Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Huyện Ba Vì - Hà Nội
Phòng thí nghiệm trọng điểm CNSH – Thú Y cụm 2 – Khoa Thú
Y – Học viện Nông Nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Một số đặc điểm bệnh lý của gà thả vườn Ba Vì mắc bệnh do ORT
- Chẩn đoán vi khuẩn ORT bằng kỹ thuật PCR
- Các triệu chứng lâm sàng của đàn gà mắc bệnh do ORT
- Những biến đổi bệnh lý đại thể của gà mắc bệnh do ORT
Nghiên cứu dịch tễ học về bệnh do ORT trên đàn gà thả vườn Ba Vì cho thấy sự phân bố bệnh theo lứa tuổi, mùa vụ và phương pháp chăn nuôi truyền thống Việc điều tra tình hình mắc bệnh này giúp hiểu rõ hơn về các yếu tố ảnh hưởng và từ đó có biện pháp phòng ngừa hiệu quả.
Biện pháp phòng và trị bệnh
- Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh
- Xác định tính mẫn cảm của chủng ORT phân lập được với kháng sinh và thử nghiệm điều trị
- Xây dựng biện pháp phòng và trị bệnh.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp chẩn đoán lâm sàng
Chúng tôi đã tiến hành theo dõi và lấy mẫu gà từ các đàn nghi nhiễm ORT tại các hộ chăn nuôi ở Ba Vì, Hà Nội Trong quá trình này, chúng tôi ghi chép các triệu chứng lâm sàng của những con gà còn sống, bao gồm các biểu hiện như ủ rũ, khó thở, hắt hơi, vảy mỏ, mũi có dịch viêm và đau mắt.
Đối với những con gà có triệu chứng rõ ràng, chúng tôi thực hiện mổ khám để kiểm tra bệnh tích đại thể của tất cả các cơ quan, tuân thủ quy trình mổ khám gia cầm do Cục Thú y quy định.
Nếu gia cầm còn sống phải dùng các biện pháp làm chết tránh gây biến đổi lớn về mức độ quan sát bệnh tích (dùng điện, cắt tiết…).
Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, u, các lỗ tự nhiên, khớp, ngoại kí sinh trùng và các tổn thương…
Mổ khám kiểm tra nội tạng bên trong
Ghi báo cáo mổ khám và phiếu gửi bệnh phẩm.
Xử lý tiêu độc xác gia cầm.
3.5.3 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu
Các mẫu được lấy theo quy định của ngành.
Mẫu cơ quan tổ chức cần được lấy từ đúng cơ quan và vùng tổn thương điển hình, đảm bảo đủ thành phần cấu tạo cần nghiên cứu và lượng mẫu cần thiết để đạt được kết quả chính xác.
Mẫu bệnh có thể bao gồm dịch ngoáy mũi, dịch hầu họng, dịch khí quản và dịch phế quản của gà ở mọi lứa tuổi Để lấy mẫu, sử dụng tăm bông vô trùng ngoáy sâu vào lỗ mũi hoặc hầu họng của gà bệnh đã được lau sạch bằng cồn 70 độ, sau đó cho tăm bông vào ống nghiệm chứa môi trường vận chuyển như Stuart Transport Medium, môi trường nước thịt vô trùng hoặc dung dịch PBS Mẫu cần được ghi nhãn và đưa về phòng thí nghiệm trong vòng 2-8 giờ; nếu xa, cần bảo quản trong tủ lạnh Sau khi vận chuyển, bệnh phẩm phải được cấy vào môi trường phân lập thích hợp Đối với dịch khí quản hoặc phế quản, dùng kéo vô trùng cắt dọc và lấy dịch bằng tăm bông, sau đó cũng cho vào môi trường như trên và vận chuyển về phòng thí nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi: sau khi mổ khám gà, dùng kéo vô trùng cắt lấy tổ chức phổi ở vùng định xét nghiệm.
Với mẫu là tổ chức phổi bệnh: chỉ lấy mẫu đối với phổi có bệnh tích quan sát được bằng mắt thường, cách lấy như trên.
3.5.4 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn là quá trình tách riêng vi khuẩn từ quần thể ban đầu nhằm tạo ra vi khuẩn ở dạng thuần khiết Vi sinh vật thuần khiết được hình thành từ một tế bào ban đầu và đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật Qua các phương pháp phân lập, chúng ta có thể thu được vi khuẩn thuần khiết, từ đó xác định các đặc điểm sinh vật và hóa học liên quan đến khả năng gây bệnh của chúng.
Mẫu sau khi lấy về được xử lý, nuôi cấy trên các môi trường thạch máu
Columbia cú bổ sung 5àg/ml Gentamycin ở 37 o C, 5-10% CO 2 trong 48 giờ Căn cứ vào tính chất mọc trên các môi trường để chọn các khuẩn lạc riêng biệt
Khuẩn lạc ORT được nuôi cấy trên môi trường thạch máu
Columbia có bổ sung 5% Gentamycin nuôi ở 37 độ C cho thấy sự xuất hiện của những khuẩn lạc nhỏ, không dung huyết, có màu xám đến xám trắng, với bờ mặt lồi và rìa rõ ràng Đặc biệt, các khuẩn lạc này không phát triển trên môi trường Macconkey.
Trong quá trình nhuộm Gram, sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào khiến vi khuẩn Gram dương giữ được phức hợp tím gentians mà không bị tẩy màu bởi ancolhol, trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này Kết quả là vi khuẩn Gram dương vẫn có màu tím gentians, trong khi vi khuẩn Gram âm chuyển sang màu hồng của fucshin.
Bước 1: Dàn đều tiêu bản và cố định tiêu bản:
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý lên lam kính sạch, sau đó dùng que cấy vô trùng để lấy 1-3 khuẩn lạc từ đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào giọt nước Để khô tự nhiên, sau đó cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh phiến kính trên ngọn lửa đèn cồn.
– 3 lần để vi khuẩn gắn chặt vào phiến kính và để vi khuẩn bắt mầu tốt hơn Bước 2: Nhuộm màu:
Nhỏ dung dịch tím Gentians để yên trong vòng 1 phút, rửa nước
Nhỏ dung dịch Lugol và để yên trong vòng 1 phút, rửa nước Khử màu bằng cách cho dung dịch alcohol 70% chảy qua, để khô
Nhỏ tiếp dung dịch Fucshin và để yên trong 1 phút, rửa nước, để khô. Quan sát hình thái vi khuẩn được nhuộm ở vật kính dầu với độ phóng đại 100.
PCR là phương pháp được áp dụng để phát hiện ORT trong mẫu dịch khí quản của gà mắc bệnh Thành phần chính của PCR bao gồm đoạn DNA đích, các mồi bổ sung cho DNA đích, hỗn hợp bốn loại base và DNA-polymerase thích hợp.
3.5.6.1 Phương pháp chiết tách DNA
Chúng tôi sử dụng bộ kit QIAamp DNA Mini Kit của Hãng QIAGEN (QIAGEN Inc., USA) để tách chiết DNA tổng số theo các bước:
Bước 1: Cho 20àl Proteinase K vào ống Eppendorf Thờm 180 àl Buffer ATL, trộn đều ủ ở 56 o C trong 3 giờ.
Bước 2: Thờm 4àl ARNase và 200 àl Buffer AL Ủ ở 70 o C trong 30 phỳt. Bước 3: Thờm 200 àl Ethanol (96 - 100%), trộn đều.
Bước 4: Chuyển mẫu sang cột có màng lọc, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút Loại bỏ dịch ở dưới.
Bước 5: Thờm 500àl Buffer AW1, rồi ly tõm 8000 vũng/phỳt trong 1 phút, bỏ dịch dưới.
Bước 6: Thờm 500àl Buffer AW2, ly tõm 13000 vũng/phỳt trong
2 phút, bỏ dịch dưới Tiếp tục ly tâm thêm 1 lần nữa như trên.
Bước 7: Chuyển cột lọc đã giữ lại ADN hệ gen của vi khuẩn trong màng lọc sang ống Eppendorf loại 1,5ml Thờm 100 àl Buffer
AE, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, thu dịch lỏng bên dưới, bảo quản ở -20 o C.
3.5.6.2 Quy trình thực hiện phản ứng PCR
Thành phẩn của phản ứng PCR:
Nội dung Nuclease-Free Water
To amplify the rnn gene, specific primer pairs are utilized: OR16S - F1: GAG AAT TAA TTT ACG GAT TAA G and OR16S - R1: TTC GCT TGG TCT CCG AAG AT, as established by Charlton et al in 1993.
Tiến hành khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu trình nhiệt:
3.5.6.3 Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Để chuẩn bị thạch Agarose 1,2%, cân 1,2g Agarose và hòa tan trong 10ml dung dịch TBE 1X, sau đó đun sôi trong lò vi sóng Khi thạch nguội đến khoảng 40°C, bổ sung 10µl Syber Green và đổ thạch vào số giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.
Bước 2: Chuẩn bị mẫu: Thờm 2àl loading dye vào 8àl sản phẩm RT-PCR
Bước 3: Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch.
Bước 4: Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào cỏc giếng với thể tớch 6àl marker 100bp và 10àl sản phẩm PCR mỗi giếng.
Bước 5: Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Bước 6: Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh.
3.5.7 Phương pháp kiểm tra khả năng mẫn cảm kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được.
Tính mẫn cảm với kháng sinh của chủng vi khuẩn ORT phân lập được xác định bằng phương pháp khoanh giấy khuếch tán trên thạch.
Chủng vi khuẩn kiểm tra được nuôi trong môi trường BHI ở 37°C với 5% CO2 trong 24 – 48 giờ Trước khi sử dụng, chuẩn bị đĩa thạch máu và ủ trong 10 – 20 phút Nhỏ 0,1ml canh khuẩn vào đĩa thạch, láng đều và để khô trong 3 – 5 phút, không quá 25 phút Sử dụng panh để đặt và ấn nhẹ các khoang giấy kháng sinh cách nhau 15mm Sau khi đặt xong, lật úp đĩa thạch và ủ trong tủ ấm CO2 ở 37°C Kết quả được đọc sau 24 – 48 giờ.
Sử dụng thước đo kích thước vòng vô khuẩn từ mặt sau của đĩa mà không mở nắp So sánh kích thước vòng vô khuẩn với bảng 3.1 và ghi lại kết quả cho từng loại kháng sinh đã thử nghiệm, phân loại thành mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I) và kháng (R).
Nếu phát hiện khuẩn lạc trong vòng ức chế, có thể có sự thay đổi về tính kháng của vi khuẩn hoặc do huyền dịch vi khuẩn bị trộn lẫn Các khuẩn lạc này cần được nuôi cấy, phân lập và kiểm tra lại tính nhạy cảm với kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn xung quanh khoang giấy kháng sinh được đo bằng milimet và phân loại thành các mức độ nhạy cảm, trung gian và đề kháng theo bảng tiêu chuẩn trong hướng dẫn bảng 3.1.
Bảng 3.1 Bảng tiêu chuẩn của nhà cung cấp giấy tẩm kháng sinh
Nguồn: Ocoid từ NCCLS (1990) M 2 A 4 (1982) Ghi chú: H (High): mẫn cảm cao
I (Intermediate): mẫn cảm trung bình
Căn cứ vào tiêu chuẩn của từng loại kháng sinh để xác định tính mẫn cảm với kháng sinh của vi khuẩn:
- Vi khuẩn rất mẫn cảm với kháng sinh được đánh giá: + ++
- Vi khuẩn mẫn cảm với kháng sinh: ++
- Vi khuẩn ít mẫn cảm với kháng sinh: +
3.5.8 Sử dụng một số loại kháng sinh để điều trị bệnh do ORT gây ra ở gà
Dựa vào khả năng mẫn cảm của chủng vi khuẩn ORT với các loại kháng sinh, chúng tôi đã lựa chọn loại kháng sinh có tỷ lệ mẫn cảm cao để điều trị bệnh do ORT ở gà tại huyện Ba Vì Hiệu quả điều trị được đánh giá qua tỷ lệ khỏi bệnh và thời gian điều trị trung bình.
Các loại kháng sinh được lựa chọn điều trị: Amoxicilline/clavulanic acid, Tetracycline và Erythromycin.
1 Erymar ( Công ty cổ phần thuốc thú y Marphavet)
Nguyên liệu nghiên cứu
Gà và các mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm ORT được thu thập từ phổi, khí quản, phế quản, mẫu Swab (dịch ngoáy mũi, mắt, miệng, ổ nhớp, khí quản), lách, ruột và hạch tại các hộ chăn nuôi gà ở Ba Vì, Hà Nội Môi trường nuôi cấy và phân lập vi khuẩn là bước quan trọng trong việc xác định sự hiện diện của vi khuẩn gây bệnh.
Vi khuẩn có thể sinh trưởng trong điều kiện hiếu khí, hiếu khí tuỳ tiện hoặc yếm khí tuỳ tiện, với nhiệt độ tối ưu là 37°C, nhưng vẫn có thể phát triển ở khoảng 30 – 42°C Sự sinh trưởng của vi khuẩn được tăng cường khi bổ sung 5 – 10% máu cừu hoặc máu thỏ vào môi trường nuôi cấy, và chúng cũng có thể phát triển trên môi trường Tryptose soy agar và Chocolate agar Tuy nhiên, vi khuẩn không thể sinh trưởng trên các môi trường Macconkey agar và Endo agar, trong khi các môi trường dạng lỏng như BHI và PB cần được lọc kỹ trước khi sử dụng.
Môi trường lý tưởng để nuôi cấy vi khuẩn ORT là thạch máu Columbia Blood Agar, được bổ sung 5% máu cừu hoặc máu thỏ cùng với 5 µg/ml Gentamycin (Asadpour et al., 2008).
Để pha thạch máu Blood agar, cần cân chính xác 3,9g thạch máu với 100ml nước cất, sau đó hấp ướt ở 121°C trong 30 phút Sau khi để nguội đến 45-50°C, bổ sung 5ml máu thỏ và lắc đều cho máu hòa tan, tạo màu đỏ tươi đạt tiêu chuẩn Do hầu hết các chủng ORT đều kháng Gentamycin, nên cần thêm 10µg Gentamycin cho mỗi ml môi trường thạch máu để phân lập ORT từ các mẫu bị tạp nhiễm Cuối cùng, đổ hỗn hợp vào đĩa lồng với lượng 10-15ml mỗi đĩa.
Hình 3.1 Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin 3.6.3 Các loại hoá chất
- Hoá chất nhuộm Gram: tím Genxian, đỏ fucxin, cồn axetol 70 độ, dung dịch lugon.
- Thử phản ứng oxydase: giấy thử phản ứng oxydase tẩm 1% dung dịch Tetrametyl-p Phenylenediamine hydrochloride.
- Thử phản ứng indol: thuốc thử Kovac ’ s, nước trypton
- Thử kháng sinh đồ: môi trường thạch máu thỏ, giấy tẩm kháng sinh.
- Kit QIAamp DNA Mini Kit của hãng QIAGEN để chiết tách DNA.
Tủ ấm, tủ -80 độ C, kính hiển vi, máy ly tâm, máy vortex, máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp gel, máy hấp ướt, tủ sấy khô, tủ lạnh bảo quản mẫu và tủ lạnh bảo quản môi trường là những thiết bị quan trọng trong nghiên cứu và bảo quản mẫu trong phòng thí nghiệm.
Dao, kéo, panh kẹp, khay, đèn cồn, eppendorf, lanmen, lam kính, bộ dụng cụ nhuộm, ống nghiệm, đĩa lồng, pipet, dụng cụ bảo hộ….