Luận văn thạc sĩ nghiên cứu nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn đoán bệnh cúm a h5n1 bằng virus a anhui 05 h5n1

ðặt vấn ủề

Nhờ chính sách phát triển chăn nuôi của Đảng và Nhà nước, ngành chăn nuôi gia cầm đã có những bước tiến vượt bậc trong những năm gần đây, với sự đầu tư vào khoa học kỹ thuật, nghiên cứu giống, thức ăn và các biện pháp thú y Sự hợp tác quốc tế đã giúp phát triển hàng ngàn trang trại chăn nuôi gia cầm, mang lại lợi nhuận cho người chăn nuôi và đóng góp vào ngân sách quốc gia Tuy nhiên, ngành chăn nuôi cũng phải đối mặt với dịch bệnh, đặc biệt là bệnh cúm gia cầm, một mối lo ngại lớn trên toàn cầu Bệnh cúm gia cầm đã gây thiệt hại nghiêm trọng, làm chết hàng trăm triệu gia cầm và hàng triệu con khác bị tiêu hủy để ngăn chặn dịch lây lan, ảnh hưởng nặng nề đến nền kinh tế của các quốc gia có dịch.

Từ cuối năm 2003 đến nay, bệnh cúm gia cầm H5N1 đã bùng phát ở hầu hết các tỉnh, thành trong cả nước, dẫn đến hàng triệu gia cầm bị tiêu hủy và gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế Bệnh này đặc biệt nghiêm trọng do khả năng lây nhiễm cao và tỷ lệ tử vong ở người Nhà nước đã áp dụng nhiều biện pháp đồng bộ để phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh, nhằm giảm thiệt hại kinh tế cho người chăn nuôi Tuy nhiên, việc tiêu diệt bệnh vẫn gặp nhiều khó khăn.

Để kiểm soát bệnh trong lĩnh vực nông nghiệp, việc tiêm phòng và giám sát huyết thanh là rất quan trọng nhằm theo dõi hiệu giá kháng thể sau tiêm Để thực hiện việc giám sát này, cần có nguyên liệu cho phản ứng, có thể mua hoặc tự chế Hiện nay, các phòng thí nghiệm tại Việt Nam vẫn sử dụng nguyên liệu kháng nguyên nhập khẩu từ Weibridge – Anh, tuy nhiên, nguyên liệu này có giá thành khá cao và chủng virus cũng cần được xem xét.

Vi rút H5N1, được phân lập tại Scotland từ năm 1959, có những khác biệt về kháng nguyên và di truyền so với các chủng vi rút đang lưu hành tại Việt Nam.

Bên cạnh việc nghiên cứu, các chủng virus cúm H5N1 lưu hành tại Việt Nam thường xuyên biến đổi, xuất hiện nhiều nhánh mới (Nguyễn Tựng và Ken Inui, 2011) Việc chủ động được nguồn nguyên liệu kháng nguyên H5N1 cho xét nghiệm là hết sức cần thiết đối với các phòng thí nghiệm trong điều kiện kinh tế hiện nay, đồng thời tăng cường khả năng giám sát sau tiêm phòng đối với bệnh cúm gia cầm khi có nhiều nhánh virus lưu hành Trước tình hình thiệt hại về mặt kinh tế hàng năm do dịch bệnh H5N1 gây ra, sự nguy hại đối với sức khỏe con người và sự biến chủng của virus, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên chẩn đoán bệnh Cúm A H5N1 bằng Virus A/Anhui/05-H5N1.”

Mục tiờu của ủề tài

Nghiên cứu và sản xuất kháng nguyên H5N1 vô hoạt là cần thiết cho việc chẩn đoán xét nghiệm kháng thể đối với kháng nguyên H5 của vi rút cúm gia cầm thông qua phương pháp HI.

NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU25 3.1 Nội dung

Nguyên liệu

- Kháng nguyên do Anh sản xuất từ chủng vi rút A/Chicken/Scotland/59/H5N1, nhận từ phòng thí nghiệm tham chiếu cúm gia cầm của Weibridge (Anh Quốc)

- Chủng vi rút A/Anhui/05-H5N1 nhận từ Centre for Disease Control- CDC(USA)

- Trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi

- Kháng huyết thanh chuẩn H5N1 nhận từ phòng thí nghiệm tham chiếu cúm gia cầm của Weibridge (Anh Quốc)

- Huyết thanh của gia cầm ủó ủược tiờm phũng vắc xin H5N1-Re1 và H5N1-Re5 ủược thu thập từ 3 tỉnh Hà Nội, Nam ðịnh và Vĩnh Phỳc

- Phầm mềm phân tích các thông số dịch tễ - thống kê R, phiên bản 2.14.2

R Development Core Team (2012) và Bộ công thức tính toán các thông số dịch tễ - thống kê epiR, phiên bản 09.34 (Stevenson., 2012)

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……… 26

- Môi trường, dụng cụ, hóa chất, nguyên liệu, phòng thí nghiệm Trung Tâm Chẩn ðoán Thú Y Trung Ương

Kháng nguyên H5N1 INACTIVATED ANTIGEN A/CK/SCOT/59

- Kit Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep chiết tách RNA

- Kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR và primer/probe ủể kiểm tra sự bài thải vi rút bằng phương pháp Real time PCR.

Kết quả tiờm truyền xỏc ủịnh tớnh ổn ủịnh và nồng ủộ pha loóng tốt nhất

nhất cho nhân giống vi rút

Vi rỳt A/Anhui/05-H5N1 được cung cấp bởi CDC, là chủng vi rỳt cúm gia cầm có độc lực cao, phân lập năm 2005 Vi rỳt này đã được xóa gen bằng công nghệ gen và lắp ghép nhân tạo thông qua kỹ thuật di truyền Mặc dù vi rỳt đã mất tính độc nhưng vẫn giữ nguyên bản chất đặc tính kháng nguyên Vi rỳt có khả năng thích ứng và nhân lên khi nuôi cấy trên phôi gà.

Giống vi rỳt cỳm gia cầm A/Anhui/05-H5N1 được sử dụng làm giống gốc trong nghiên cứu chế kháng nguyên H5N1 phục vụ cho phản ứng xét nghiệm phát hiện kháng thể kháng kháng nguyên H5 Để chọn nồng độ pha loãng thích hợp cho giống vi rỳt, các nhà nghiên cứu đã tiến hành pha loãng vi rút cúm gia cầm A/Anhui/05-H5N1 thành nhiều nồng độ từ 10^-3 đến 10^-7 Sau đó, huyễn dịch vi rỳt ở các nồng độ này được tiêm vào xoang niệu mô của trứng gà có phôi 9-10 ngày tuổi với liều 0.1ml/phôi.

5 phụi cho mỗi nồng ủộ pha loóng

Phụi trứng được ấp tiếp tục trong 96 giờ với tiêu chuẩn phụi trứng không chết Mục tiêu của thí nghiệm này là để xác định nồng độ pha loãng thích hợp nhằm thu hoạch được lượng virus nhiều nhất, hoặc nói cách khác là thu hoạch được huyết thanh virus cho kết quả HA cao nhất Hỗn dịch virus này sẽ được sử dụng cho giống virus để chế kháng nguyên Kết quả sau 3 lần thử nghiệm đã xác định nồng độ pha loãng thích hợp, được trình bày trong bảng 4.1.

Bảng 4.1: Kết quả nhân giống vi rút H5N1 A/Anhui/05-H5N1

Nồng ủộ pha loóng vi rỳt Giống vi rút

(lần 1) sau tiêm 5 8 6 6 6 (-) trước tiêm 2 1 (-) (-) (-) (-)

(lần 2) sau tiêm 5 8 6 6 6 (-) trước tiêm 2 1 (-) (-) (-) (-)

Trong lần thử nghiệm đầu tiên, trước khi tiêm chủng để gây nhiễm, nồng độ pha loãng 10^-3 và 10^-4 cho hiệu giá 2 log2 và 1 log2, trong khi các nồng độ khác cho kết quả HA âm tính.

Sau khi tiêm ủ để gây nhiễm ở nồng độ 10^-3, hiệu giá HA đạt 5 log2; ở nồng độ 10^-4, hiệu giá HA là 8 log2 Tại các nồng độ 10^-5, 10^-6 và 10^-7, hiệu giá HA ghi nhận là 6 log2, trong khi ở nồng độ 10^-8, kết quả cho thấy âm tính.

Lần thử nghiệm 2,3 cho kết quả tương tự như lần thử nghiệm 1

Nồng độ 10^-4 của vi rút A/Anhui/05-H5N1 cho thấy hiệu quả tối ưu, với hiệu giá HA cao nhất đạt 8 log2 Ở các nồng độ thấp hơn hoặc cao hơn, lượng vi rút thu được trong dịch niệu đều thấp hơn so với nồng độ 10^-4.

Giống vi rỳt A/Anhui/05-H5N1 ủó ủược CDC thử nghiệm tớnh ổn ủịnh Tuy nhiờn, khi nghiờn cứu ủể sản xuất khỏng nguyờn cỳm tại Việt Nam chỳng tụi

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang tiến hành kiểm tra tính ổn định của giống virus nhằm xác định giống virus không thay đổi thuộc lực và tính kháng nguyên.

Sử dụng vi rỳt pha loóng ở nồng độ 10^-4 để xác định tính ổn định của vi rỳt qua các lần tiêm truyền Kiểm tra lại hiệu giá HA của nồng độ này nhằm mục đích xác định vi rỳt giống gốc không thay đổi thuộc lực và tính kháng nguyên qua 5 người nhân giống.

Xỏc ủịnh tớnh ổn ủịnh của vi rỳt chỳng tụi tiến hành theo sơ ủồ 4.1.sau:

Huyễn dịch Vi rút Nồng ủộ 10 -4

Tiêm phôi trứng 1: Kiểm tra HA: 8log2

Tiêm phôi trứng 2,3,4: Kiểm tra HA: 8log2

Như vậy giống vi rỳt A/Anhui/05 – H5N1 ủảm bảo ổn ủịnh ủể nghiờn cứu sản xuất kháng nguyên Cúm A H5N1

Dựa trên các kết quả nghiên cứu, vi rút giống gốc A/Anhui/05-H5N1 cho thấy tính ổn định cao trong điều kiện môi trường, điều này hỗ trợ cho việc sản xuất kháng nguyên cúm A/H5N1 Nồng độ pha loãng tối ưu cho giống vi rút này được xác định là 10^-4.

Kết quả kiểm tra tính an toàn của giống vi rút H5N1 trên gà

Vi rút gốc rỳt A/Anhui/05-H5N1 đã được chỉnh sửa bằng cách cắt bỏ đoạn gen cú ập lực cao, nhưng vẫn giữ nguyên tính khả năng gây bệnh Do đó, cần tiến hành kiểm tra lại tính an toàn của vi rút này trên gà.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội thực hiện luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp nhằm kiểm tra tính an toàn của virus trên gà chùng tụi, sử dụng giống gà Lương Phượng 4 tuần tuổi.

Sau mỗi lần tiêm truyền phôi trứng gà, dịch niệu mụn được thu hoạch và tiếp tục tiêm cho gà khỏe với liều 1ml/gà (tiêm vào cơ lườn) để kiểm tra mức độ an toàn đối với gà Tổng số gà sử dụng cho một lần tiêm là 10 con.

(3 lần) Gà ủược theo dừi trong vũng 10 ngày tại khu chuồng nuụi an toàn sinh học của Trung tâm Chẩn đốn Thú y Trung ương

Hỡnh 4.1 Chuồng nuụi gà trong ủiều kiện an toàn sinh học

Lấy dịch ngoỏy ổ nhớp vào thời ủiểm 3 và 10 ngày sau khi tiờm ủể kiểm tra sự bài thải của vi rút bằng phương pháp Real time PCR

Quy trỡnh tiờm truyền này ủược lập lại 3 lần, với kết quả ủại diện ủược trình bày tại Bảng 4.2

Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra tính an toàn của vi rút A/Anhui/05-H5N1

Kiểm tra bài thải vi rút sau khi tiêm (mẫu swab) Giống vi rút

Tổng số gà ủược tiêm

3 ngày 10 ngày A/Anhui/05-H5N1 10 Gà khỏe mạnh (-) (-)

* (-) âm tínhKết quả sau 3 lần kiểm tra (Bảng 2) cho thấy:

-Tất cả số gà ủược tiờm cho mỗi lần là 10 con (3 lần x 10 30 con)

Gà hoàn toàn khỏe mạnh, không có dấu hiệu bệnh lý, tiêu thụ thức ăn và nước uống tốt, đồng thời không bài thải virus H5N1, được xác nhận qua xét nghiệm Real time PCR cho kết quả âm tính.

Giống vi rút A/Anhui/05-H5N1 hiện nay không còn khả năng gây bệnh cho gà, đồng thời cũng không còn sức mạnh để gây bệnh nghiêm trọng trên đàn gia cầm.

Kết quả vô hoạt vi rút bằng Formaldehyde

Giống vi rỳt A/Anhui/05-H5N1 đã được xác nhận an toàn sau khi được xử lý bằng formaldehyde với các tỷ lệ 1%, 10/00 và 10/000, trong thời gian tiếp xúc 30 phút.

Mục ủớch vụ hoạt hoàn toàn ủược vi rỳt mà khụng làm thay ủổi hiệu giỏ

Mức ủộ vụ hoạt của vi rỳt ủược kiểm tra bằng cỏch tiờm vào xoang niệu mô của phôi gà 9-10 ngày tuổi với liều 0.1ml/phôi

Mỗi nồng ủ được kiểm tra với 10 mẫu và thí nghiệm được lặp lại 3 lần Sau thời gian theo dõi 5 ngày, thu hoạch dịch niệu và xác định virus bằng phương pháp HA Tiến hành mổ khám phôi và quan sát bệnh tích phôi, đồng thời đánh giá mức độ vô hoạt qua hai chỉ tiêu.

+ Phôi gà phát triển bình thường hay không

+ Kết quả kiểm tra nước niệu mụ ủể phỏt hiện vi rỳt

Kết quả ủược trỡnh bầy ở bảng 4.3

Bảng 4.3: Kết quả xỏc ủịnh nồng ủộ formaldehyde dựng ủể vụ hoạt vi rỳt

Số phôi trứng gà ủược tiờm

Kết quả kiểm tra nước niệu bằng phản ứng HA

Nồng ủộ 1% tỷ lệ số phụi kiểm tra chết 100%, thu dịch niệu mụ kiểm tra

Khi HA cho kết quả âm tính, điều này có nghĩa là không có virus hiện diện Ở nồng độ này, virus sẽ chết, nhưng formaldehyde lại gây độc và làm hại tế bào, vì vậy chúng ta không nên sử dụng nồng độ này.

Nồng độ formaldehyde 1.0/00 có tỷ lệ số phụi kiểm tra chết lên đến 60%, cho thấy kết quả kiểm tra hàm lượng không đạt yêu cầu Do đó, chúng ta không nên lựa chọn nồng độ formaldehyde này vì nó gây độc hại và có thể tiêu diệt các vi sinh vật.

Nồng độ 1 0/000 tỷ lệ phụi chết là 0%, kiểm tra hàm lượng cho kết quả âm tính, chứng tỏ virus đã bị tiêu diệt hoàn toàn và không gây nguy hiểm cho sức khỏe.

Như vậy, sử dụng nồng ủộ fomaldehyde 1 0 /000 ủó hoàn toàn vụ hoạt ủược vi rỳt A/Anhui/05-H5N1, và khụng làm thay ủổi hiệu giỏ HA của khỏng nguyên cúm.

Kết quả kiểm tra ủộ vụ trựng của sản phẩm khỏng nguyờn tự chế

Giống khỏng nguyờn A/Anhui/05-H5N1 ủó ủược vụ hoạt bằng formaldehyde lần lượt ủược kiểm tra tớnh vụ trựng bằng cỏch cấy huyễn dịch vi rút lên các môi trường:

- Nước thịt yếm khí và môi trường kiểm tra nấm Sarbourad theo tiêu chuẩn TCVN

Mỗi loại môi trường được nuôi cấy trong 2 ống nghiệm, mỗi ống chứa 0,1ml Sau khi nuôi cấy, các ống môi trường được ủ ở nhiệt độ 37 độ C và theo dõi trong vòng 7 ngày Riêng môi trường kiểm tra nấm được ủ ở nhiệt độ phòng.

Kết quả thu được từ ba lần kiểm tra trên các môi trường đặc hiệu cho thấy không phát hiện được vi khuẩn mọc trên các môi trường kiểm tra theo sơ đồ 4.2.

Môi trường thạch nấm (-) Sản phẩm khỏng nguyờn A/Anhui/05-H5N1 ủó vụ hoạt = Formaldehyde 1 0 / 000

Chế phẩm kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 sau khi được xử lý bằng dung dịch formaldehyde với nồng độ 1/1000 vẫn duy trì tính ổn định tương tự như dung dịch ban đầu thu hoạch từ dịch niệu mụ của trứng cú phụi 9.

10 ngày tuổi ủược tiờm truyền vi rỳt

Kết quả kiểm tra tính kháng nguyên của sản phẩm kháng nguyên tự chế bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)

chế bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu gà (HA)

Chế phẩm vi rút A/Anhui/05-H5N1 được kiểm tra tính kháng nguyên bằng phản ứng HA gây ngưng kết hồng cầu gà Kết quả cho thấy, sau khi xử lý, vi rút A/Anhui/05-H5N1 vẫn giữ được tính kháng nguyên với hiệu giá HA ổn định là 8 log2, tương tự như trước khi xử lý Điều này chứng tỏ quá trình xử lý vi rút bằng formaldehyde ở nồng độ 1/10000 hoàn toàn không ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của vi rút cúm A/Anhui/05-H5N1.

Kết quả ủỏnh giỏ chất lượng của cỏc chế phẩm khỏng nguyờn

4.6.1 đánh giá ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu với các mẫu ựối chứng dương và âm

Xác định độ nhạy của sản phẩm kháng nguyên cẩm nhằm mục đích đánh giá khả năng phát hiện các mẫu huyết thanh gia cầm đã tiêm phòng vắc xin cúm H5N1 có kháng thể kháng virus H5.

Xác định độ đặc hiệu trong chẩn đoán sản phẩm kháng nguyên cúm là cần thiết để nâng cao khả năng phát hiện các mẫu huyết thanh gia cầm không có khả năng kháng virus H5.

Sử dụng 30 mẫu huyết thanh dương tính và 30 mẫu huyết thanh âm tính ủó ủược xỏc ủịnh từ trước bằng khỏng nguyờn chuẩn mua từ Anh

Qua 2 lần thử nghiệm lặp lại kiểm tra đánh giá độ nhạy chẩn đốn và độ đặc hiệu chẩn đốn Kết quả được trình bầy ở bảng 4.4

Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra ủộ nhạy và ủộ ủặc hiệu của khỏng nguyờn tự chế A/Anhui/05-H5N1

Mẫu huyết thanh chuẩn Giống Vi rút

Số mẫu (+) Số mẫu (-) Tổng số

Chế phẩm khỏng nguyờn A/Anhui/05-H5N1 tự chế cho thấy độ nhạy và độ đặc hiệu cao trong phản ứng HI, giúp phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus cúm gia cầm.

+ Khỏng nguyờn A/Anhui/05-H5N1 ủược ủỏnh giỏ là cú 30 mẫu dương tớnh trờn tổng 30 mẫu kiểm tra,ủộ nhạy bằng 30/300% Cú 29/30 mẫu õm tớnh ủộ ủặc hiệu 29/30= 96,67%

Kháng nguyên tự chế chỉ phát hiện kháng thể H5 một cách đặc hiệu Điều này cho phép kháng nguyên H5 do chúng tôi tự chế được sử dụng trong phản ứng HI để phát hiện kháng thể đặc hiệu với virus cúm gia cầm H5 có trong huyết thanh của gia cầm Sự phát triển này mở ra triển vọng thay thế kháng nguyên nhập khẩu với số lượng lớn đang được sử dụng trong các chương trình giám sát chủ động và bị động.

4.6.2 đánh giá ựộ ựặc hiệu với các kháng thể cúm gia cầm subtype khác

Chế phẩm khỏng nguyờn A/Anhui/05-H5N1 tự chế ủược kiểm tra ủộ ủặc hiệu với kháng thể cúm gia cầm thuộc một số suptype khác (H4, H6, H7, H9) bằng phản ứng HI

Mỗi loại kháng thể cúm thuộc các suptype khác ta sử dụng 5 mẫu kiểm tra

Kiểm tra ủộ ủặc hiệu của khỏng nguyờn tự chế ủược tiến hành theo bảng 4.5 sau, và ủược lặp lại 3 lần:

Bảng 4.5 Kết quả ủỏnh giỏ ủộ ủặc hiệu của cỏc chế phẩm khỏng nguyờn tự chế với một số kháng thể chuẩn thuộc các subtype khác nhau

Số lượng (sau 3 lần kiểm tra) A/Anhui/05-H5N1

Tất cả các mẫu của kháng thể cúm gia cầm thuộc các suptype khác khi kiểm tra với khỏng nguyờn A/Anhui05-H5N1 ủều cho kết quả õm tớnh

Chế phẩm kháng nguyên cầm A/Anhui05-H5N1 chỉ có khả năng phát hiện kháng thể cúm H5 mà không gây phản ứng chéo với các kháng thể của các subtype khác như H4N1, H6N2, H7N7 và H9N2.

Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh bằng phản ứng HI với cỏc mẫu huyết thanh gia cầm ủược thu thập từ Hà Nội, Nam ðịnh và Vĩnh Phúc

Sản phẩm khỏng nguyờn A/Anhui05-H5N1 sau khi chỳng tụi ủó kiểm tra ủảm bảo cỏc yờu cầu về ủộ nhạy ủộ ủặc hiệu, tớnh vụ trựng,…Chỳng tụi tiến

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tiến hành nghiên cứu luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp nhằm so sánh sản phẩm kháng nguyên tự chế với kháng nguyên của Anh thông qua phản ứng HI Để thực hiện so sánh này, nhóm nghiên cứu đã thu thập 3000 mẫu huyết thanh từ ba địa phương: Hà Nội, Nam Định và Vĩnh Phúc Phản ứng HI được tiến hành tại Phòng Thí nghiệm Vi rút học thuộc Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, đảm bảo tuân thủ quy trình và tiêu chuẩn TCVN đã được ban hành.

Kết quả xác định khả năng gây bệnh của virus cúm gia cầm H5N1, cụ thể là chủng A/Anhui05-H5N1, được trình bày qua phản ứng HI Các thông tin chi tiết về khả năng gây bệnh của chủng này so với chủng của Anh được thể hiện trong bảng 4.6 và biểu đồ 4.1.

Bảng 4.6 Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên chuẩn

A/Anhui/05-H5N1 kháng nguyên chuẩn của UK

Nội Tỷ lệ dương tính (95% CI) 68.31 (66.5-70.09) 69.91 (68.11-71.65)

Tỷ lệ dương tính (95% CI) 41.55 (33.35-50.11) 60.56 (52.02-68.65)

Tổng số Tỷ lệ dương tính (95% CI) 69.07 (67.38-70.72) 71.50 (69.85-73.11)

Biểu ủồ 4.1 trình bày sự so sánh kết quả xét nghiệm HI giữa kháng nguyên tự chế (A/Anhui/05-H5N1) và kháng nguyên của Anh đối với các mẫu huyết thanh gia cầm đã được tiêm phòng vắc xin H5N1 tại Hà Nội, Nam Định và Vĩnh Phúc.

Tổng số kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 kháng nguyên chuẩn của UK

Biểu ủồ 4.1 So sỏnh khỏng nguyờn tự chế và khỏng nguyờn chuẩn bằng phản ứng HI với các mẫu huyết thanh thu thập

Kết quả Bảng 4.6 và Biểu ủồ 4.2 cho thấy:

Mẫu huyết thanh thu thập từ Hà Nội có tỷ lệ bảo hộ 68.31% với kháng nguyên A/Anhui05-H5N1 và tỷ lệ 69.91% với kháng nguyên của Anh

Mẫu huyết thanh thu thập từ Nam ðịnh có tỷ lệ bảo hộ 41.55% với kháng nguyên A/Anhui05-H5N1 và tỷ lệ 60.56% với kháng nguyên của Anh

Mẫu huyết thanh thu thập từ Vĩnh Phúc có tỷ lệ bảo hộ 95.52% với kháng nguyên A/Anhui05-H5N1 và tỷ lệ 97.31% với kháng nguyên của Anh

Trong nghiên cứu về huyết thanh, chúng tôi đã thu thập 3000 mẫu từ các địa phương khác nhau Kết quả cho thấy có 2072 mẫu dương tính với kháng nguyên A/Anhui05-H5N1, đạt tỷ lệ bảo hộ 69.07% So với số liệu từ Anh, nơi có 2145 mẫu dương tính, tỷ lệ bảo hộ là 71.50%.

Khi so sánh hai loại kháng nguyên, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ mẫu huyết thanh khác nhau giữa các tỉnh và các loại kháng nguyên, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05) Điều này cho thấy các kháng nguyên tự chế (A/Anhui05-H5N1) cho kết quả xét nghiệm tương đương với kháng nguyên của Anh Để tăng tính thuyết phục, chúng tôi đã tiến hành so sánh kết quả xét nghiệm mẫu huyết thanh của gà và vịt khi sử dụng hai loại kháng nguyên này.

Bảng 4.7 trình bày kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh gia cầm đã được tiêm phòng vaccine H5N1-Re1 và H5N1-Re5 Phản ứng HI được thực hiện bằng cách sử dụng kháng nguyên tự chế và kháng nguyên của Anh.

Kết quả so sánh kháng nguyên tự chế và kháng nguyên chuẩn

Kết quả trên bảng 4.7 cho thấy:

Huyết thanh Gà thu thập có tỷ lệ bảo hộ 77.53% với kháng nguyên tự chế và có tỷ lệ bảo hộ 79.06% với kháng nguyên của Anh

Huyết thanh Vịt thu thập có tỷ lệ bảo hộ 47.19% với kháng nguyên tự chế và có tỷ lệ bảo hộ 51.97% với kháng nguyên của Anh

Trong nghiên cứu về mẫu huyết thanh thu thập từ gà vịt, chúng tôi đã phân tích 3000 mẫu với kháng nguyên A/Anhui05-H5N1 Kết quả cho thấy có 2072 mẫu dương tính, đạt tỷ lệ bảo hộ 69.07% So với kháng nguyên của Anh, số mẫu dương tính là 2145/3000, tương ứng với tỷ lệ bảo hộ 71.50%.

Tỷ lệ mẫu huyết thanh giữa gà và vịt có sự khác biệt đối với hai loại kháng nguyên, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (P > 0.05) Điều này cho thấy kháng nguyên tự chế A/Anhui05-H5N1 cho kết quả xét nghiệm tương đương với kháng nguyên chuẩn Kết quả đánh giá mối tương quan giữa kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 và kháng nguyên của Anh A/Chicken/Scotland/59/H5N1 cũng được ghi nhận.

Kết quả từ bảng 4.8 cho thấy, trong tổng số mẫu xét nghiệm, có 2.072 mẫu dương tính với kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 (HI ≥ 1/16) và 2.145 mẫu với kháng nguyên chuẩn của UK Cụ thể, 144 mẫu (4,8%) dương tính với kháng nguyên UK nhưng âm tính với kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1, trong khi 71 mẫu (2,37%) dương tính với A/Anhui/05-H5N1 nhưng âm tính với UK Tổng số mẫu âm tính với A/Anhui/05-H5N1 là 928, so với 855 mẫu âm tính với kháng nguyên UK.

Mối tương quan về hiệu giá HI khi sử dụng kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 so với kháng nguyên chuẩn của UK được thể hiện qua biểu đồ 4.2 Biểu đồ này cho thấy, khi so sánh cả độ chuẩn xác và độ chính xác giữa hai loại kháng nguyên, mức độ tương đồng đạt 82% (95% CI 81 – 84%) Mặc dù mức độ tương đồng này được đánh giá tốt, nhưng vẫn thấp hơn một cách đáng kể so với kháng nguyên UK.

Bảng 4.8 Phân bố kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh theo hiệu giá

HI và mối tương quan giữa kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 và kháng nguyên chuẩn của UK A/Chicken/Scotland/59/H5N1 (HI titer – log2)

Biểu ủồ 4.2 trình bày mối tương quan về hiệu giá kháng thể H5N1 giữa hai loại kháng nguyên A/Anhui/05-H5N1 và kháng nguyên chuẩn của UK Nghiên cứu sử dụng phương pháp so sánh cộng hợp giữa ủộ chuẩn xác và ủộ chính xác để đánh giá hiệu quả của các kháng nguyên này.

Từ biểu ủồ 4.2 cho ta thấy số mẫu ủạt bảo hộ với khỏng nguyờn rự chế là

2072 và với kháng nguyên của Anh 2145 mẫu

Số mẫu khụng ủạt bảo hộ với khỏng nguyờn tự chế là 928 mẫu, trong khi với khỏng nguyên của Anh là 855 mẫu Hệ số tương quan R=0.82 cho thấy mối quan hệ tương quan thuận và mạnh giữa hai biến này.

Như vậy, khỏng nguyờn A/Anhui05-H5N1 và khỏng nguyờn của Anh cú ủộ tương ủồng cao

Kết quả xỏc ủịnh thời gian bảo quản khỏng nguyờn tự chế

- đánh giá phương pháp bảo quản:

Khỏng nguyờn ủược giữ ủụng lạnh ở nhiệt ủộ -80 o C, và giữ ở nhiệt ủộ 2-8 o C

- Sản phẩm khỏng nguyờn ủược tiến hành kiểm tra ủịnh kỳ ở cỏc thời ủiểm 3 ngày, 1 tuần, 2 tuần, 1 thỏng, 2 thỏng, 6 thỏng

Kết quả ủược trỡnh bày ở Bảng 4.9

Bảng 4.9: Kết quả xỏc ủịnh thời gian bảo quản chế phẩm khỏng nguyờn

Thời gian bảo quản Chế phẩm kháng nguyên 3 ngày

Hiệu giá HA (log 2) ở điều kiện -80°C cho thấy chế phẩm kháng nguyên ổn định tới 6 tháng, với hiệu giá HA đạt 8log2 Trong khi đó, ở điều kiện 2-8°C, chế phẩm kháng nguyên ổn định được 2 tuần, sau đó giảm hiệu giá HA xuống 6log2, 2log2 ở thời điểm 3 tháng và kết quả ẩm tính ở tháng thứ 6.

Như vậy ở ủiều kiện -80 o C khỏng nguyờn tự chế ổn ủịnh chất lượng cho tới tháng thứ 6

Định dạng
Số trang	67
Dung lượng	1,48 MB