Trờng Đại học Vinh Khoa sinh học === === Lê thị thu giang Vi khuẩn lam Microcystis trong một số thuỷ vực nớc ngọt ở các tỉnh nghệ an, hà tĩnh và quảng bình Khóa luận tốt nghiệp Vinh - 2009 ---------- Lời cảm ơn Nghành cử nhân khoa học sinh học 1 Để hoàn thành luận văn này, em đã nhận đợc sự giúp đỡ nhiệt tình của Ban chủ nhiệm khoa Sinh học, các thầy cô trong tổ bộ môn Di truyền - Vi sinh - Phơng pháp giảng dạy. Đặc biệt, em đã nhận đợc sự giúp đỡ nhiệt tình và sự h- ớng dẫn trực tiếp của ThS. Nguyễn Lê ái Vĩnh trong suốt thời gian thực hiện đề tài. Bên cạnh đó, em còn nhận đợc sự giúp đỡ của cán bộ và công nhân của các trại nuôi thuỷ sản, hồ cấp nớc sinh hoạt, các hộ gia đình nơi em đến nghiên cứu thực địa và thu mẫu; của các anh chị cao học, các bạn sinh viên và gia đình. Em xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Vinh, tháng 5 năm 2009 Sinh viên Lê Thị Thu Giang Mở Đầu 1. Lý do chọn đề tài Vi khun lam (Cyanobacteria) l nhng c th m t bo ca chỳng cha cú nhõn in hỡnh v cú kh nng quang t dng. Trc õy Vi khun lam cũn c gi l to lam (Cyanophyta), rong lam, to nhy (Myxophyceae), 2 thc vt phõn ct (Schizophyceae) v c xp vào nhóm to (Algae). Ngy nay, vi khun lam cựng vi vi khun (Bacteria) c xp thnh mt gii riờng thuc nhúm tin nhõn (Procaryota). Vi khun lam phân bố rộng trong mụi trng nc v mụi trng t, chúng cú vai trũ quan trng trong việc cải tạo đất trồng nhờ khả năng cố định nitơ; cung cấp dinh dỡng cho con ngời và vật nuôi nhờ nhiều loài có hàm lợng protêin cao. Nhng ngợc lại, vi khun lam thờng gõy hin tng "n hoa nc" (water bloom), gõy hi i vi cỏc loi ng vt thu sinh. Cỏc c t vi khun lam (Cyanotoxins) cũn l mi nguy c tim n nh hng n cht lng nớc v v sinh an ton thc phm. Kt qu iu tra cỏc thu vc nc ngt cho thy có khong 50 - 75% mu n hoa nc là do sự phát triển mạnh của cỏc chi Microcystis, Spirulina, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Oscillatoria, Notoc, Lyngbya Trong các thuỷ vực đó hầu hết đều có sự xuất hiện của Microcystis. Tính gây độc của Microcystis ở các thuỷ vực nớc ngọt đã đợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu [14, 15]. ở Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu điều tra sự phân bố của Microcystis trong các thuỷ vực nhng chủ yếu tập trung ở lu vực sông Mê Kông và lu vực sông Hồng. Riêng ở miền Trung Việt Nam, các nghiên cứu về Microcystis còn rất hạn chế [5]. Với những lý do trên chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: "Vi khun lam Microcystis trong mt s thu vc nc ngt cỏc tnh Ngh An, H Tnh và Qung Bỡnh". 2. Mc tiờu ti + Tìm hiểu nhng loi vi khun lam Microcystis cú mt trong mt s thu vc nc ngt cỏc tnh Ngh An, H Tnh và Qung Bỡnh + Xem xột mi quan h gia s phõn b ca chỳng vi mt s ch tiờu thu lớ, thy hoỏ. 3 + Bớc đầu đánh giá mức độ ảnh hởng của chúng đối với môi trờng nớc. 3. Nhim v ca ti + iu tra mt s ch tiờu cht lng nc ca cỏc thy vc cỏ tnh Ngh An, H Tnh v Qung Bỡnh : nhit , pH, hm lng oxy hũa tan (DO), NH 4 + , PO 4 3 - . + Xỏc nh thnh phn loi, mc gp ca t bo VKL Microcystis trong cỏc thy vc nghiờn cu. + Xem xột mi quan h gia thnh phn loi vi mt s yu t sinh thỏi. ti c thc hin t thỏng 10 nm 2008 n thỏng 4 nm 2009 ti phũng thớ nghim Vi sinh vt, T b mụn Di truyn - Vi sinh - Phng phỏp ging dy, Khoa Sinh hc, trng i hc Vinh. Chơng 1 Tổng quan tài liệu 1.1. Tình hình nghiên cứu về Microcystis trên thế giới và ở Việt Nam Vào thế kỷ XIX và đầu thế kỷ XX, các công trình nghiên cứu VKL chủ yếu tập trung theo hớng phân loại học. Những ngời đầu tiên nghiên cứu về VKL là C. Agardh (1824) và Kuetzing (1843). Những ngời đặt nền móng cho hệ thống phân loại VKL là Thuret (1875), Kirchnet (1900), Stizenberger (1860) và Sach (1874). Sau năm 1914 đã xuất hiện các hệ thống mới về phân loại VKL. 4 Đối với VKL Microcystis đã có nhiều công trình nghiên cứu theo hớng phân loại học, chủng loại phát sinh, độc tố hoá học, sinh lý hoá sinh cùng với vai trò của nó đối với con ngời và các loài động thực vật khác. Một số tác giả đi theo hớng phân loại hình thái nh Desikachary (Cyanophyta) 1959), Gollerbax (Tảo lam - Phân loại tảo nớc ngọt, 1953) đã phân loại Microcystis gồm 16 loài và dới loài. Bên cạnh việc nghiên cứu về phân loại học của VKL Microcystis, các nhà khoa học còn quan tâm đến đặc tính sinh thái học, mối quan hệ giữa sự phát triển của chúng với các yếu tố môi trờng cũng nh tác dụng gây hại của chúng. Hội nghị quốc tế lần thứ nhất về sự nở hoa của tảo độc hại đã đợc tổ chức từ ngày 4 6/11/1974 tại Boston Mussachusetts (Mỹ). Sau đó các hội nghị quốc tế thờng niên 2 năm một lần đợc tổ chức tại các nớc khác nhau. Thông qua các hội nghị này, nhiều công trình nghiên cứu về tảo độc hại trên thế giới đã đợc công bố. Nhờ đó, sự độc hại của VKL Microcystis ngày càng đợc hiểu rõ hơn. ở Nhật Bản, theo điều tra năm 2001, từ các công trình thuỷ lợi nằm trong vùng Kantc có trữ lợng nớc 560 000 m 3 cho thấy có khoảng 80% các công trình thuỷ lợi có hiện tợng gây độc của VKL Microcystis. ở các nớc nh úc, Nam Mỹ, châu Âu, Mỹ . có nhiều công trình nghiên cứu về sự độc hại của VKL Microcystis đặc biệt là Microcystis aeruginosa. ở Việt Nam, tình hình nghiên cứu riêng về VKL Microcystis còn rất hạn chế, chủ yếu đợc nghiên cứu cùng với VKL hoặc với các loài tảo độc khác. Năm 1996, Dơng Đức Tiến xuất bản cuốn sách Phân loại vi khuẩn lam ở Việt Nam. Trong đó, ông đã phân loại VKL Microcystis gồm 16 loài và dới loài đ- ợc mô tả chi tiết. Đây là tài liệu điều tra hữu ích cho các nhà khoa học nghiên cứu về VKL cũng nh về Microcystis ở Việt Nam. Một số đề tài nghiên cứu về hiện tợng nở hoa nớc và độc tố của VKL Microcystis nh đề tài Điều tra phát hiện tảo độc tại các thuỷ vực trọng điểm của Hà Nội và nột số tỉnh phía bắc 5 làm cơ sở cho việc xây dựng chỉ tiêu quan trắc sinh học trong giám sát chất l- ợng nớc của Viện Công nghệ môi trờng do GS. TS. Đặng Đình Kim và TS. Đặng Hoàng Phớc Hiền làm chủ nhiệm, thực hiện từ năm 2003 2005 và đề tài VKL gây hại thuộc chi Microcystis ở Việt Nam của Dơng Đức Tiến, Trịnh Tam Kiệt thuộc trung tâm công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội. 1.2. Vị trí phân loại, đặc điểm hình thái và sinh sản của chi Microcystis 1.2.1. Vị trí phân loại của chi Microcystis Theo hệ thống phân loại của Gollerbax (1953), Desikachary (1959) và Dơng Đức Tiến (1996), chi VKL Microcystis thuộc: H: Chroococcaceae B: Chroococcales Ngnh: Cyanobacteria 1.2.2. Cấu tạo tế bào của vi khuẩn lam Microcystis Tế bào có dạng hình cầu hoặc hình elíp, màng tế bào khá dày và hình thành bao nhầy chuyên hoá bao quanh tế bào. Tế bào cha có nhân điển hình. Trong chất nguyên sinh gồm có: chất nhân, những bản quang hợp, thể ribô và các hạt chất tế bào khác, thờng có không bào khí nhằm giúp cho tản nhẹ và dễ nỗi trong nớc, sự xuất hiện của không bào khí liên quan đến sự giảm đi một l- ợng khí hoà tan trong môi trờng và sự lên men sinh học. Thành phần chất màu có nhóm chất màu biliprotein, không có diệp lục b. Tế bào của Microcystis chứa các không bào khí nên có màu đen, đôi lúc chúng chìm xuống đáy ao hồ (vào mùa thu do sự tích luỹ hydratcacbon làm giảm tỉ trọng của Microcystis, vào mùa xuân khi nhiệt độ nớc tăng lên tảo lại nổi lên). 6 + Vách tế bào: Vách tế bào của Microcystis có 4 lớp, giữa lớp ngoài và lớp trong cùng là lớp chứa chất murein (peptidoglycan - dẫn xuất của glucoza có chứa nhóm amin). Ngoài cùng là lớp chất nhầy bao quanh. + Sắc tố và vùng chất màu: Microcystis chứa các sắc tố: diệp lục a (không bao giờ có diệp lục b), - caroten và phycobiliprotein. Microcystis cũng nh các loài VKL khác không có sắc thể (Chromatophore) nhng có các lamen quang hợp (Thylacoid). Chúng nằm tự do ở vùng ngoài của tế bào chất. + Không bào khí: Hầu hết các loài Microcystis trong tế bào đều chứa không bào khí. Đó là một túi màng mỏng cấu tạo từ protein và chứa đầy khí nitơ. Mỗi không bào khí do nhiều bóng nhỏ hợp lại. Khi ánh sáng đi qua không bào khí có màu đen. Không bào khí xuất hiện nhiều khi cờng độ ánh sáng tăng lên, trong trờng hợp này chúng có vai trò tán xạ ánh sáng để tế bào khỏi bị đốt nóng. Các không bào khí của Microcystis thờng bị xẹp mạnh bởi áp suất trơng, chính yếu tố này giải thích sự sinh trởng dày đặc của chúng trên bề mặt nớc [4]. 1.2.3. Hình thái của Vi khuẩn lam Microcystis VKL Microcystis thờng sống thành tập đoàn gồm nhiều tế bào dính lại với nhau bằng chất nhầy thành một thể nguyên vẹn, mắt thờng có thể nhìn thấy tập đoàn trôi lơ lững trong nớc. Đó là những cục nhầy có kích thớc từ 40 250 micron, gồm những tế bào hình cầu xếp lại, các tế bào trong tập đoàn thờng giống nhau. Khi còn non tập đoàn có dạng hình cầu, khi trởng thành và già bị biến dạng mạnh. 1.2.4. Sinh sản của vi khuẩn lam Microcystis VKL Microcystis sinh sản bằng cách phân đôi theo 3 mặt phẳng, nghĩa là phân chia theo 3 hớng không gian thẳng góc với nhau tạo thành các dạng hình khối. Không có sinh sản hữu tính. 1.3. Khái quát về độc tố vi khuẩn lam (Cyanotoxins) và Microcystins 7 Đa số các thuỷ vực có diện tích bề mặt lớn, nớc đứng hoặc nớc chảy chậm VKL phát triển mạnh khiến nớc có màu xanh nhạt, không phải VKL nào cũng gây hại, thông thờng VKL gây độc bằng hai con đờng: * Tạo nên quần xã VKL rộng lớn trong môi trờng nớc. Khi chúng phát triển qua mức khiến hàm lợng O 2 trong nớc giảm đi đột ngột và làm cho cá bị chết ngạt. Hiện tợng này xảy ra vào cuối giai đoạn nở hoa nớc do tác dụng của VKL còn sống và đã chết. * Một số VKL tiết ra độc tố (Cyanotoxins) làm suy yếu và gây chết các sinh vật đã bắt mồi và ăn chúng. Về mặt sinh lý, độc tố VKL đợc chia làm 2 loại: + Độc tố thần kinh (Heurotoxin): là các alcoloit (thành phần chứa Nitrogen có trọng lợng phân tử thấp) dẫn truyền xung từ nơron thần kinh này đến nơron thần kinh khác rồi tới cơ động vật và ngời. Dấu hiệu bị nhiễm độc nh : choáng váng, lảo đảo, co giật cơ, thở hổn hển và co quắp chân tay. Khi bị nhiễm độc tố ở nồng độ cao thì hô hấp khó khăn, có khi ngừng thở. Độc tố thần kinh Anatoxin đợc tổng hợp nhờ các VKL thuộc chi Anabaena, Aphanizomenon, Osillatoria và Trichodemmium. + Độc tố gan (Hepatotoxin): là chất kiềm chế protêin photphotases I và 2A, gây chảy máu trong gan. Dấu hiệu bị nhiểm độc: cơ thể yếu ớt, nôm mửa, tiêu chảy và rét run. Độc tố gan gồm có Microcystins và Nodularin. Microcystins đ- ợc sản sinh từ một số loài của chi Microcystis, Anabaena, Nostoc, Nodularia và Oscllatoria. Công thức cấu tạo của một số độc tố Cyanotoxins. 8 Microcystins Khi các động vật uống nớc có chứa các độc tố này thì độc tố trong nớc xâm nhập vào các vùng rộng lớn của ruột gây tác động đến cơ thể. Mặt khác nhiều VKL sản sinh ra 2methylisoboneal (MIB) và Goesmin liên quan đến sự tổng hợp chlorophyll và carotenoid. Hầu hết ở các thuỷ vực đều có VKL Microcystis và có nơi có mật độ rất cao từ 4 7.10 6 tế bào/lít. Hiện tợng nở hoa nớc ở trong các thuỷ vực hầu hết do các loài thuộc chi Microcystis ngành VKL gây nên. Các loài M. viridis, M. aeruginosa, M. flos aquae sản sinh ra độc tố Microcystins gây tác hại đến gan. ở các thuỷ vực phía Bắc Microcystis phát triển từ tháng 2 đến tháng 6, ở các thuỷ vực phía Nam Microcystis phát triển quanh năm [11]. 9 VKL thờng có khoảng 20 loài và phân loài phân bố rộng có chứa các độc tố. Bản chất hóa học của chúng là các peptid, alcaloid, phenol hoặc cha rõ bản chất là gì. Với Microcystis đã phát hiện có một số loài gây độc và tìm hiểu độc tố của chúng. Bảng 1.1: Độc tố của một số loài VKL Microcystis TT Tên loài Tên độc tố Bản chất hoá học 1 Microcystis aeruginosa Nodularia toxin Không rõ 2 Microcystis flos aquae Microcystins type C Peptid M. aeruginosa tiết FDF (Fast Death Factor yếu tố gây chết nhanh). Đây là một polypeptid mạch vòng, trọng lợng phân tử 1300 2600, khi thuỷ phân ta đợc 7 axit amin sau: Asparaginic : Glutamic : Destrin : Valin : Ornitin : Alanin : Leuxin 1 : 2 : 1 : 1 : 1 : 2 : 2 FDF làm chết động vật kể cả con ngời, trâu, bò (trừ vịt); kìm hãm sự phát triển của ấu trùng ruồi. Khi bị ngộ độc, các phản ứng oxy hoá trong mô bị phá huỷ, làm mất hàng loạt các enzim của chu trình Krebs và mạng lới hô hấp, thiamine hydrolase hoạt động mạnh và lợng thiamine giảm đến tối thiểu. Vitamin nhóm B bị giảm nghiêm trọng. Các qúa trình oxy hoá hoạt hoá photphos trong các ti thể của gan bị phá huỷ, gây hoại tử gan. Khi ăn cá ở hồ bị nhiệm độc này ngời ta bị thiếu vitamin nhóm B đặc biệt là vitamin B1, gây ra bệnh khó thở (do thiếu O 2 ), đau nhức cơ bắp. Chức năng đờng tiêu hoá bị phá huỷ. Đôi khi gây dị ứng, gây độc hệ thần kinh trung ơng. Gây cho da các vết đỏ, làm cho da phồng lên trong là các khoang rỗng, các chổ nối các khớp bị đỏ lên. Những thuỷ vực chứa nhiều M. aeruginosa nớc thờng có màu rỉ đồng. 1.4. Một số yếu tố môi trờng ảnh hởng đến đời sống của Microcystis 1.4.1. Cỏc yu t vt lý * ánh sáng 10 . Đại học Vinh Khoa sinh học === === Lê thị thu giang Vi khuẩn lam Microcystis trong một số thuỷ vực nớc ngọt ở các tỉnh nghệ an, hà tĩnh và quảng bình Khóa. Microcystis trong một số thuỷ vực nớc ngọt ở các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh và Quảng Bình 3.1.1. Thành phần loài vi khuẩn lam Microcystis Qua vi c phân tích mẫu