỏ thân Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) đã cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh, nhưng chưa được nghiên cứu về hóa thực vật Vì vậy, chúng tôi sẽ tiến hành khảo sát thành phần hóa học của hai mẫu cây này và thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất phân lập được.
Nghiên cứu này nhằm xác định mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính của các nhóm hợp chất thông qua các giá trị IC50 thực nghiệm Đồng thời, phương pháp docking phân tử sẽ được áp dụng trên mô hình enzyme oxytyrosinase để đánh giá các tương tác giữa hợp chất và vùng hoạt tính của enzyme Điều này giúp giải thích rõ ràng hơn các kết quả thử hoạt tính cũng như mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc.
THỰC NGHIỆM
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Vào tháng 4 năm 2014, 16 mẫu cây đã được thu hái tại rừng Mã Đà, thuộc khu Bảo tồn Thiên nhiên - Văn hóa Đồng Nai, tỉnh Đồng Nai, Việt Nam Các mẫu cây này được định danh bởi PGS.TS Trần Hợp từ Viện Sinh học Nhiệt đới Tp Hồ Chí Minh Hiện nay, các tiêu bản mẫu cây đang được lưu trữ tại Phòng thí nghiệm chuyên ngành Hóa dược, Khoa Hóa học, trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp Hồ Chí Minh.
Các mẫu cây này được lựa chọn theo 3 tiêu chí:
✓ Công dụng dân gian về làm đẹp hoặc điều trị các bệnh về da
✓ Công bố khoa học về hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
✓ Lựa chọn một cách ngẫu nhiên
Bảng 2.1 Tên khoa học, tên địa phương, và bộ phận khảo sát của các mẫu cây
STT Tên khoa học Tên địa phương Bộ phận khảo sát
1 Kibatalia laurifolia (Ridl.) Woodson (Apocynaceae) Thần linh lá quế Thân và lá
2 Artocarpus rigida (Moraceae) Mít nài Thân
3 Semecarpus caudata Pierre (Anacardiaceae) Sưng có đuôi Thân
4 Swintonia floribunda Griff (Anacardiaceae) Xuân thôn nhiều hoa Vỏ thân
5 Buchanania lucida Blume (Anacardiaceae) Chây sáng Thân
6 Mangifera reba Pierre (Anacardiaceae) Quéo Thân
7 Mangifera camptosperma Pierre (Anacardiaceae) Xoài bụi Thân và vỏ thân
8 Dipterocarpus dyeri Pierre (Dipterocarpaceae) Dầu song nàng Thân
9 Dipterocarpus turbinatus Gaertn (Dipterocarpaceae) Dầu con rái đỏ Thân và vỏ thân
10 Dipterocarpus alatus Roxb (Dipterocarpaceae) Dầu con rái trắng Thân
11 Dipterocarpus costatus Gaertn (Dipterocarpaceae) Dầu cát Thân và vỏ thân
12 Hopea odorata Pierre (Dipterocarpaceae) Sao đen Thân và vỏ thân
13 Hopea recopei Pierre (Dipterocarpaceae) Chò chai Thân và vỏ thân
14 Anisoptera costata Korth (Dipterocarpaceae) Vên vên Thân và vỏ thân
15 Shorea thorelii Pierre (Dipterocarpaceae) Chai thorel Thân và vỏ thân
16 Vatica odorata (Griff.) Symington (Dipterocarpaceae) Làu táu trắng Thân và lá
Các mẫu cây sẽ được tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase để chọn ra mẫu cây thể hiện hoạt tính mạnh
Mã số tiêu bản của hai mẫu cây Sưng có đuôi và Xuân thôn nhiều hoa lần lượt là MCE0002 và MCE0045
HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.2.1.1 Hóa chất sử dụng để phân lập các hợp chất
Các dung môi phổ biến trong sắc ký cột, sắc ký lớp mỏng và chiết lỏng-lỏng bao gồm n-hexane, CHCl3, EtOAc, Me2CO và MeOH Những dung môi này thường được cung cấp ở dạng tinh khiết từ RCI Labscan hoặc dưới dạng công nghiệp đã được chưng cất lại.
Thuốc thử hiện hình các vết hữu cơ trên sắc kí lớp mỏng: vanillin/H2SO4 1 %,
Sắc ký cột sử dụng silica gel 230–400 mesh (Scharlau) và RP-18 40–63 m (Merck)
Sắc ký lớp mỏng pha thường (Kieselgel 60 F254, Merck) và pha đảo (RP-18
2.2.1.2 Hóa chất sử dụng để thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Enzyme tyrosinase (EC 1.14.18.1) chiết xuất từ nấm (3933 U mL -1 ) và chất nền L-dihydroxyphenylalanine (≥ 98%) được mua từ hãng Sigma Aldrich
Chất đối chứng dương sử dụng trong thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase là kojic acid có độ tinh khiết ≥ 98% (Merck)
Na2HPO4 và NaH2PO4 (Merck) được dùng để pha dung dịch đệm phosphate pH = 6.8 DMSO (Merck) dùng làm dung môi hòa tan mẫu thử
Các dụng cụ thủy tinh cơ bản của phòng thí nghiệm
Các loại cột sắc ký bằng thủy tinh với các kích thước khác nhau
Máy cô quay chân không Eyela 1200B
Máy quang phổ UV-Vis hãng Shimadzu UV-1800
Máy quang phổ IR hãng Shimadzu IR-408
Máy phân cực kế hãng A Krüss Optronic P3000
Máy cộng hưởng từ hạt nhân NMR hãng Bruker Avance II 500 dùng để ghi phổ 1 H, 13 C, HSQC, HMBC, và NOESY
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Agilent 1200 ghép khối phổ phân giải cao micrOTOF-QII Bruker dùng để ghi phổ khối lượng HRESIMS
Máy khối phổ JEOL JMS-AX505HA dùng để ghi phổ khối lượng HRFABMS.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp sàng lọc các mẫu cây có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
2.3.1.1 Điều chế cao MeOH của các mẫu cây
Sau khi thu thập, các mẫu cây sẽ được phân loại, cắt nhỏ và phơi khô Mỗi mẫu cây (khoảng 100–200 g) sẽ được trích xuất bằng MeOH (300 mL) trong 3 giờ và quy trình này được lặp lại 3 lần Các dịch trích xuất MeOH sẽ được cô quay dưới áp suất thấp, tạo ra các mẫu cao MeOH Từ 16 mẫu cây, qua việc phân loại các bộ phận và ly trích, đã thu được 25 mẫu cao MeOH (Bảng 2.1).
2.3.1.2 Phương pháp thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu thử
Trong môi trường đệm phosphate 0.1 M với pH 6.8, enzym tyrosinase chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrome, một hợp chất có màu đỏ cam và đạt độ hấp thu cực đại tại bước sóng 475 nm.
Các mẫu khảo sát hoạt tính ức chế khi được đưa vào dung dịch đo quang sẽ làm giảm hoạt tính xúc tác của enzyme tyrosinase, dẫn đến việc giảm quá trình chuyển hóa L-DOPA thành DOPAchrome và cường độ màu cũng sẽ giảm theo.
Hình 2.1 Cấu trúc của chất đối chứng dương kojic acid
Kojic acid (Hình 2.1) sẽ được sử dụng làm chất đối chứng dương trong quy trình thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase
Pha đệm phosphate (0.1 M) pH = 6.8: Dùng ống đong lấy 140 mL dung dịch
Để chuẩn bị dung dịch, cho 0.2 M Na2HPO4 và 144 mL dung dịch 0.5 M NaH2PO4 vào becher 1000 mL Tiếp theo, thêm nước cất hai lần và điều chỉnh pH đến 6.8 Cuối cùng, định mức dung dịch trong fiol 1000 mL bằng nước cất hai lần.
Dung dịch enzym tyrosinase: Cân 0.58 mg enzyme tyrosinase pha trong fiol 5 mL, được định mức bằng đệm photphate pH = 6.8
Dung dịch nền L-DOPA: Cân 29.58 mg L-DOPA và pha trong fiol 100 mL, được định mức bằng đệm phosphate pH = 6.8
Các dung dịch gốc được chuẩn bị với nồng độ 500 g mL -1 cho mẫu cao và 500 M cho chất tinh khiết trong đệm phosphate Đối với các mẫu có hoạt tính mạnh, nồng độ dung dịch gốc được giảm xuống còn 50 g mL -1 và 50 M để xác định giá trị IC50.
Quy trình thử hoạt tính enzyme tyrosinase bắt đầu bằng việc trộn đều đệm phosphate (pH = 6.8) với mẫu thử Sau đó, thêm 50 μL enzyme tyrosinase vào hỗn hợp và ủ ở 30°C trong 30 phút Tiếp theo, cho 500 μL dung dịch nền L-DOPA vào, lắc đều và ủ thêm 7 phút Cuối cùng, đo mật độ quang của dung dịch tại bước sóng 475 nm.
Bảng 2.2 Các giá trị thể tích để pha mẫu thử (S), mẫu trắng (B), và mẫu control
V (μL) Control Nồng độ (g mL -1 hay M)
Nền 1000 500 1000 500 1000 500 1000 500 1000 500 Tổng V 3000 1500 3000 1500 3000 1500 3000 1500 3000 1500 Mỗi mẫu thử (S) được thực hiện ở 4 nồng độ khác nhau (100, 50, 25, 10 g mL -1 đối với mẫu cao hoặc M đối với chất tinh khiết), mỗi nồng độ thực hiện 3 lần
Mỗi nồng độ mẫu thử sẽ tương ứng với một mẫu trắng, như được thể hiện trong Bảng 2.2 Mẫu trắng (B) có thành phần tương tự mẫu thử (S), nhưng enzyme tyrosinase được thay thế bằng dung dịch đệm phosphate Mẫu control cũng được chuẩn bị tương tự như mẫu thử (S), nhưng dung dịch mẫu được thay bằng dung dịch đệm phosphate, nghĩa là mẫu control không chứa mẫu thử.
Giá trị phần trăm ức chế (I %) được tính toán thông qua biểu thức sau:
Acontrol: giá trị mật độ quang của dung dịch khi không có mẫu thử
Asample: giá trị mật độ quang của dung dịch khi có mẫu thử
Giá trị IC50 (μg mL -1 hay μM) đại diện cho nồng độ của mẫu thử nghiệm có khả năng ức chế 50% hoạt tính của enzyme tyrosinase Để tính giá trị này, người ta sử dụng phương trình đường thẳng y = ax + b, trong đó y là phần trăm ức chế I% và x là nồng độ mẫu, với các hệ số a và b được suy ra từ đồ thị.
Với những mẫu có hoạt tính biến thiên tuyến tính với nồng độ, thì phương trình y = ax + b sẽ được vẽ qua tất cả các điểm
Đối với các mẫu có hoạt tính không thay đổi tuyến tính theo nồng độ, phương trình y = ax + b có thể được suy ra gần đúng bằng cách lựa chọn hai điểm tương ứng với nồng độ ức chế trên và dưới 50%.
2.3.2 Phương pháp điều chế các cao phân đoạn và phân lập các hợp chất tinh khiết
Dựa trên kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và tài liệu tham khảo về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của các loài cây, chúng tôi đã chọn hai mẫu cây có hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh và chưa được nghiên cứu về hóa thực vật: Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) và Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) Mục tiêu là khảo sát thành phần hóa học và thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất phân lập được từ hai loài cây này.
2.3.2.1 Khảo sát thành phần hóa học của thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata)
Từ 7 kg mẫu khô của thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) tiến hành xay nhỏ và đun hoàn lưu với MeOH Toàn bộ dịch trích được đem cô quay áp suất kém, thu được cao thô MeOH (700 g) Tiến hành phân tán cao MeOH vào nước và thực hiện chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, CHCl3, và EtOAc thu được các cao phân đoạn tương ứng, tuy nhiên cao EtOAc có khối lượng rất ít nên đã gom chung với cao CHCl3 Các cao phân đoạn có khối lượng lần lượt là cao n-hexane (37.0 g), cao CHCl3 (500.0 g), và cao nước (135.0 g)
Tiến hành sắc ký cột cao với dung môi CHCl3 và hệ dung môi n-hexane–EtOAc cùng CHCl3–MeOH có độ phân cực tăng dần, chúng tôi thu được 12 phân đoạn (SCD1–12) Các phân đoạn SCD1–9 sẽ được tiếp tục sắc ký cột và sắc ký điều chế trên silica gel với các hệ dung môi khác nhau, từ đó thu được 20 hợp chất tinh khiết (1–20).
Phân đoạn SCD3 (4.5 g) được tách bằng phương pháp sắc ký cột pha thường với dung môi n-hexane–EtOAc (0–100 % EtOAc), tạo ra 4 phân đoạn SCD3.1 đến SCD3.4 Tiếp theo, phân đoạn SCD3.2 và SCD3.3 được xử lý bằng sắc ký lớp mỏng với dung môi n-hexane–EtOAc (8:2) và CHCl3–EtOAc (9:1), thu được hợp chất 3 (5.0 mg) và 5 (6.0 mg).
Phân đoạn SCD4 (1.9 g) đã được kết tinh trong dung môi EtOAc, thu được hợp chất 10 (1.4 g) Sau đó, phần dung dịch còn lại được xử lý bằng phương pháp sắc ký cột pha thường với hệ dung môi CHCl3–EtOAc (0–50% EtOAc), dẫn đến việc thu được hợp chất 6 (3.5 mg).
Phân đoạn SCD5 (5.2 g) đã được tách bằng phương pháp sắc ký cột pha thường với dung môi n-hexane–EtOAc (0–100 % EtOAc) và CHCl3–MeOH (0–20% MeOH), tạo ra 5 phân đoạn SCD5.1–5.5 Trong đó, phân đoạn SCD5.2–5.4 được tiếp tục xử lý bằng sắc ký cột pha thường với dung môi CHCl3–Me2CO (0–80 % Me2CO) và CHCl3–MeOH (0–20 % MeOH), thu được hợp chất 2 (5.0 mg) và hợp chất 20 (5.0 mg).
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
GIỚI THIỆU CHUNG
Trong luận án này, chúng tôi đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của 16 mẫu cây thu hái tại tỉnh Đồng Nai vào năm 2014 Hai mẫu cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) và vỏ cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase mạnh mẽ và chưa được nghiên cứu về hóa thực vật Do đó, chúng tôi đã chọn hai mẫu này để khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất phân lập được Qua các phương pháp sắc ký, chúng tôi đã phân lập được 20 hợp chất từ cao CHCl3 của thân cây Sưng có đuôi và 22 hợp chất từ cao EtOAc của vỏ cây Xuân thôn nhiều hoa Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua các phương pháp phổ nghiệm hiện đại như IR, UV, NMR, và MS, kết hợp với phương pháp hóa tính toán và so sánh tài liệu tham khảo.
Các hợp chất phân lập được thuộc các khung phenol (1–5, 21–29), khung diarylalkanoid (6–8, 30, 31), khung flavonoid (9–15, 32–34), khung lignan (16–18,
35), khung steroid (19, 20), và khung triterpenoid (36, 37) Trong đó, các hợp chất 7,
8, 15, và 28 là bốn hợp chất mới lần đầu tiên được công bố trên thế giới
Các hợp chất tinh khiết đã được thử nghiệm để đánh giá hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase, và kết quả cho thấy có 12 trong số 37 hợp chất (2, 4, 6–8, 11–14, 28, 30, và 34) có hoạt tính với giá trị IC50 nhỏ hơn 100 μM Đặc biệt, hai hợp chất mới 7 và 8 thể hiện hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase rất mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 0.033 và 0.11 μM.
Mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc của khung phenol, diarylalkanoid và flavonoid được xác định thông qua thử nghiệm ức chế enzyme tyrosinase Ngoài ra, một số hợp chất thuộc các nhóm này đã được tiến hành docking phân tử trên mô hình enzyme oxytyrosinase để phân tích và đánh giá các tương tác giữa ligand và enzyme, từ đó giải thích kết quả thử hoạt tính và mối quan hệ giữa hoạt tính và cấu trúc.
NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME
3.2.1 Sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu cao MeOH
Nghiên cứu đã tiến hành sàng lọc hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase từ 25 mẫu cao MeOH được chiết xuất từ 16 mẫu cây 19 mẫu cao được thử nghiệm ở bốn nồng độ khác nhau trong khoảng 1–100 µg mL -1 Trong thí nghiệm, kojic acid được sử dụng làm chất đối chứng dương với giá trị IC50 là 6.34 µg mL -1.
Bảng 3.1 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase (IC50, g mL -1 ) của các mẫu cao MeOH
STT Tên khoa học Phần trăm ức chế (I %) IC 50
Kết quả sàng lọc cho thấy 18 trong số 25 mẫu cao MeOH có khả năng ức chế enzyme trên 50% ở nồng độ cao 100 µg/mL (Bảng 3.1).
Nghiên cứu cho thấy, ở nồng độ cao chiết 50 µg mL -1, có 15/25 mẫu thể hiện hoạt tính với chỉ số ức chế (I) > 50% Ngoài ra, 9/25 mẫu thử cũng cho thấy hoạt tính ức chế enzyme (I > 50%) tại nồng độ 25 µg mL -1 Đặc biệt, mẫu cao MeOH từ thân cây Mít nài (Artocarpus rigida) đạt hoạt tính mạnh nhất với I = 78.43% ở nồng độ 10 µg mL -1, vì vậy mẫu này đã được thử nghiệm lại ở các nồng độ thấp hơn Kết quả cho thấy, tại nồng độ 2.5 µg mL -1, mẫu cao vẫn duy trì hoạt tính ức chế mạnh với I > 50%.
Giá trị IC50 (μg mL -1) được xác định dựa trên phần trăm ức chế ở các nồng độ khác nhau của mẫu thử Kết quả cho thấy mẫu cao MeOH từ thân cây Mít nài (Artocarpus rigida) có hoạt tính mạnh nhất với giá trị IC50 là 1.06 μg mL -1 Tiếp theo, mẫu cao MeOH từ vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) cũng cho thấy hoạt tính đáng kể.
IC50 = 11.61 g mL -1 Theo các tài liệu tham khảo thì chi Artocarpus, đặc biệt là loài
Artocarpus rigida đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, trong khi chi Swintonia, đặc biệt là cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda), vẫn chưa được khai thác nhiều trên toàn cầu Do đó, mẫu cao MeOH từ vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa được lựa chọn để tiếp tục khảo sát về thành phần hóa học của nó.
Các mẫu cao MeOH từ cây Xoài bụi (Mangifera camptosperma), Chây sáng (Buchanania lucida), Dầu con rái trắng (Dipterocarpus alatus), Dầu con rái đỏ (Dipterocarpus turbinatus), và Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) đều cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase với giá trị IC50 trong khoảng 14.13–23.26 μg mL-1 Trong đó, chi Mangifera và chi Dipterocarpus đã được nghiên cứu nhiều về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học, do đó không được chọn để khảo sát tiếp Theo tài liệu tham khảo, Chây sáng (Buchanania lucida) và Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) chưa được nghiên cứu về hóa thực vật và hoạt tính sinh học Tuy nhiên, do cây Chây sáng phân bố rải rác và số lượng ít, việc thu thập mẫu lớn gặp khó khăn, vì vậy chúng tôi đã quyết định chọn cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) để nghiên cứu.
39 caudata), mẫu cây có thể thu hái với số lượng lớn, để tiếp tục khảo sát về thành phần hóa học
3.2.2 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các mẫu cao phân đoạn của mẫu thân cây Sưng có đuôi và vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa
Từ mẫu cao MeOH của thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata), các cao phân đoạn n-hexane, CHCl3 và H2O đã được điều chế Trong số các mẫu cao phân đoạn này, cao CHCl3 cho thấy hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase yếu với giá trị IC50 là 99.47 µg/mL.
Mẫu cao MeOH từ vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) đã được điều chế thành các phân đoạn n-hexane, EtOAc và H2O Trong số đó, phân đoạn EtOAc cho thấy hoạt tính ức chế trung bình với giá trị IC50 là 35.81 µg/mL (Bảng 3.2).
Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase cho thấy mẫu cao CHCl3 từ thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) và mẫu cao EtOAc từ vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) đã được lựa chọn để nghiên cứu thành phần hóa học.
Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase (IC50, g mL -1) của các mẫu cao phân đoạn từ thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) và vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) được trình bày trong Bảng 3.2.
Thân Sưng có đuôi n-hexane 37.4 ± 1.2 31.36 ± 0.97 22.20 ± 0.84 5.9 ± 1.3 > 100 CHCl3 54.2 ± 1.4 31.0 ± 1.3 19.1 ± 1.1 4.70 ± 0.79 99.47
Xuân thôn nhiều hoa n-hexane 5.4 ± 1.1 – – – > 100
KHẢO SÁT CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
3.3.1 Khảo sát cấu trúc của các hợp chất khung phenol
Từ cao CHCl3 của thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata), chúng tôi đã phân lập được 5 hợp chất có khung phenol (1–5) (Hình 3.1)
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua phổ NMR, kết hợp so sánh với các dữ liệu từ tài liệu tham khảo
Hình 3.1 Cấu trúc của các hợp chất 1–5
Hợp chất 1 (Hình 3.2) là chất rắn màu vàng, dễ tan trong hỗn hợp dung môi CHCl3 và acetone Khi thực hiện sắc kí lớp mỏng với dung môi CHCl3 (100 %), ta thu được vết tròn hấp thu ở bước sóng UV 254 nm Sau khi xử lý với thuốc thử H2SO4 (20 %) và hơ nóng, hợp chất hiện lên vết màu cam.
Hình 3.2 Cấu trúc của hợp chất 2,6-dimethoxybenzoquinone (1)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 1 thể hiện các tín hiệu cộng hưởng của hai proton olefin [δH 5.15 (2H, s, H-3 và H-5)], hai nhóm methoxy [δH
Phổ 13 C NMR thể hiện các tín hiệu cộng hưởng của tám carbon, bao gồm hai carbon carbonyl [δC 187.1 (C-4), 176.1 (C-1)], bốn carbon olefin [δC 2 × 157.3 (C-2 và C-6), 2 × 107.1 (C-3 và C-5)], và hai nhóm methoxy [δC 2 × 56.5 (-OCH3)] (Bảng 3.3) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 1 là dẫn xuất của p-benzoquinone
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 1 được đề nghị là 2,6-dimethoxybenzoquinone 42
Bảng 3.3 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (DMSO-d 6) của hợp chất 1 và 2,6- dimethoxybenzoquinone
Vị trí 1 2,6-Dimethoxybenzoquinone δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Hợp chất 2 là một chất rắn màu vàng nhạt, có khả năng tan tốt trong hỗn hợp dung môi CHCl3 và acetone Khi thực hiện sắc kí lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–EtOAc (tỷ lệ 7:3), hợp chất này tạo ra vết tròn, hấp thu ở bước sóng UV 254 nm, và khi được xử lý bằng thuốc thử H2SO4 20% và hơ nóng, vết màu nâu đỏ xuất hiện.
Hình 3.3 Cấu trúc của hợp chất p-coumaric acid (2)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 2 cho các tín hiệu cộng hưởng của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 4 [δH 7.45 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2 và H-
6), 6.76 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3 và H-5)] và hai proton trans-olefin [δH 6.26 (d, J 15.9 Hz, H-) và 7.40 (d, J = 15.9 Hz, H-)] (Bảng 3.4)
Phổ 13 C NMR thể hiện tín hiệu của 9 carbon, trong đó có một carbon carbonyl
,-bất bão hòa (δC 168.6, C=O), hai carbon olefin [δC 118.5 (C-), 140.9 (C-)], sáu carbon thơm [δC 126.2 (C-1), 132.6 (C-2 và C-6), 115.3 (C-3 và C-5), 158.9 (C-4)] (Bảng 3.4) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 2 là dẫn xuất của cinnamic acid
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 2 được đề nghị là p-coumaric acid 107
Bảng 3.4 Dữ liệu phổ 1 H NMR (DMSO-d 6) của hợp chất 2 và p-coumaric acid
Vị trí 2 p-Coumaric acid δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Hợp chất 3 là một chất rắn màu trắng, dễ tan trong hỗn hợp dung môi CHCl3 và acetone Qua sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexane–EtOAc (7:3), hợp chất này cho vết tròn, hấp thu ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm Khi xử lý với thuốc thử H2SO4 (20%) và hơ nóng, hợp chất hiện ra vết màu vàng.
Hình 3.4 Cấu trúc của hợp chất methyl p-coumarate (3)
Phổ 1 H và 13 C NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 3 và p-coumaric acid
(2) thể hiện các tín hiệu cộng hưởng tương tự nhau Tuy nhiên, trên phổ 1 H và 13 C
NMR xuất hiện thêm tín hiệu của nhóm methoxy [δH 3.69 (s), δC 52.2] (Bảng 3.5)
Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 3 là dẫn xuất ester của p-coumaric acid
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 3 được đề nghị là methyl p-coumarate 11
Bảng 3.5 Dữ liệu phổ 1 H NMR (DMSO-d 6) của hợp chất 3 và methyl p-coumarate
Vị trí 3 Methyl p-coumarate δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Hợp chất 4 là một chất rắn màu vàng, dễ tan trong hỗn hợp dung môi CHCl3 và acetone Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–MeOH (95:5), ta thu được vết tròn có khả năng hấp thu ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm Vết này hiện hình khi được xử lý bằng thuốc thử H2SO4 (20 %) và hơ nóng, tạo ra vết màu vàng đặc trưng.
Hình 3.5 Cấu trúc của hợp chất 3,4-dihydroxybenzalacetone (4)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 4 thể hiện các tín hiệu cộng hưởng của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4 [δH 7.06 (d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.00 (dd, J = 8.2 và 2.0 Hz, H-6), 6.77 (d, J = 8.2 Hz, H-5)], hai proton trans-olefin [δH
7.44 (d, J = 16.2 Hz, H-) và 6.47 (d, J = 16.2 Hz, H-)], và một nhóm methyl [δH
Phổ 13 C NMR cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 10 carbon, trong đó có một carbon carbonyl của nhóm ketone ,-bất bão hòa (δC 197.7), hai carbon olefin [δC
3), 148.5 (C-4), 115.8 (C-5), 121.5 (C-6)], và một carbon methyl (δC 27.1, -COCH3) (Bảng 3.6) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 4 có cấu trúc khung arylbutanoid
Bảng 3.6 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (DMSO-d 6) của hợp chất 4 và 3,4- dihydroxybenzalacetone
Vị trí 4 3,4-Dihydroxybenzalacetone δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 4 được đề nghị là 3,4-dihydroxybenzalacetone 15
Hợp chất 5 là một chất rắn màu vàng, dễ tan trong hỗn hợp dung môi CHCl3 và acetone Qua phân tích sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi n-hexane–EtOAc (tỉ lệ 7:3), hợp chất này tạo ra vết tròn có khả năng hấp thu ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm Khi được xử lý bằng thuốc thử H2SO4 (20%) và đun nóng, hợp chất hiện ra với vết màu nâu đỏ.
Hình 3.6 Cấu trúc của hợp chất ferulic acid (5)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 5 và 3,4- dihydroxybenzalacetone (4) thể hiện sự tương đồng, bao gồm các tín hiệu của vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4 và hai proton trans-olefin Tuy nhiên, trên phổ 1 H NMR của hợp chất 5 cho một tín hiệu của nhóm methoxy (δH 3.81, -OCH3) (Bảng 3.7)
Phổ 13 C NMR cho các tín hiệu cộng hưởng của 10 carbon, trong đó có một carbon carbonyl ,-bất bão hòa (δC 168.0), hai carbon olefin [δC 115.5 (C-), 144.5 (C-)], sáu carbon thơm [δC 125.8 (C-1), 111.1 (C-2), 147.9 (C-3), 149.1 (C-4), 115.6 (C-5), 122.8 (C-6)], và một carbon methyl (δC 55.7, -COCH3) (Bảng 3.7) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 5 là dẫn xuất của cinnamic acid
Bảng 3.7 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (DMSO-d 6) của hợp chất 5 và ferulic acid
Vị trí 5 Ferulic acid δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 5 được đề nghị là ferulic acid 121
3.3.2 Khảo sát cấu trúc của các hợp chất khung diarylalkanoid
Từ cao CHCl3 của thân cây Sưng (Semecarpus caudata), chúng tôi đã phân lập được ba hợp chất có cấu trúc diarylalkanoid (6–8) Trong đó, hợp chất 7 và 8 là hai hợp chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới.
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua phổ NMR, kết hợp so sánh với các dữ liệu từ tài liệu tham khảo
Hình 3.7 Cấu trúc của các hợp chất 6–8
Hợp chất 6 là một chất rắn vô định hình màu trắng, có khả năng tan tốt trong acetone Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–MeOH (95:5), hợp chất này cho vết tròn và hấp thu tại bước sóng UV 254 nm Khi xử lý với thuốc thử H2SO4 20% và hơ nóng, hợp chất hiện lên vết màu cam.
Hình 3.8 Cấu trúc của hợp chất morachalcone A (6)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, acetone-d 6) của hợp chất 6 cho các tín hiệu cộng hưởng của một vòng benzene A thế ở vị trí 1, 2, 3, 4 [δH 7.87 (d, J = 9.0 Hz, H-6′), 6.51 (d, J = 9.0 Hz, H-5′)], một vòng benzene B thế ở vị trí 1, 2, 4 [δH 7.66 (d, J = 8.2
Hz, H-6), 6.51 (d, J = 2.5 Hz, H-3), 6.43 (dd, J = 8.2 và 2.5 Hz, H-5)], một nhóm prenyl [δH 5.28 (t, J = 7.0 Hz, H-2), 3.37 (d, J = 7.0 Hz, H-1), 1.78 (s, 3E-CH3), 1.64 (s, 3Z-CH3)], hai proton trans-olefin [δH 8.21 (d, J = 15.5 Hz, H-β), 7.79 (d, J
= 15.5 Hz, H-α)] (Bảng 3.8) Ngoài ra, trên phổ 1 H NMR cũng thể hiện tín hiệu của nhóm hydroxy kiềm nối δH 14.12 (brs)
Phổ 13 C NMR cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của 20 carbon, trong đó có một carbon carbonyl (δC 193.5, C=O), 12 carbon thơm (δC 103.7–165.1), bốn carbon olefin [δC 123.4 (C-2), 131.3 (C-3), 117.7 (C-α), 140.9 (C-β)], một carbon methylene (δC 22.3, C-1), và hai carbon methyl [δC 25.8 (3E-Me), 17.9 (3Z-Me)] (Bảng 3.8) Từ các dữ liệu trên cho thấy hợp chất 6 có cấu trúc khung prenyl chalcone
Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (acetone-d 6) của hợp chất 6 và morachalcone
Vị trí 6 Morachalcone A δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Kết hợp so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất 6 với tài liệu tham khảo, cấu trúc của hợp chất 6 được đề nghị là morachalcone A 123
Hợp chất 7 là một chất rắn vô định hình, có màu vàng và tan tốt trong acetone Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–MeOH (95:5), hợp chất này tạo ra vết tròn có khả năng hấp thu ánh sáng UV ở bước sóng 254 nm Sau khi xử lý với thuốc thử H2SO4 (20%) và hơ nóng, hợp chất hiện lên vết màu cam rõ rệt.
Hình 3.9 Cấu trúc của hợp chất semedienone (7)
Phổ IR của hợp chất 7 cho thấy sự hiện diện của nhóm hydroxy tại 3455 cm -1 và nhóm carbonyl tại 1620 cm -1 Ngoài ra, phổ 1H NMR (500 MHz, acetone-d6) của hợp chất 7 cung cấp các tín hiệu cộng hưởng của vòng benzene A tại các vị trí 1, 2 và 4.
7.94 (d, J = 8.9 Hz, H-6′), 6.45 (dd, J = 8.9 và 2.4 Hz, H-5′), 6.35 (d, J = 2.4 Hz, H- 3′)], một vòng benzene B thế ở vị trí 1, 2, 4 [δH 7.43 (d, J = 8.5 Hz, H-6), 6.47 (d, J 2.4 Hz, H-3), 6.42 (dd, J = 8.5 và 2.4 Hz, H-5)], và hai cặp proton trans-olefin [δH
7.27 (brd, J = 14.5 Hz, H-), 7.68 (ddd, J = 14.5, 11.3 và 0.8 Hz, H-), 7.17 (ddd, J
= 15.6, 11.3 và 0.8 Hz, H-), 7.35 (brd, J = 15.6 Hz, H-)] (Bảng 3.9) Ngoài ra, trên phổ 1 H NMR cũng thể hiện tín hiệu của nhóm hydroxy kiềm nối tại δH 13.68 (s)
Phổ 13 C NMR cho thấy có các tín hiệu cộng hưởng của 17 carbon, trong đó có một carbon carbonyl (δC 192.8, C=O), 12 carbon thơm (δC 103.7–167.6), và bốn carbon olefin [δC 122.1 (C-α), 147.3 (C-), 125.0 (C-), 139.5 (C-)] (Bảng 3.9) Từ các dữ liệu trên kết luận hợp chất 7 thuộc khung (2E,4E)-1,5-diarylpenta-2,4-dien-1- one
Hình 3.10 Các tương quan HMBC và NOESY của hợp chất 7
KHẢO SÁT CẤU TRÚC CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ
3.4.1 Khảo sát cấu trúc của các hợp chất khung phenol
Hình 3.29 Cấu trúc của các hợp chất 21–29
Từ cao EtOAc của vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda), chúng tôi đã phân lập chín hợp chất có cấu trúc phenol (21–29) Đặc biệt, hợp chất 28 là hợp chất mới, lần đầu tiên được công bố trên thế giới.
25 lần đầu tiên được phân lập trong tự nhiên và công bố dữ liệu phổ NMR
Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định nhờ vào phổ NMR và giá trị năng lực triền quang, đồng thời so sánh với dữ liệu từ tài liệu tham khảo.
Hợp chất 21 là chất rắn màu trắng, dễ tan trong dung môi acetone Phân tích bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–MeOH (tỉ lệ 9:1) cho thấy kết quả vết tròn hấp thụ.
76 thu UV 254 nm, hiện hình với thuốc thử H2SO4 (20 %) hơ nóng, hiện vết màu tím đen
Hình 3.30 Cấu trúc của hợp chất protocatechuic acid (21)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 21 thể hiện các tín hiệu của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4 [δH 7.53 (d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.47 (dd, J = 8.3 và 2.0 Hz, H-6), 6.90 (d, J = 8.3 Hz, H-5)] (Bảng 3.23)
Bảng 3.23 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (acetone-d 6) của hợp chất 21 và protocatechuic acid
Vị trí 21 Protocatechuic acid δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Phổ 13 C NMR cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với bảy carbon, trong đó có một carbon carbonyl (δC 167.5, C=O), và sáu carbon thơm [δC 122.2 (C-1), 116.6 (C-
2), 144.9 (C-3), 150.0 (C-4), 114.9 (C-5), 122.9 (C-6)] (Bảng 3.23) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 21 là dẫn xuất của benzoic acid
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 21 được đề nghị là protocatechuic acid 66
Hợp chất 22 là một chất rắn màu trắng, có khả năng tan tốt trong dung môi acetone Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–AcOH (tỉ lệ 7:3), ta thu được vết tròn hấp dẫn.
77 thu UV 254 nm, hiện hình với thuốc thử H2SO4 (20 %) hơ nóng, hiện vết màu tím đen
Hình 3.31 Cấu trúc của hợp chất methyl gallate (22)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 22 thể hiện các tín hiệu của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4, 5 [δH 6.95 (2H, s, H-2 và H-6)] và một nhóm methoxy [δH 3.74, -OCH3] (Bảng 3.24)
Bảng 3.24 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (DMSO-d 6) của hợp chất 22 và methyl gallate
Vị trí 22 Methyl gallate δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Phổ 13 C NMR cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với bảy carbon, trong đó có một carbon carbonyl (δC 166.4, C=O), sáu carbon thơm [δC 119.4 (C-1), 108.6 (C-2 và C-6), 138.4 (C-4), 145.6 (C-3 và C-5)], và một carbon methoxy (δC 51.5, -OCH3) (Bảng 3.24) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 22 là dẫn xuất của benzoic acid Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 22 được đề nghị là methyl gallate 95,98 Hợp chất này đã được phân lập từ lá và cành của loài
Hợp chất 23 là một chất rắn màu trắng, có khả năng hòa tan tốt trong dung môi acetone Phân tích sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–AcOH (tỉ lệ 7:3) cho thấy vết tròn hấp dẫn.
78 thu UV 254 nm, hiện hình với thuốc thử H2SO4 (20 %) hơ nóng, hiện vết màu tím đen
Hình 3.32 Cấu trúc của hợp chất gallic acid (23)
Phổ 1 H và 13 C NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 23 và methyl gallate
(22) thể hiện sự tương đồng của vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4, 5 và một carbon carbonyl (δC 168.1, C=O), dự đoán hợp chất 23 cũng là dẫn xuất của benzoic acid
(Bảng 3.25) Tuy nhiên, phổ NMR của hợp chất 23 không cho tín hiệu của nhóm methoxy
Bảng 3.25 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (acetone-d 6) của hợp chất 23 và gallic acid
Vị trí 23 Gallic acid δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 23 được đề nghị là gallic acid 16
Hợp chất 24 là một chất rắn màu trắng, dễ tan trong acetone Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng với dung môi CHCl3–MeOH (tỷ lệ 95:5), hợp chất này tạo ra vết tròn hấp thụ ở bước sóng UV 254 nm Sau khi xử lý với thuốc thử vanillin/H2SO4 (1%) và hơ nóng, vết màu vàng cam xuất hiện.
Hình 3.33 Cấu trúc của hợp chất methyl orsellinate (24)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, acetone-d 6) của hợp chất 24 thể hiện các tín hiệu của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 2, 3, 5 [δH 6.23 (d, J = 2.4 Hz, H-4), 6.28 (d, J = 2.4
Hz, H-6)], một nhóm methoxy [δH 3.91 (s, -OCH3)], một nhóm methyl [δH 2.45 (s, -
CH3)], và một nhóm hydroxy kiềm nối [δH 11.60 (s, -OH)] (Bảng 3.26)
Bảng 3.26 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (acetone-d 6) của hợp chất 24 và methyl orsellinate
Vị trí 24 Methyl orsellinate δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Phổ 13 C NMR cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 9 carbon, trong đó có một carbon carbonyl ester (δC 173.0), sáu carbon thơm [δC 144.3 (C-1), 105.4 (C-2), 163.3 (C-3), 101.7 (C-4), 166.3 (C-5), 112.3 (C-6)], một carbon methoxy (δC 52.1, -OCH3), và một carbon methyl (δC 24.2, -CH3) (Bảng 3.26) Dựa vào các dữ liệu 1 H và 13 C NMR, cấu trúc của hợp chất 24 được đề nghị là dẫn xuất của -resorcylic acid
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 24 được đề nghị là methyl orsellinate 64
Hợp chất 25 là một chất lỏng màu trắng, dễ hòa tan trong acetone Khi thực hiện sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–MeOH (95:5), hợp chất này tạo ra vết tròn và hấp thụ ánh sáng UV tại 254 nm Sau khi xử lý với thuốc thử vanillin/H2SO4 (1 %) và hơ nóng, hợp chất hiện ra vết màu vàng cam.
Hình 3.34 Cấu trúc của hợp chất isoeverninic acid (25) Bảng 3.27 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (acetone-d 6) của hợp chất 25
Phổ 1 H và 13 C NMR (500 MHz, acetone-d 6) của hợp chất 25 và methyl orsellinate (24) thể hiện sự tương đồng với nhau về số lượng các tín hiệu, bao gồm vòng benzene thế ở vị trí 1, 2, 3, 5, một nhóm methoxy (δC 3.84, δC 56.3), một nhóm methyl (δC 2.33, δC 19.8), và một nhóm carbon carbonyl ester (δC 166.4) (Bảng 3.27) Tuy nhiên, trên phổ 1 H NMR không cho tín hiệu của nhóm hydroxy kiềm nối Dựa vào các dữ liệu 1 H và 13 C NMR, cấu trúc của hợp chất 25 được đề nghị là dẫn xuất của -resorcylic acid
Tương quan HMBC giữa nhóm -OCH3 và C-3 (δC 160.0) giúp xác nhận nhóm methoxy gắn tại vị trí C-3 của vòng benzene Ngoài ra, các tương quan HMBC giữa
H-6/C-5, H-6/C-2, H-6/-CH3, H-4/C-2, -CH3/C-1, -CH3/C-2, và -CH3/C-6 giúp xác định vị trí các nhóm thế trên vòng benzene (Hình 3.35)
Hình 3.35 Các tương quan HMBC của hợp chất 25
Hợp chất 25, được xác định là axit isoeverninic, đã được phân lập lần đầu tiên trong tự nhiên, theo dữ liệu phổ NMR Thông tin này được ghi nhận trong cơ sở dữ liệu SciFinder của Đại học quốc gia Chungnam vào tháng 10/2018, đánh dấu lần đầu tiên công bố dữ liệu phổ NMR của hợp chất này.
Hợp chất 26 là một chất rắn màu nâu, có khả năng tan tốt trong dung môi acetone Qua phương pháp sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi CHCl3–Me2CO (tỷ lệ 9:1), hợp chất này tạo ra vết tròn và hấp thụ ánh sáng UV tại 254 nm Khi được hiện hình bằng thuốc thử vanillin/H2SO4 (1%) và hơ nóng, hợp chất cho ra vết màu đỏ đen.
Hình 3.36 Cấu trúc của hợp chất orcinol (26)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, acetone-d 6) của hợp chất 26 thể hiện các tín hiệu của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 5 [δH 6.15 (3H, s, H-2, H-4, và H-6)] và một nhóm methyl [δH 2.15 (s, -CH3)] (Bảng 3.28)
Phổ 13 C NMR cho các tín hiệu cộng hưởng ứng với 7 carbon, trong đó có sáu carbon thơm [δC 140.6 (C-1), 108.3 (C-2 và C-6), 100.7 (C-4), 159.3 (C-3 và C-5)] và một carbon methyl (δC 21.5, -CH3) (Bảng 3.28) Từ các dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất 26 là dẫn xuất của resorcinol
Bảng 3.28 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR (acetone-d 6) của hợp chất 26 và orcinol
Vị trí 26 Orcinol δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
Kết hợp so sánh các dữ liệu phổ NMR với tài liệu tham khảo, hợp chất 26 được đề nghị là orcinol 64
Hợp chất 27 là một chất rắn màu trắng, dễ tan trong acetone Phân tích sắc ký lớp mỏng sử dụng hệ dung môi CHCl3–MeOH (9:1) cho thấy sự xuất hiện của vết tròn, hấp thu ở bước sóng UV 254 nm, và khi xử lý với thuốc thử vanillin/H2SO4 (1%) sau khi hơ nóng, vết màu xanh được hiện hình.
Hình 3.37 Cấu trúc của hợp chất tetracentronside A (27)
Phổ 1 H NMR (500 MHz, DMSO-d 6) của hợp chất 27 thể hiện các tín hiệu của một vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4, 5 [δH 6.29 (2H, s, H-2 và H-6)], một vòng benzene thế ở vị trí 1, 3, 4 [δH 7.35 (d, J = 2.0 Hz, H-2), 7.39 (dd, J = 8.3 và 2.0 Hz, H-6), 6.77 (d, J = 8.3 Hz, H-5)], một proton anomer [δH 4.94 (d, J = 7.7 Hz, H-1′)], một nhóm oxymethylene [δH 4.57 (dd, J = 12.0 và 1.9 Hz, H-6′a), 4.18 (dd, J = 12.0 và 6.9 Hz, H-6′b)], bốn nhóm oxymethine [δH 3.76 (m, H-5′), 3.33 (t, J = 8.9 Hz, H-3′), 3.24 (2H, m, H-2′ và H-4′)], và bốn nhóm methoxy [δH 3.74 (s, 3-OCH3), 3.61 (6H, s, 3-OCH3 và 5-OCH3), 3.55 (s, 4-OCH3)] (Bảng 3.29)
Bảng 3.29 Dữ liệu phổ 1 H và 13 C NMR của hợp chất 27 và tetracentronside A
Vị trí 27 (acetone-d 6) Tetracentronside A (CD3OD) δC, loại C δH (J, Hz) δC, loại C δH (J, Hz)
NHẬN XÉT VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA THÂN CÂY SƯNG CÓ ĐUÔI (SEMECARPUS CAUDATA) VÀ VỎ THÂN CÂY XUÂN THÔN NHIỀU
Từ cao CHCl3 của thân cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata), các nhà nghiên cứu đã phân lập được 20 hợp chất, bao gồm năm hợp chất khung phenol, ba hợp chất khung diarylalkanoid, bảy hợp chất khung flavonoid, ba hợp chất khung lignan, và hai hợp chất khung steroid Tất cả các hợp chất này đều là lần đầu tiên được phân lập trong chi Semecarpus, trong đó có ba hợp chất mới là diarylpentanoid 7, diarylheptanoid 8, và bischromanone 15 được công bố lần đầu trên thế giới.
Hình 3.61 Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ thân cây Sưng có đuôi
Hình 3.62 Cấu trúc của các hợp chất phân lập được từ vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda)
Từ cao EtOAc của vỏ thân cây Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) đã phân lập được 22 hợp chất (Hình 3.62), bao gồm chín hợp chất khung phenol (21–
29), hai hợp chất khung diarylalkanoid (30, 31), sáu hợp chất khung flavonoid (9–11, 32–34), ba hợp chất khung lignan (16, 17, 35), và hai hợp chất khung triterpenoid
Trong số 22 hợp chất được phân lập, có năm hợp chất (9–11, 16, và 17) cũng đã được chiết xuất từ cao CHCl3 của cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) Tất cả các hợp chất, ngoại trừ hợp chất 22, đều là lần đầu tiên được phân lập trong chi này.
Swintonia là một loài thực vật độc đáo, trong đó hợp chất dimer alkylresorcinol 28 được giới thiệu lần đầu tiên trên thế giới Hợp chất 25 cũng là một phát hiện mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên và đã được công bố dữ liệu phổ NMR Bên cạnh đó, hợp chất triterpenoid 37 là hợp chất đầu tiên được phân lập từ thực vật bậc cao.
Hai mẫu cây Sưng có đuôi (Semecarpus caudata) và Xuân thôn nhiều hoa (Swintonia floribunda) có sự tương đồng về cấu trúc khung của các hợp chất phân lập Cả hai mẫu cây đều chứa các hợp chất thuộc khung phenol, diarylalkanoid, flavonoid và lignan Đặc biệt, mẫu cây Sưng có đuôi đã phân lập được hai hợp chất steroid, trong khi mẫu cây Xuân thôn nhiều hoa lại cho thấy sự hiện diện của hai hợp chất triterpenoid.
3.6 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ ENZYME TYROSINASE CỦA CÁC HỢP CHẤT PHÂN LẬP ĐƯỢC
3.6.1 Kết quả thử hoạt tính in vitro của các hợp chất phân lập được
Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số 37 hợp chất, có 12 hợp chất (2, 4, 6–8, 11–14, 28, 30 và 34) có hoạt tính với giá trị IC50 < 100 M Các hợp chất thuộc khung lignan (16–18 và 35), steroid (19 và 20), và triterpenoid (36 và 37) không có hoạt tính (IC50 > 100 M) Trong số 14 hợp chất thuộc khung phenol, chỉ có 3 hợp chất thể hiện hoạt tính, trong đó hợp chất 2 có hoạt tính mạnh với IC50 = 2.35 M Đặc biệt, các hợp chất thuộc khung diarylalkanoid, ngoại trừ hợp chất 31, đều có khả năng ức chế enzyme tyrosinase, với ba hợp chất 6–8 thể hiện hoạt tính rất mạnh với giá trị IC50 lần lượt là 0.013, 0.033 và 0.11.
Các hợp chất flavonoid đã thể hiện hoạt tính vượt trội, với một số hợp chất mạnh hơn 3400, 1300 và 400 lần so với chất đối chứng dương kojic acid (IC50 = 44.6 M) Đặc biệt, trong số 10 hợp chất, có 5 hợp chất cho thấy hoạt tính, trong đó hai hợp chất 11 và 13 có hoạt tính mạnh hơn gấp đôi so với chất đối chứng dương.
Bảng 3.40 Kết quả thử hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất phân lập được
Khung Hợp chất Phần trăm ức chế (I %) IC 50
3.6.2 Nhận xét về tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc
Các kết quả về hoạt tính và cấu trúc hóa học của các hợp chất cho thấy hệ vòng thơm gắn các nhóm hydroxy và carbonyl bất bão hòa đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế enzyme tyrosinase Đối với hợp chất phenol, nhóm hydroxycarbonyl α,β-bất bão hòa của khung cinnamic acid gia tăng hoạt tính ức chế Tuy nhiên, sự hiện diện của nhóm methoxy tại C-3 của vòng benzene lại làm giảm mạnh hoạt tính ức chế này.
5) Ngoài ra, nhóm hydroxy tại C-3 của khung cinnamic acid sẽ giúp tăng hoạt tính ức chế (4, IC50 = 27.0 M) (Hình 3.63)
Hình 3.63 Mối tương quan hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và cấu trúc khung phenol
Các hợp chất diarylalkanoid 6–8 có nhóm carbonyl không bão hòa và hệ vòng benzene B với hai nhóm hydroxy tại vị trí C-2 và C-4, cho thấy khả năng ức chế enzyme tyrosinase mạnh mẽ Để làm rõ vai trò của nhóm prenyl, nghiên cứu đã thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase của hợp chất 2,4,2′,4′-tetrahydroxychalcone (38) với giá trị IC50 là 0.016 μM.
Sự hiện diện của nhóm prenyl không làm tăng hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase Ngoài ra, khi độ dài của mạch carbon liên hợp tăng (2C, 4C, 6C), hoạt tính ức chế enzyme này lại giảm đi (38 > 7 > 8).
Hình 3.64 thể hiện mối tương quan giữa hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và cấu trúc khung diarylalkanoid Đối với các hợp chất flavonoid, số lượng và vị trí của các nhóm hydroxy trên vòng thơm ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính của chúng Ở nồng độ 100 µM, phần trăm ức chế (I %) của hợp chất 9 cao gấp gần ba lần so với các hợp chất khác.
Số lượng nhóm hydroxy trong vòng B của cấu trúc flavonoid ảnh hưởng đến hoạt tính ức chế, với sự hiện diện đồng thời của nhóm hydroxy tại C-3 và C-5 làm tăng đáng kể hoạt tính.
Hình 3.65 Mối tương quan hoạt tính ức chế enzyme tyrosinase và cấu trúc khung flavonoid
3.6.3 Kết quả docking phân tử in silico trên mô hình enzyme oxytyrosinase
Enzyme tyrosinase có ba dạng cấu trúc chính: mettyrosinase, oxytyrosinase và deoxytyrosinase Trong số đó, chỉ có oxytyrosinase có khả năng xúc tác cho hai quá trình quan trọng: oxy hóa monophenol thành o-diphenol và oxy hóa o-diphenol thành o-quinone Quá trình này diễn ra nhờ sự hiện diện của hai ion Cu²⁺ và nhóm peroxide trong vùng hoạt tính của enzyme Ngoài ra, tyrosinase còn được chiết xuất từ nấm Agaricus.
Enzyme 113 bisporus (EC 1.14.18.1) có khả năng xúc tác cho cả hai quá trình oxy hóa, tương tự như oxytyrosinase Do đó, chúng tôi đã chọn mô hình enzyme oxytyrosinase để tiến hành docking phân tử, nhằm đạt được sự tương đồng giữa kết quả thử nghiệm hoạt tính in vitro và in silico, từ đó giải thích chính xác cơ chế ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất.
Quá trình docking phân tử trên enzyme oxytyrosinase (PDB ID: 1WX2) được thực hiện bằng phần mềm MOE 2016.0802, sử dụng trường lực Amber12:EHT Cấu trúc enzyme được hiệu chỉnh và vùng hoạt tính được xác định, bao gồm hai ion Cu²⁺, nhóm peroxide [O-O]²⁻, và 19 nhóm amino acid Sau khi hoàn tất quá trình docking, năm mô hình phức hợp enzyme-ligand với mức độ tương tác tốt nhất được đánh giá qua điểm docking S Cuối cùng, các tương tác được phân tích để đánh giá và so sánh khả năng ức chế enzyme tyrosinase của các hợp chất.
Trong vùng hoạt tính của enzyme, hai ion Cu 2+ và nhóm peroxide đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa phenol/catechol thành o-quinone Các hợp chất tương tác với hai ion Cu 2+ hoặc nhóm peroxide có khả năng làm bất hoạt enzym tyrosinase, ngăn chặn phản ứng oxy hóa Hơn nữa, các hợp chất tương tác với các nhóm amino acid trong vùng hoạt tính cũng có thể khóa tâm xúc tác của enzyme.
Cấu trúc của chất đối chứng dương kojic acid, các hợp chất khung phenol (2–