NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁPNGHIÊN CỨU
ĐỐİ TƯỢNG, ĐỊA ĐİỂM, NGUYÊN LİỆU NGHİÊN CỨU
Lợn mán sau khi sơ sinh đến giai đoạn cai sữa thường mắc tiêu chảy do virus tiêu chảy dịch tễ ở lợn (PEDV) gây ra Hiện tượng này xảy ra tại các trang trại lợn mán ở tỉnh Hà Giang.
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm, Bộ Môn Bệnh Lý,
Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
- Địa điểm theo dõi và lấy mẫu tại 3 huyện: Vị Xuyên, Bắc
Quang và Hoàng Su Phì tỉnh Hà Giang.
Mẫu được thu nhận là cả con lợn Mán nuôi mắc bệnh điển hình trong lứa tuổi từ 1- 9 tuần tuổi, mỗi đàn lợn từ 1-3 con.
Mẫu mô từ ruột, gan, lách, thận, phổi, hạch và tim được thu thập từ lợn con dương tính với virus PEDV thông qua phương pháp RT-PCR để nghiên cứu bệnh tích vi thể.
Bảng 3.1 Hồ sơ các mẫu lợn Mán tại các huyện nghiên cứu
Ghi chú: Tất cả lợn lấy mẫu đều chưa tiêm vacxin PED
Formol trung tính 10%, nước cất, cồn, xylen, parafin, thuốc nhuộm heamatoxylin, eosin,
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
+ Xác định tỷ lệ mắc tiêu chảy ở lợn Mán.
+ Chẩn đoán lợn Mán nghi mắc PEDV bằng phương pháp RT – PCR.
+ Xác định triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở lợn mắc tiêu chảy do virus (PED)
+ Xác định bệnh tích đại thể của lợn mắc bệnh.
+ Xác định bệnh tích vi thể ở một số cơ quan: Ruột, hạch ruột, gan, phổi, thận của lợn bệnh.
+ Xác định các chỉ tiêu huyết học của lợn bệnh.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện nghiên cứu và triển khai nội dung của đề tài, chúng tôi đã áp dụng kết hợp các phương pháp nghiên cứu truyền thống và hiện đại trong lĩnh vực thú y.
3.3.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Tại các cơ sở chăn nuôi lợn, cần quan sát triệu chứng lâm sàng, quay phim và chụp 3 bức ảnh, đồng thời ghi chép số liệu cho từng cá thể và toàn đàn Phương pháp mổ khám cũng được áp dụng để đánh giá tình trạng sức khỏe của lợn.
Mổ khám lợn mắc PED là cần thiết để xác định các biến đổi đại thể của các cơ quan, tổ chức Quy trình bắt đầu bằng việc cố định lợn bệnh, lấy máu từ vịnh tĩnh mạch cổ, sau đó lột da để bộc lộ xoang ngực và xoang bụng Các cơ quan nội tạng được tách ra để quan sát và chụp ảnh, đồng thời thu mẫu từ các cơ quan như phổi, tim, gan, lách, thận, ruột và hạch phục vụ cho các nghiên cứu khác nhau Một số mẫu sẽ được bảo quản trong formol 10% để làm tiêu bản vi thể.
3.3.3 Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
Nguyên lý của phản ứng RT – PCR:
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được phát minh bởi Kary Mullis vào năm 1985 và đã được cải tiến nhờ vào việc phân lập enzyme tổng hợp DNA chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus Sự phát triển của máy chu kỳ nhiệt cho phép điều chỉnh nhiệt độ chính xác trong từng giai đoạn phản ứng Qua 20 – 30 vòng PCR, hàng triệu bản sao của một phân tử DNA (một đoạn gen) có thể được tạo ra.
Phương pháp RT-PCR bao gồm các bước tách chiết RNA của virus và thực hiện kỹ thuật RT-PCR RNA virus được tách chiết bằng kit QIAamp theo hướng dẫn của nhà sản xuất Quá trình này sử dụng mẫu bệnh phẩm từ lợn nghi mắc PEDV, sau đó RNA được trộn với hỗn hợp RT-PCR từ bộ kit One step RT-PCR (Invitrogen) Cặp mồi sử dụng cho phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi 5’-TTCTGAGTCACGAACAGCCA-3’ và mồi ngược 5’.
Đoạn gen ORF5 dài 651 bp được khuyếch đại bằng cách sử dụng mồi CATATGCAGCCTGCTCTGAA- 3’ Phản ứng khuếch đại sản phẩm được thực hiện trong máy PCR với 35 chu kỳ Kết quả RT-PCR được kiểm tra bằng điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút, sau đó quan sát và chụp ảnh sản phẩm trên máy chụp ảnh gel.
Các bước tiến hành phản ứng RT – PCR: Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần phản ứng được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng RT – PCR Thành phần phản ứng
Chúng tôi sử dụng cặp mồi một phần gen S với độ dài 651bp, hèm theo Kit tách chiết RNA (QIAamp) do Nhật bản sản xuất.
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3 Nhiệt độ và thời gian trong từng giai đoạn của chu kỳ nhiệt
Chúng tôi tiến hành để xác đinh sự có mặt của virus PED ở lợn có biểu hiện tiêu chảy, chưa được tiêm vacxin phòng PED bằng RT- PCR.
RNA được chiết tách bằng kit QIAamp Viral RNA Minikit (hãng
Qiagen), cặp mồi đặc hiệu được thiết kế để khuếch đại một phần gen S, sản phẩm khuếch đại có kích thước 651bp (Park et al., 2007).
Sau khi thực hiện xét nghiệm RT-PCR và nhận được kết quả, chúng tôi đã tiến hành hồi cứu và tổng hợp các triệu chứng lâm sàng chính đã được ghi nhận trước đó.
Xác lợn chết được mổ khám theo tiêu chuẩn trong TCVN 8402:
2010 (Bộ khoa học và Công nghệ, 2010).
3.3.4 Phương pháp nhuộm tiêu bản vi thể
Lợn Mán nuôi ở lứa tuổi 1- 9 tuần tuổi có kết quả dương tính với virus
PED được tiến hành mổ khám, ghi chép và chụp ảnh nhằm thu thập thông tin về các bệnh tích đại thể Ngoài ra, các mẫu mô từ gan, lách, thận, phổi, dạ dày, ruột và hạch ruột được lấy ra và ngâm trong dung dịch formol trung tính 10% để chuẩn bị cho việc xác định bệnh tích vi thể.
Tiêu bản mô học bệnh lý được làm theo phương pháp của Prophet, E.B,
1992 bao gồm các bước: (1) Lấy mẫu; (2) khử nước, làm trong; (3) tẩm parafin;
(4) đổ block; (5) cắt dán mảnh; (6)nhuộm tiêu bản; (7) gắn lamen, dán nhãn và đọc kết quả bằng kính hiển vi (Prophet and Pathology, 1992).
Các bước của quá trình làm tiêu bản vi thể đã chi tiết như sau:
Để tiến hành quy trình, cần chuẩn bị đầy đủ dụng cụ và hóa chất như lọ formol 10%, dao kéo, pank kẹp, cốc đựng hóa chất, phiến kính, máy đúc block, khuôn đúc, tủ ấm 37 độ C, máy cắt mảnh microtom, nước ấm 48 – 52 độ C, xylen, paraffin, cùng với thuốc nhuộm hematoxylin và eosin.
Lấy bệnh phẩm: bệnh phẩm là dạ dày, ruột, tim, gan, thận, lách… Cố định bệnh phẩm
Ngâm miếng tổ chức vào dung dịch formol 10% (Chú ý thể tích formol phải gấp 10 lần bệnh phẩm và bệnh phẩm phải ngập trong formol)
Tiến hành lần lượt các bước sau:
Rửa formol: lấy tổ chức ra khỏi bình formol 10%, cắt thành từng miếng có chiều dài, rộng khoảng 4-5mm Sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ trong 24h
Khử nước: cho qua hệ thống gồm 3 lọ cồn
Mục đích: khử nước ra khỏi tổ chức
Khử cồn: cho qua hệ thống gồm 3 lọ xylen
Mục đích của quá trình này là loại bỏ hoàn toàn cồn ra khỏi tổ chức Yêu cầu là khi nào miếng tổ chức đạt được độ trong suốt như cục thạch thì coi như đã hoàn thành Nếu để quá lâu, tổ chức sẽ trở nên giòn, dễ vỡ và khó cắt.
Khử Xylen: Cho qua hệ thống paraffin đã ổn định, đặc chắc, đồng nhất, không lẫn tạp chất, không bọt, có từ 3 – 5 % sáp ong đã nấu, gồm 3 lọ.
Paraffin II: 6h trong tủ ấm 56 o C
Paraffin III: 12h trong tủ ấm 56 o C
Mục đích: khử hết xylen trong tổ chức Trong tổ chức chỉ còn paraffin thấm đều trong các kẽ mô bào.
Nếu nhiệt độ trên 56 o C tổ chức sẽ giòn, dễ vỡ và khó cắt. Đúc block
Mục đích: đưa mẫu bệnh phẩm vào trong khối paraffin tạo thành một thể thống nhất.
Chuẩn bị: Máy đúc block, paraffin.
Để tiến hành, đặt miếng bệnh phẩm nằm ngang vào giữa khuôn block, sau đó đổ nhanh paraffin lỏng vào khuôn Tiếp theo, chuyển khuôn đã đúc sang bàn lạnh của máy đúc khuôn block và để nguội cho đến khi block đông cứng chắc chắn.
Cắt dán mảnh và cố định tiêu bản
Để chuẩn bị cắt mẫu, cần có máy cắt, dao cắt, nước ấm ở nhiệt độ 48 - 52 độ C, phiến kính và pank kẹp Quá trình cắt mảnh được thực hiện bằng mỏy cắt microtom với độ dài từ 3 - 5 mm, đảm bảo rằng mảnh cắt không bị rách hoặc nát ở phần tổ chức.
Để tãi mảnh, bạn cần dùng pank để kẹp mảnh cắt và đặt vào nước lạnh, đảm bảo mặt dưới của mảnh cắt ướt đều Sau đó, lấy phiến kính để hớt mảnh và chuyển sang nước ấm ở nhiệt độ 48 – 52 độ C Tiếp theo, vớt mảnh cắt sao cho vị trí của nó nằm ở 1/3 phiến kính Cuối cùng, đặt vào tủ ấm ở 37 độ C trong vòng 24 giờ.
Khử parafin: Cho tiêu bản qua hệ thống xylen gồm 3 lọ: Xylen I: 30 phút Xylen II: 30 phút
Xylen III: 30 phút Lưu ý: có thể để tiêu bản cần nhuộm vào xylen từ sáng, đến chiều nhuộm để tiêu bản sạch hết parafin
Khử xylen: cho tiêu bản qua hệ thống cồn gồm 3 lọ: Cồn I : 7 phút Cồn II : 7 phút
Cồn III : 7 phút Khử cồn: cho dưới vòi nước chảy 10 phút.
Nhuộm Haematoxylin là phương pháp nhuộm nhân hiệu quả Để thực hiện, nhỏ haematoxylin vào tiêu bản trong 5 phút, sau đó rửa sạch bằng nước và lau khô xung quanh tiêu bản Kiểm tra màu sắc, nếu tiêu bản có màu xanh tím thì đạt yêu cầu Cuối cùng, rửa tiêu bản với nước trong 5 phút để loại bỏ hoàn toàn haematoxylin thừa.
Nhuộm Eosin (nhuộm bào tương)
Nhỏ eosin ngập tiêu bản 5 – 10 phút, rửa nước chảy cho hết eosin thừa
Cho tiêu bản qua 3 lọ cồn 100 0 mỗi lọ 1 phút.
Tẩy cồn làm trong tiêu bản:
Cho tiêu bản đi qua 3 lọ xylen, mỗi lọ
Nhỏ một giọt Baume canada lên lamen rồi gắn nhanh lên tiêu bản khi vẫn còn xylen trên tiêu bản.
Kiểm tra tiêu bản trên kính hiển vi quang học với vật kính 10, nếu quan sát thấy màu xanh tím và bào tương có màu đỏ tươi, tiêu bản sẽ trong sáng Đảm bảo không có nước và bọt khí xuất hiện.
3.3.5 Phương pháp nghiên cứu các chỉ tiêu huyết học
Chúng tôi lấy máu ở vịnh tĩnh mạch cổ của 30 lợn Mán gồm: