Mục tiêu đề tài
- Chọn lọc các chủng Trichoderma sp có khả năng đối tốt với nấm Scytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long
- Thử nghiệm khả năng sử dụng chế phẩm Trichoderma sp dạng lỏng để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cành thanh long
UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
3 Tính mới và sáng tạo:
- Đánh giá khả năng bảo quản chế phẩm bào tử Trichoderma ở dạng lỏng
- Thử nghiệm khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu trên thanh long bằng dịch bào tử
- Xác định được các chủng Trichoderma có hiệu quả đối kháng cao với nấm Scytalidium gây bệnh đốm nâu trên thanh long đạt lần lượt là 100% đối với chủng T4,
-Mật độ bào tử Trichoderma dạng lỏng sau 3 tháng bảo quản đạt 4,3 x 10 6 bào tử /ml và đạt 4,7 x 10 6 bào tử /ml
-Xác định mật độ bào tử nấm Trichoderma bằng phương pháp trải đĩa cho kết quả thấp hơn phương pháp đếm trực tiếp khoảng từ 4 đến 8 lần
-Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chế phẩm dịch bào tử Trichoderma trên cành thanh long giảm từ 26,7% xuống còn 6,7%
5 Đóng góp về mặt kinh tế - xã hội, giáo dục và đào tạo, an ninh, quốc phòng và khả năng áp dụng của đề tài:
Xây dựng các biện pháp sinh học để kiểm soát bệnh đốm nâu trên thanh long góp phần xây dựng nền nông nghiệp hữu cơ bền vững.
Công bố khoa học của sinh viên dựa trên kết quả nghiên cứu của đề tài cần ghi rõ họ tên tác giả, nhan đề bài viết và các thông tin xuất bản liên quan Ngoài ra, nếu có, nên bao gồm nhận xét và đánh giá từ cơ sở đã áp dụng các kết quả nghiên cứu này.
Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài Đỗ Quỳnh Hương
Nhận xét của người hướng dẫn về những đóng góp khoa học của sinh viên thực hiện đề tài :
Xác nhận của lãnh đạo khoa
UBND TỈNH BÌNH DƯƠNG CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
THÔNG TIN VỀ SINH VIÊN CHỊU TRÁCH NHIỆM CHÍNH THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
I SƠ LƯỢC VỀ SINH VIÊN:
Họ và tên: Đỗ Quỳnh Hương
Khoa: Khoa học Tự nhiên Địa chỉ liên hệ: trường Đại học Thủ Dầu Một Điện thoại: 01697815603
II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP Ảnh 4x6
Ngành học: Sư phạm Sinh học Khoa: Tài Nguyên Môi Trường
Kết quả xếp loại học tập: Trung bình
Ngành học: Sư phạm Sinh học Khoa: Công nghệ Sinh học
Kết quả xếp loại học tập: Trung bình
Xác nhận của lãnh đạo khoa Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài Đỗ Quỳnh Hương
TRƯỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN Độc lập - Tự do - Hạnh phúc , ngày tháng năm
Kính gửi: Ban tổ chức Giải thưởng “Tài năng khoa học trẻ Đại học Thủ Dầu Một”
Tên tôi (chúng tôi) là: Đỗ Quỳnh Hương Sinh ngày : 27 tháng 02 năm 1997
- Đặng Ngọc Quỳnh Sinh viên năm thứ: 3 /Tổng số năm đào tạo: 3
Ngành học: Cao đẳng sư phạm Sinh học
Thông tin cá nhân của sinh viên chịu trách nhiệm chính: Địa chỉ liên hệ:
Số điện thoại (cố định, di động): Địa chỉ email:
Chúng tôi kính gửi đơn này tới Ban tổ chức, với mong muốn được trình bày đề tài nghiên cứu khoa học nhằm tham gia xét Giải thưởng “Tài năng khoa học trẻ Đại học Thủ Dầu Một” năm 2018.
Tên đề tài: Sàng lọc và đánh giá khả năng sử dụng Trichoderma sp để kiểm soát nấm Scytalidium sp gây bênh đốm nâu trên thanh long
Chúng tôi xin cam kết rằng đề tài này được thực hiện dưới sự hướng dẫn của ThS Trần Ngọc Hùng Đề tài chưa nhận bất kỳ giải thưởng nào khác và không phải là luận văn hay đồ án tốt nghiệp.
Nếu sai, tôi (chúng tôi) xin chịu trách nhiệm trước khoa và Nhà trường
Xác nhận của lãnh đạo khoa Người làm đơn
(ký, họ và tên) (Sinh viên chịu trách nhiệm chính thực hiện đề tài ký và ghi rõ họ tên)
1 Tính cấp thiết của đề tài: 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……… ………….……3
1.1.1 Giới thiệu chung về nấm Trichoderma sp………… 3
1.1.2 Đặc điểm hình thái của nấm Trichoderma sp………… … 3
1.1.3 Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nấm Trichoderma sp… …… 4
1.1.4 Đặc điểm phân bố của nấm Trichoderma sp ……… 4
1.1.5 Khả năng ứng dụng nấm Trichoderma sp ……… 5
1.2 Đặc điểm nấm bệnh Scytalidium sp……… 6
1.2.1 Giới thiệu chung về nấm Scytalidium sp……… 6
1.2.2 Đặc điểm hình thái của nấm Scytalidium sp……… 6
1.2.3 Yếu tố dinh dưỡng, sinh trưởng và phát triển của nấm Scytalidium sp………….… 7
1.2.4 Đặc điểm phân bố của nấm Scytalidium sp……….7
1.3 Đặc điểm của bệnh đốm nâu trên cây thanh long.……… 7
1.4 Lợi ích của cây thanh long……….9
1.4.1 Những lợi ích của cây thanh long……….….… 9
1.4.2 Giá trị kinh tế của cây thanh long……… 10
1.4.3 Tác hại của bệnh đốm nâu trên cây thanh long……… 26
1.5 Những nghiên cứu liên quan đến đề tài 26
CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……….28
2.2.2 Xác định khả năng đối kháng của Trichoderma với các chủng Scytalidium trên môi trường thạch ….……… ……… 29
2.2.3 Xác định khả năng đối kháng của Trichoderma với các chủng Scytalidium trên cành thanh long……… ……… 17
2.2.4 Xác định mật độ bào tử nấm Trichoderma bằng buồng đếm hồng cầu……… … 17
2.2.5 Xác định mật độ nấm Trichoderma bằng phương pháp trải đĩa………… …… 17
2.2.6 Phương pháp sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma… ……… ….…….18
2.2.7 Phương pháp xử lý số liệu……… ……… ………… 19
2.3.1 Sàng lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với nấm
2.3.2 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma ……… ….….……20
2.3.3 Đánh giá mật độ nấm Trichoderma theo thời gian bảo quản……… ……… 33
2.3.4 Thử nghiệm khả năng kiểm soát bệnh đốm xám của các chủng
Trichoderma chọn lọc trên cành thanh long ……… …34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU……… 35
3.1 Sàng lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với nấm
3.2 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma… ……….………… 36
3.3 Đánh giá mật độ nấm Trichoderma theo thời gian bảo quản……….……… ….37
3.4 Thử nghiệm khả năng kiểm soát bệnh đốm xám của các chủng Trichoderma chọn lọc trên cành thanh long ……… …39
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….……… ……… 29
Bảng 2.1 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma ………19
Bảng 2.2 Mật độ bào tử Trichoderma trong chế phẩm dạng lỏng trong các phương pháp kiểm tra khác nhau ……… ……….….20
Bảng 2.3 Khả năng hoạt hóa của chế phẩm bào tử Trichoderma sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau ……… … 20
Bảng 2.4 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma trên cành thanh long ……….…21
Bảng 3.1 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma……… 22
Bảng 3.2 Mật độ bào tử Trichoderma trong chế phẩm dạng lỏng trong các phương pháp kiểm tra khác nhau ………24
Bảng 3.3 Khả năng hoạt hóa của chế phẩm bào tử Trichoderma sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau ……… ……… 26
Bảng 3.4 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma trên cành thanh long ….……… 27
Hình 1.1 A) Hình khuẩn lạc nấm Trichoderma B) Bào tử nấm Trichoderma trên môi trường PGA sau 4 ngày nuôi cấy……… 4
Hình 1.2 Khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử nấm Scytalidium sp trên môi trường PGA sau 5 ngày nuôi cấy ……… …6
Hình 1.3 Nấm Scytalidium gây bệnh trên cây thanh long ……… 8
Hình 3.1: Biểu đồ thể hiện hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma ……….22
Hình 3.2 Đối kháng giữa các chủng Trichoderma koningii và Scytalidium sp trên môi trường PGA 23
Hình 3.3 A) Môi trường bán rắn cấp 1 ……….24
Hình 3.4 Biểu đồ thể hiện mật độ bào tử Trichoderma trong chế phẩm dạng lỏng trong các phương pháp kiểm tra khác nhau ……… …25
Hình 3.5 Biểu đồ thể hiện khả năng hoạt hóa của chế phẩm bào tử
Trichoderma sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau ……….… 26
Hình 3.6 Biểu đồ thể hiện hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma trên cành thanh long ……… ….27
Hình 3.7 Vết bệnh trên cành thanh long…….……… ……
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BVTV: Bảo vệ thực vật
TNHH: Trách nhiệm hữu hạn
1 Tính cấp thiết của đề tài:
Năm 2017, xuất khẩu rau củ quả của Việt Nam đạt 3,5 tỷ USD, đánh dấu cột mốc lịch sử với trái cây Việt có mặt tại 50 quốc gia Trong đó, thanh long chiếm 50,3% giá trị xuất khẩu, dẫn đến sự gia tăng nhanh chóng diện tích trồng loại trái cây này Tính đến năm 2015, cả nước có 41.164 ha thanh long, gấp 4 lần so với năm 2005, với Bình Thuận dẫn đầu chiếm 63% diện tích Tuy nhiên, sự bùng nổ diện tích trồng và thời tiết thay đổi đã dẫn đến nhiều dịch bệnh, trong đó nổi bật là bệnh đốm nâu.
Nấm gây hoại tử trên cành và trái thanh long, làm cho chúng bị sần sùi và thối khô, dẫn đến giảm giá trị thương phẩm nghiêm trọng Hiện nay, các biện pháp phòng trừ chủ yếu sử dụng thuốc hóa học, tuy nhiên, phương pháp này tốn kém và có thể ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm cũng như môi trường do tồn dư hóa chất.
Các biện pháp sinh học đang được phát triển nhằm tạo ra sản phẩm thân thiện với môi trường, chi phí thấp và nâng cao chất lượng nông sản cây thanh long, phục vụ cho nền nông nghiệp bền vững Việc ứng dụng các chế phẩm sinh học trong trồng trọt để thay thế thuốc hóa học là điều cần thiết Xuất phát từ thực tế này, chúng tôi thực hiện đề tài “Sàng lọc và đánh giá khả năng đối kháng của nấm”.
Nghiên cứu về Trichoderma sp và nấm Scytalidium sp cho thấy sự kết hợp này gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long Mục tiêu của nghiên cứu là xác định các chủng nấm Trichoderma có khả năng đối kháng mạnh mẽ với nấm gây bệnh, nhằm bảo vệ cây thanh long khỏi các tác nhân gây hại.
Chọn lọc các chủng Trichoderma sp có khả năng đối kháng tốt với nấm Scytalidium sp gây bệnh đốm nâu trên cây thanh long
Thử nghiệm khả năng sử dụng chế phẩm Trichoderma sp.dạng lỏng để kiểm soát bệnh đốm nâu trên cành thanh long.
Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 09 năm 2017 đến tháng 03 năm 2018
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Vật liệu
Nấm Trichoderma: được phân lập từ đất trồng trọt tại các khu vực trên tỉnh
Bình Dương, nghiên cứu khoa học của ThS Trần Ngọc Hùng tập trung vào việc sản xuất chế phẩm Trichoderma nhằm kiểm soát bệnh thán thư trên cây ớt, được thực hiện từ tháng 8/2016 đến tháng 2/2017.
Cành thanh long: giống cây ruột trắng, được lấy từ địa chỉ: 11 đường Thác Bà, khu phố Lạc Thuận, thị trấn Lạch Tánh, huyện Tánh Linh, tỉnh Bình Thuận
Các môi trường trong nghiên cứu: Gồm 2 loại môi trường chủ yếu: TSM –
Trichoderma Selected Medium và PGA – Potato Glucose Agar
Môi trường TSM gồm các thành phần sau:
Môi trường PGA gồm các thành phần sau:
Phương pháp nghiên cứu
Nguồn đất trồng được lấy từ phường Phú Hòa, thành phố Thủ Dầu Một, tỉnh Bình Dương Đất đã được xử lý kỹ lưỡng và phơi nắng để loại bỏ cỏ dại có thể gây hại cho cây trồng, như cỏ tranh và cỏ ống.
Chế độ bón phân: không bón phân
Tưới nước định kỳ hàng ngày
Chọn cành thanh long từ 1-2 năm tuổi, dài 50-70cm, màu xanh đậm, cành mập, không khuyết tật hoặc sâu bệnh Đặt cành ở nơi thoáng mát, trên đất khô ráo trong 10-15 ngày cho đến khi nhú rễ trước khi trồng vào chậu.
Chậu trồng thanh long nên được làm từ thùng xốp có đáy đục lỗ để thoát nước, giúp tránh tình trạng ngập úng cho cây Đường kính chậu lý tưởng là 30cm và chiều cao từ 20-25cm Ngoài ra, cần đảm bảo khoảng cách từ mặt đất trong chậu đến thành chậu là 5-7cm để cây phát triển tốt.
Thanh long được trồng trong 30 chậu, được chia thành 3 khối: khối đối chứng, khối gây bệnh và khối thí nghiệm Khoảng cách giữa các khối là 3m, trong khi khoảng cách giữa các chậu là 10cm.
2.2.2 Xác định khả năng đối kháng của Trichoderma với các chủng Scytalidium trên môi trường thạch đĩa
Chuẩn bị đĩa petri giống: cấy các chủng Trichoderma và các chủng nấm bệnh
Scytalidium trên các đĩa môi trường PGA
Cắt những miếng thạch (0.5x0.5cm) chứa nấm bệnh và Trichoderma, sau đó đặt lên đĩa petri có môi trường PGA để thực hiện thí nghiệm đối kháng Hằng ngày, theo dõi và đánh giá hiệu quả của sự đối kháng này.
Scytalidium của các chủng Trichoderma
Hiệu quả đối kháng được tính theo công thức:
Với: Dđc là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa đối chứng; Dtt là bán kính khuẩn lạc nấm bệnh trên đĩa thử thật
2.2.3 Xác định khả năng đối kháng của Trichoderma với các chủng Scytalidium trên cành thanh long
Nghiên cứu nuôi cấy nấm bệnh Scytalidium và Trichoderma trên các môi trường bán rắn riêng biệt đã được thực hiện Sau 5 ngày, chế phẩm được thu nhận và sấy khô, đồng thời tiến hành định mật độ bào tử nấm bệnh bằng phương pháp sử dụng buồng đếm hồng cầu.
Gây vết thương trên cành thanh long.Phun dịch bào tử các chủng nấm
Scytalidium sp đã được phân lập từ các vết thương, với mẫu đối chứng phun dịch bào tử nấm bệnh ở mật độ 10^5 bào tử/ml Mẫu thí nghiệm cũng phun dịch bào tử với mật độ tương tự, sau đó tiếp tục phun dịch bào tử Trichoderma ở mật độ 10^5 bào tử/ml Các vị trí gây bệnh được bọc bằng nilon và che lại bằng túi nilon, đặt trong nhà lưới để tránh ánh sáng trực tiếp Quá trình quan sát và ghi nhận các triệu chứng bệnh đã được thực hiện để so sánh giữa cành thanh long bị bệnh trong lô thí nghiệm và lô đối chứng.
2.2.4 Xác định mật độ bào tử nấm Trichoderma sp bằng buồng đếm hồng cầu
Dịch bào tử nấm được pha loãng trong nước muối sinh lý 0,85% đến độ phù hợp, sau đó được đưa vào buồng đếm Sử dụng kính hiển vi để quan sát và xác định số lượng bào tử trong mỗi ô lớn, chỉ cần đếm bốn ô ở bốn góc và một ô ở giữa Mật độ bào tử trong 1ml được tính theo công thức cụ thể.
S = 0.25 x a x L x 10 6 Với: a là số lượng bào tử trung bình trong một ô lớn; L là độ pha loãng [10]
2.2.5 Xác định mật độ nấm Trichoderma sp bằng phương pháp trải đĩa
Nguyên tắc đếm khuẩn lạc trên môi trường TSM dựa vào việc xác định số lượng mẫu, với giả định rằng mỗi khuẩn lạc phát sinh từ một tế bào đơn lẻ.
Chuẩn bị môi trường TSM bằng cách đổ vào các đĩa petri vô trùng và để khô trong hai ngày Tiếp theo, sử dụng nước muối sinh lý vô trùng để pha loãng thành các nồng độ thập phân (10^-1, 10^-2, 10^-3, …) Cuối cùng, dùng pipetman và đầu tip vô trùng để chuyển dịch giống đã pha loãng vào bề mặt đĩa petri.
Để tiến hành thí nghiệm với 31 trường TSM, sử dụng que trans trải đều dịch khuẩn lên bề mặt môi trường thạch cho đến khi bề mặt khô Sau đó, đậy nắp và để đông, ủ ở nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, quan sát và đếm số khuẩn lạc trên các đĩa petri, chỉ đếm những đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 30-300.
Số khuẩn lạc A/gam hoặc ml được tính theo công thức:
Với: A là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc, CFU) vi khuẩn trong 1ml mẫu;
Ni là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa tại một nồng độ i ni là số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V là thể tích dịch mẫu cấy vào trong môi trường đĩa (ml) fi là độ pha loãng tương ứng
2.2.6 Phương pháp sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma
Chuẩn bị giống cấp 1 bằng cách cấy các chủng Trichoderma sp vào erlen chứa 50g môi trường bán rắn với thành phần 24% bắp, 16% mụn xơ dừa và 60% nước Sau đó, ủ các erlen ở nhiệt độ phòng từ 30 đến 33 độ C trong 5 ngày.
Để chuẩn bị môi trường cấp 2, cần phối trộn đều các nguyên liệu gồm 24% bắp, 16% mụn xơ dừa và 60% nước Sau đó, tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C, áp suất 1atm trong 30 phút Sau khi khử trùng, trải đều hỗn hợp để nhiệt độ giảm xuống còn 40 – 45°C.
Để cấy giống, cần đảo đều giống cấp 1 trong các erlen và trộn chúng với môi trường cấp 2 sao cho đạt mật độ 10^8 bào tử/g Sau đó, ủ canh trường ở nhiệt độ phòng để đảm bảo quá trình phát triển diễn ra thuận lợi.
(30 – 33 0 C) trong khoảng thời gian 4 ngày
Thu nhận canh trường: Canh trường sau nuôi cấy được sấy thông gió ở
Ở nhiệt độ 45 độ C và độ ẩm môi trường khoảng 10%, canh trường khô được rây thành hai loại bán thành phẩm Bán thành phẩm 1 bao gồm bào tử và các đoạn khuẩn ty ngắn, trong khi phần không qua rây được gọi là bán thành phẩm 2.
Nội dung nghiên cứu
2.3.1 Sàng lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với nấm Scytalidium sp
Cấy 7 chủng nấm Trichoderma sp và chủng nấm Scytalidium sp trên các đĩa petri giống trung gian Khi các chủng nấm đã mọc đầy đĩa, cắt những miếng thạch có diện tích bằng nhau (0,5 x 0,5cm) có chứa nấm bệnh và Trichoderma trên các đĩa petri giống Đặt các khối thạch lên đĩa petri có chứa môi trường PGA để tiến hành đối kháng Khối thạch chứa nấm Trichoderma và nấm Scytalidium nằm đối diện nhau, cách mép đĩa petri khoảng 1.5 cm Sau 5 ngày, xác định hiệu quả đối kháng
Scytalidium sp của các chủng Trichoderma
Bảng 2.1 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma
Chủng Trichoderma sp Hiệu quả đối kháng nấm bệnh (%)
Chọn các chủng có hiệu quả đối kháng cao nhất với nấm bệnh để tiến hành thí nghiệm tiếp theo
2.3.2 Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bào tử Trichodermasp
Cấy các chủng nấm Trichoderma chọn lọc trên đĩa petri giống trung gian, sau khi nấm mọc đầy, cắt những miếng thạch 0.5 x 0.5cm chứa nấm và đặt vào bình tam giác có môi trường bán rắn để sản xuất giống cấp 1 Sau 5 ngày, cấy giống cấp 1 vào môi trường sản xuất cấp 2 và ủ trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng Cuối cùng, thu nhận bào tử Trichoderma và bảo quản trong môi trường lỏng.
2.3.3 Đánh giá mật độ nấm Trichoderma theo thời gian bảo quản
Bào tử các chủng Trichoderma được bảo quản trong dịch lỏng trong các chai nhựa kín và giữ ở nhiệt độ phòng từ 27 đến 33 độ C Mật độ ban đầu của chế phẩm được xác định bằng hai phương pháp: đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu và phương pháp trải đĩa Nghiên cứu cũng đánh giá sự khác biệt về mật độ bào tử giữa hai phương pháp này.
Sau các khoảng thời gian bảo quản 1, 2, và 3 tháng, xác định lại mật độ bào tử
Trichoderma được sử dụng trong các chế phẩm thông qua phương pháp trải đĩa để đánh giá khả năng hoạt hóa của chủng trong chế phẩm dạng lỏng, được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Bảng 2.2 Mật độ bào tử Trichoderma trong chế phẩm dạng lỏng trong các phương pháp kiểm tra khác nhau
Phương pháp kiểm tra Phương pháp đếm trực tiếp Phương pháp trải đĩa
Bảng 2.3 Khả năng hoạt hóa của chế phẩm bào tử
Trichoderma sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau
Thời gian bảo quản Trước bảo quản 1 tháng 3 tháng
2.3.4 Thử nghiệm khả năng kiểm soát bệnh đốm xám của các chủng Trichoderma chọn lọc trên cành thanh long
Các cành thanh long được trồng trong chậu riêng biệt, với mỗi nghiệm thức bao gồm 03 lô được sắp xếp theo khối Mỗi lô chứa 10 cành, và mỗi cành được gây vết thương tại 02 vị trí khác nhau.
Gây vết thương trên cành thanh long.Phun dịch bào tử các chủng nấm
Scytalidium sp được phân lập từ các vết thương, với mẫu đối chứng phun dịch bào tử nấm bệnh có mật độ 10^5 bào tử/ml Mẫu thí nghiệm cũng phun dịch bào tử với mật độ tương tự, sau đó phun thêm dịch bào tử Trichoderma ở mật độ 10^5 bào tử/ml Các vị trí bị bệnh được bọc nilon và che bằng túi nilon, đặt trong nhà lưới để tránh ánh sáng trực tiếp Quá trình quan sát và ghi nhận các triệu chứng bệnh sẽ được thực hiện để so sánh cành thanh long bị bệnh trong lô thí nghiệm với lô đối chứng.
Bảng 2.4 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma trên cành thanh long
Nội dung nghiệm thức Tỷ lệ cành thanh long bệnh (%)
NT1 Xử lý nấm bệnh
Scytalidium sp và chế phẩm nấm Trichoderma NT3
Không xử lý bằng cả 2 loại nấm Trichoderma sp và
Scytalidium Đánh giá hiệu quả kiểm soát bệnh đốm nâu của chế phẩm bào tử Trichoderma trên cành thanh long
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Sàng lọc các chủng Trichoderma có khả năng đối kháng tốt với nấm
Cấy 7 chủng nấm Trichoderma sp và chủng nấm Scytalidium sp trên các đĩa petri giống trung gian Khi các chủng nấm đã mọc đầy đĩa, cắt những miếng thạch có diện tích bằng nhau (0,5 x 0,5cm) có chứa nấm bệnh và Trichoderma trên các đĩa petri giống Đặt các khối thạch lên đĩa petri có chứa môi trường PGA để tiến hành đối kháng Khối thạch chứa nấm Trichoderma và nấm Scytalidium nằm đối diện nhau, cách mép đĩa petri khoảng 1,5 cm Sau 5 ngày, xác định hiệu quả đối kháng
Scytalidium sp của các chủng Trichoderma
Bảng 3.1 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma
Chủng Trichoderma Hiệu quả đối kháng (%)
Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma
Dựa trên biểu đồ, có sự khác biệt rõ rệt về hiệu quả đối kháng nấm bệnh giữa các chủng Trichoderma, với chủng T4 và T8.2 đạt độ tin cậy khoảng 95%, dao động từ 87 đến 100%, trong khi các chủng khác chỉ dao động từ 36 đến 74% Do đó, chúng tôi đã chọn hai chủng này để thực hiện thử nghiệm sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma Quan sát dưới kính hiển vi cho thấy tơ nấm Trichoderma phát triển phủ lên tơ của nấm bệnh và tạo ra nhiều bào tử, đồng thời tơ của Trichoderma quấn chặt tơ của nấm bệnh, cho thấy cơ chế đối kháng của Trichoderma với Scytalidium là ký sinh và cạnh tranh môi trường sống.
Hình 3.2.Đối kháng giữa các chủng Trichoderma koningii và Scytalidium sp trên môi trường PGA (vị trí mũi tên) A) Trichoderma T8.2 và Scytalidium sp.; B) Khuẩn ty
Trichoderma T8.2 và khuẩn ty Scytalidium sp.
Thử nghiệm sản xuất chế phẩm bào tử Trichoderma
Cấy các chủng nấm Trichoderma sp chọn lọc trên đĩa petri giống trung gian Khi nấm phát triển đầy đĩa, cắt những miếng thạch kích thước 0,5 x 0,5 cm chứa nấm Trichoderma Đặt các khối thạch vào bình tam giác chứa môi trường bán rắn để sản xuất giống cấp 1.
5 ngày, cấy giống cấp 1 vào môi trường sản xuất cấp 2.Ủ 5 ngày ở nhiệt độ phòng.Thu nhận bào tử Trichoderma và bảo quản trong môi trường lỏng
Hình 3.3 A) Môi trường bán rắn cấp 1, B) Môi trường bán rắn cấp 2, C) Chế phẩm dịch bào tử Trichoderma chủng T4 và T8.2.
Đánh giá mật độ nấm Trichoderma theo thời gian bảo quản
Bào tử các chủng Trichoderma được bảo quản trong dịch lỏng trong các chai nhựa kín, ở nhiệt độ phòng từ 27 đến 33 độ C Mật độ ban đầu của chế phẩm được xác định bằng hai phương pháp: đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu và phương pháp trải đĩa Nghiên cứu cũng đánh giá sự khác biệt về mật độ bào tử giữa hai phương pháp này.
Sau các khoảng thời gian bảo quản 1, 2, và 3 tháng, xác định lại mật độ bào tử
Trichoderma được sử dụng trong các chế phẩm thông qua phương pháp trải đĩa nhằm đánh giá khả năng hoạt hóa của chủng trong chế phẩm dạng lỏng, được bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Bảng 3.2 Mật độ bào tử Trichoderma trong chế phẩm dạng lỏng trong các phương pháp kiểm tra khác nhau
Phương pháp đếm trực tiếp Mật độ bào tử
Biểu đồ thể hiện mật độ bào tử Trichoderma trong chế phẩm dạng lỏng cho thấy rằng phương pháp đếm trực tiếp cho kết quả cao hơn so với phương pháp trải đĩa, với mật độ bào tử ở chủng T8.2 cao gấp 8 lần và chủng T4 cao gấp 4 lần Mặc dù phương pháp đếm trực tiếp tiết kiệm thời gian và công sức chuẩn bị, nhưng độ chính xác không bằng phương pháp trải đĩa, do khả năng hoạt hóa của nấm thay đổi theo môi trường Ngược lại, phương pháp trải đĩa, mặc dù phức tạp và yêu cầu nhiều dụng cụ, lại đánh giá chính xác khả năng hoạt hóa của nấm Trichoderma Do đó, trong sản xuất, chúng tôi khuyến cáo nên sử dụng phương pháp trải đĩa để đảm bảo độ chính xác cao hơn.
Bảng 3.3 Khả năng hoạt hóa của chế phẩm bào tử
Trichoderma sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau
Phương pháp trải đĩa Phương pháp đếm trực tiếp
Biểu đồ cho thấy khả năng hoạt hóa của chế phẩm bào tử Trichoderma sau các khoảng thời gian bảo quản khác nhau Mật độ bào tử Trichoderma ban đầu dao động từ 48–79 x 10^6 bào tử/ml mà không có sự chênh lệch lớn Sau 1 tháng bảo quản, mật độ của chủng T4 giảm khoảng 15.8 lần, trong khi chủng T8.2 giảm khoảng 15 lần Sau 3 tháng bảo quản, mật độ bào tử chỉ thay đổi nhẹ, đạt từ 4.3 – 4.7 x 10^6 bào tử/ml Chúng tôi đã sử dụng chế phẩm dịch bào tử sau 3 tháng bảo quản để kiểm soát nấm bệnh Scytalidium trên cành thanh long.
Thử nghiệm khả năng kiểm soát bệnh đốm xám của các chủng Trichoderma chọn lọc trên cành thanh long
Các cành thanh long được trồng riêng trong chậu, với mỗi nghiệm thức bao gồm 03 lô được bố trí theo khối Mỗi lô chứa 10 cành, và mỗi cành sẽ được gây vết thương tại 02 vị trí khác nhau.
Gây vết thương trên cành thanh long.Phun dịch bào tử các chủng nấm
Scytalidium sp đã được phân lập từ các vết thương Đối với mẫu đối chứng, dịch bào tử nấm bệnh được phun với mật độ 10^5 bào tử/ml Trong khi đó, mẫu thí nghiệm cũng sử dụng dịch bào tử với mật độ tương tự là 10^5 bào tử/ml.
Mật độ bào tử Trichodermasp ( x106bào tử/ml)
Phun dịch bào tử Trichoderma với mật độ 10^5 bào tử/ml sau khi chuẩn bị 40 bào tử/ml Bọc nilon các vị trí bị bệnh và che bằng túi nilon, đặt trong nhà lưới để tránh ánh sáng trực tiếp Theo dõi và ghi nhận các triệu chứng bệnh, so sánh cành thanh long bị bệnh trong lô thí nghiệm với lô đối chứng.
Bảng 3.4 Hiệu quả đối kháng nấm bệnh của các chủng Trichoderma trên cành thanh long
Nội dung nghiệm thức Tỷ lệ cành thanh long bệnh
(%) NT1 Xử lý nấm bệnh Scytalidium sp 26,7 ± 4,7
Xử lý nấm bệnh Scytalidium sp và chế phẩm nấm Trichoderma sp
Không xử ly bằng cả 2 loại nấm
Biểu đồ trong Hình 3.6 cho thấy hiệu quả của các chủng Trichoderma trong việc đối kháng nấm bệnh trên cành thanh long Trong nghiệm thức 1, chúng tôi đã áp dụng phương pháp gây bệnh bằng bào tử nấm để đánh giá khả năng chống chịu của các chủng này.
Trong nghiên cứu về Scytalidium sp., nghiệm thức 2 được thực hiện bằng cách xử lý bào tử nấm Scytalidium sp kết hợp với chế phẩm nấm Trichoderma sp., trong khi nghiệm thức 3 không áp dụng bất kỳ loại nấm nào Kết quả cho thấy khả năng gây bệnh của bào tử nấm Scytalidium sp rõ rệt hơn khi không có sự can thiệp của nấm Trichoderma sp.
Tỉ lệ bệnh đốm xám (%)
Tỷ lệ nấm Scytalidium sp trên thanh long đạt 26.7% So với nghiệm thức 3, không có dấu hiệu bệnh nào được phát hiện, có thể do quá trình thu nhận và bảo quản bào tử nấm bệnh cũng như điều kiện thời tiết không thuận lợi cho sự phát triển của nấm Việc xử lý đồng thời bằng cả bào tử nấm Scytalidium và chế phẩm dịch bào tử là cần thiết.
Nghiên cứu cho thấy chế phẩm dịch bào tử Trichoderma có khả năng kiểm soát bệnh đốm nâu trên cây thanh long, giảm tỷ lệ bệnh chỉ còn 6,7% sau 3 tháng bảo quản Điều này chứng tỏ Trichoderma hiệu quả trong việc kiểm soát nấm Scytalidium gây hại, với tỷ lệ kiểm soát lên đến 20% Kết quả này là nền tảng quan trọng để phát triển các biện pháp sinh học, góp phần vào sản xuất nông nghiệp hữu cơ bền vững.
Hình 3.7 mô tả vết bệnh trên cành thanh long, trong đó A) chỉ ra sự gây bệnh do bào tử nấm Scytalidium trên cành, và B) thể hiện sự kết hợp giữa bào tử nấm Scytalidium với các biện pháp xử lý khác để kiểm soát bệnh.