Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu thu mẫu ngoài thực địa: Vùng biển ven bờ thuộc Thành phố Đồng Hới, tỉnh Quảng Bình.
Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm:
Phòng Ký sinh trùng - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
Phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Động vật - Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
Trùng bào tử sợi thuộc lớp Myxosporea ký sinh trên cá biển.
3.3.2 Các loài cá nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã mổ khám 740 cá thể thuộc
37 họ, 8 bộ cá biển khác nhau (bảng 3.1).
Bảng 3.1 Thành phần các loài vật chủ nghiên cứu
Tên vật chủ nghiên cứu (tên khoa học, tên Việt Nam)
Nội dung nghiên cứu
- Xác định tình hình nhiễm myxosporea ở một số loài cá trong khu vực nghiên cứu.
- Xác định thành phần loài myxosporea.
- Mô tả các loài myxosporea.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Thu mẫu vật chủ ngoài thực địa
Vật chủ cá được thu thập từ các chợ cá ở khu vực cảng biển, được ghi tên thường gọi và phân loại theo từng loài Sau khi bảo quản lạnh trong thùng xốp, chúng được chuyển về phòng thí nghiệm để ghi lại thông tin chi tiết theo phụ lục 2 Các mẫu vật này cũng được chụp ảnh, đo kích thước và xác định loại bằng cách tham khảo ý kiến chuyên gia từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, cũng như so sánh với thông tin trên trang web www.fishbase.org và trong sách Động vật chí phần cá biển.
3.5.2 Phương pháp thu thập mẫu ký sinh trùng
Các mẫu cơ cá được cắt mỏng và ép trên lam kính để quan sát myxosporea dưới kính hiển vi Những mẫu có sự hiện diện của myxosporea được bảo quản trong dung dịch cồn 70%.
Mật được tách ra từ gan và sau đó được đặt lên lam kính để quan sát dưới kính hiển vi Các mẫu nhiễm myxosporea được cố định để làm tiêu bản, trong khi phần còn lại được bảo quản trong cồn 70%.
Các mẫu được chuẩn bị bằng cách đặt lên lam kính có phủ lamen và quan sát dưới kính hiển vi Đối với mẫu mật, dung dịch mật được nhỏ giọt lên lam kính, sau đó phủ lamen và tiến hành quan sát Còn với mẫu cơ, một lát cơ nhỏ được đặt lên lam kính, ép thành lớp mỏng, đậy lamen và quan sát dưới kính hiển vi.
Dung dịch nhuộm Hematoxylin được chuẩn bị theo phương pháp của Mayer:
- Potassium aluminum sulfate (Kal(SO 4 ) 2 )
Để chuẩn bị dung dịch nhuộm, bạn có thể làm tan Hematoxylin trong nước cất bằng cách đun cách thủy ở nhiệt độ 100°C trong 5 phút Sau khi Hematoxylin tan hoàn toàn, thêm Potassium aluminum sulfate và khuấy đều cho đến khi muối này cũng tan Tiếp theo, bổ sung Sodium iodate, sau đó là Citric và Chloral hydrate.
Dung dịch nhuộm Eosin được chuẩn bị theo phương pháp của Mayer:
- Glacial acetic acid (CH 3 COOH)
Cách pha: Hòa tan Eosin trong nước cất có thể sử dụng máy gia nhiệt để chúng tan hoàn toàn trong nước Sau đó thêm Glacial acetic acid vào.
Các bước thực hiện: phiến mô đã được sấy khô đặt vào giá thủy tinh và lần lượt nhúng vào các dung dịch theo bảng 3.2.
Bảng 3.2 Quy trình nhuộn Hematoxylin - Eosin
Số thứ tự các bước
3.5.4 Phân tích hình thái học
Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi Olympus CH-40 ở độ phóng đại 1.000 lần Đo kích thước, chụp ảnh và vẽ myxosporea bằng phần mềm Illustrator CS2
Phương pháp định loại dựa theo khóa phân loại của Lom and
Diková (1992) và theo khóa định loại của Fiala et al (2015a).
Kích thước myxosporea được đo theo phương pháp của Lom and Diková (1992) (hình 3.1).
Hình 3.1 Các số đo cần thiết để định loại ký sinh trùng myxosporea
A và B đại diện cho Myxobolus từ phía trước và bên; C và D là Henneguya từ các góc nhìn tương tự; E và F thể hiện Myxidium ở cả hai phía; G và H mô tả Chloromyxum từ bên hông hoặc phía trước; I là Kudoa nhìn từ đỉnh; J là Kudoa ở một trong những điểm phụ có thể là đường chéo Các thông số quan trọng bao gồm L là chiều dài bào tử, W là độ rộng bào tử, T là độ dày bào tử, AL là chiều dài phụ đuôi, và TL là tổng chiều dài bào tử.
3.5.5 Phương pháp phân tích DNA
3.5.5.1 Phương pháp tách chiết DNA
Mẫu myxosporea được tách chiết DNA tổng số bằng DNeasy Tisue Kit (QIAgen) theo quy trình của nhà sản xuất:
1 Cho 200mg mẫu có chứa các bào tử myxosporea vào trong ống eppendorf UV-crosslinked 1.5mL.
2 Cho thờm 180 àl buffer ATL, 20 àl Proteinase K vào ống cú chứa mẫu mụ tách chiết ở bước 1 và đậy nắp Trộn đều bằng Vortex trong 15 giây
3 Ủ mẫu ở 56ºC trong 3 tiếng hoặc qua đêm.
4 Lấy mẫu ra khỏi mỏy ủ, vortex nhẹ; thờm 200 àl buffer Al và vortex.
6 Thờm 200 àl cồn tuyệt đối và chuyển toàn bộ dung dụng này lờn cột spin
7 Ly tâm 8000 rpm trong 1 phút, loại bỏ chạy qua.
8 Thờm 500 àl buffer AW1, ly tõm ở 8000 rpm trong 1 phỳt, loại bỏ dung dịch chạy qua.
9 Thờm 500 àl buffer AW2, ly tõm ở 13000 rpm trong 3 phỳt, loại bỏ dung dịch chạy qua.
10 Đặt cột spin lên ống ống eppendorf UV-crosslinked 1.5mL, thờm 200 àl đệm AE Để trong 1 phỳt và ly tõm ở 8000 rpm trong 1 phút Dung dịch thu được có chứa DNA tổng số.
Nhân bản trình tự DNA của đoạn SSU rDNA (Small subunit ribosomal DNA - 18S) của các mẫu myxosporea bằng kỹ thuật PCR với hai cặp mồi 18e (5’-CTGGTTGATCCTGCCAGT-3’)-Kud6R (5’-TCCAGTAGCTACTCATCG-3’) và
GGTAGTAGCGACGGGCGGCGTG-3´) (Hillis and Dixon, 1991; Whipps et al.,
2003) Thành phần phản ứng PCR gồm: H 2 O = 37,5 àl, Buffer = 5 àl, dNTP
Chu trình nhiệt bao gồm các giai đoạn chính: giai đoạn khởi đầu ở 95°C trong 5 phút để biến tính, sau đó là 35 chu trình nhiệt với các bước 95°C trong 30 giây, 51°C trong 40 giây, và 72°C trong 1 phút Giai đoạn cuối kéo dài 72°C trong 3 phút Các thành phần quan trọng trong quy trình này bao gồm primer xuụi và ngược, template, và enzyme.
Để chuẩn bị gel, cân thạch agarose và hòa vào dung dịch TAE 1x, sau đó đun trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn Để dung dịch nguội đến 60°C, rồi đổ vào khuôn gel điện di đã cài sẵn lược Sau khoảng 30-45 phút, khi gel đã đông cứng, tháo lược ra và đặt bản gel vào bể điện di chứa dung dịch TAE 1X sao cho gel ngập hoàn toàn trong dung dịch.
Để thực hiện điện di DNA, trước tiên cần trộn sản phẩm PCR với loading buffer 6x theo tỷ lệ 4:1, sau đó cho vào giếng điện di Điện di thường được thực hiện với điện thế từ 100 đến 120V, giúp DNA di chuyển từ cực âm sang cực dương Theo dõi sự di chuyển của màu loading buffer để xác định thời gian điện di phù hợp, tránh tình trạng mẫu DNA bị chạy ra ngoài.
Nhuộm gel DNA được thực hiện bằng cách ngâm bản gen trong dung dịch ethidium bromide 0,5 µg/ml trong 15 phút với sự lắc nhẹ Sau đó, gel sẽ được rửa dưới vòi nước chảy để loại bỏ dư lượng Sản phẩm PCR sẽ được đánh giá bằng cách soi gel dưới đèn UV và chụp ảnh bằng máy ảnh Canon 750D.
3.5.5.3 Phương pháp phân tích số liệu
Sản phẩm PCR rõ băng vạch được gửi đi tinh sạch và giải trình tự tại hãng Macrogen (Hàn Quốc) Chương trình BLAST được sử dụng để so sánh mức độ tương đồng của trình tự thu được với các trình tự trên Genbank Phân tích mối quan hệ tiến hóa phân tử của các trình tự này được thực hiện bằng phần mềm MEGA 6 theo phương pháp Neighbor Joining (Tamura et al., 2013).