TỔNG QUAN
Tổng quan về đu đủ
1.1.1 Nguồn gốc và phân bố Đu đủ là một trong những loại trái cây phổ biến của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Sản lượng thế giới năm 2004 đạt 6,8 triệu tấn trên 389.990 hecta (FAO 2004), trong đó 47% sản lượng có nguồn gốc từ khu vực Trung và Nam Mỹ (chủ yếu ở Brazin), 30% từ Châu Á và 20% thuộc về Châu Phi (FAO 2004) Mặc dù được trồng (>90%) và tiêu thụ chủ yếu tại các nước đang phát triển, nhưng đu đủ đã nhanh chóng trở thành một loại trái cây quan trọng của thế giới, bao gồm cả quả tươi cũng như sản phẩm qua chế biến [17]
Bảng 1.1 Sản lượng đu đủ theo vùng địa lý [17]
Region Area harvested (Ha) Production (Mt)
South America 65,546 2,120,370 Đu đủ được phát hiện lần đầu tiên bởi Oviedo, giám đốc vùng mỏ Hispaniola
Từ năm 1513 đến 1525, Alphonso de Valverde đã thu nhận hạt đu đủ từ bờ biển Panama tới Darien, sau đó mang đến San Domingo và các hòn đảo khác của miền tây Ấn Độ Người Tây Ban Nha đã đặt tên cho nó là “papaya” và đưa vào trồng ở Philippines, từ đó lan rộng ra Malaya và cuối cùng đến Ấn Độ vào năm 1598 (Schery 1952) Đến năm 1874, cây đu đủ đã nhanh chóng được phân bố rộng rãi tại các quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Cây đu đủ được trồng phổ biến ở Việt Nam, đặc biệt ở các tỉnh miền Bắc và miền Nam Loại cây này thường phát triển mạnh mẽ tại các vùng đồng bằng, ven sông, trên đất phù sa, đất dốc tụ và phù sa cổ Một số địa phương nổi bật với việc trồng đu đủ bao gồm Hà Tây và Hà Nam.
Diện tích trồng đu đủ trên toàn quốc ước tính khoảng Hưng Yên, Tuyên Quang, Vĩnh Phúc ở miền Bắc, cùng với Lái Thiêu, Tiền Giang, Sông Bé (cũ) và các tỉnh Tây Nguyên ở miền Nam.
10.000-17.000 ha với sản lượng khoảng 200-350 nghìn tấn quả [4]
Cây đu đủ có thể đã du nhập vào Việt Nam từ Philippines vào thời điểm chưa xác định Tại Việt Nam, có hai giống đu đủ truyền thống là đu đủ thịt đỏ và đu đủ thịt vàng Hiện nay, nhiều giống đu đủ mới được lai tạo và nhập nội, chủ yếu là giống đu đủ lai F1, với năng suất, sản lượng và chất lượng quả cao, đa dạng về màu sắc như đỏ, vàng, tím.
Vào năm 2008, công ty BPI.SA từ Vương quốc Bỉ đã tài trợ cho dự án phát triển cây đu đủ tại vùng Daklak, Việt Nam Toàn bộ mủ đu đủ được xuất khẩu sang Bỉ ở dạng thô để sử dụng làm thuốc và chất xúc tác trong ngành hóa thực phẩm Dự án này tập trung vào giống đu đủ Solo.
(lai giữa đu đủ Châu Phi và Thái Lan) trong điều kiện chăm sóc tốt có thể cho 1-1,5 kg mủ khô [5]
1.1.2 Hình thái và sinh lý cây đu đủ Đu đủ là một loại cây nhiệt đới, thân thảo to, thẳng, có nhánh hoặc không phân nhánh Thân đu đủ có thể cao 2-10 m Rễ chùm, mọc lan tỏa khắp gốc, và đâm sâu xuống đất [17]
Lá đơn to có hình chân vịt, mọc cách và xoắn theo vòng Cuống lá dài, hình ống và rỗng ruột Mỗi phiến lá chia thành 8-9 thùy sâu, với các thùy này còn bị khía thêm, tạo cảm giác như bị xẻ rách.
Hoa có màu trắng phớt vàng nhạt, mọc thành chùm xim ở nách lá già Hoa thường đơn tính và khác gốc, nhưng cũng có cây mang cả hoa đực, hoa cái và hoa lưỡng tính Cụm hoa đực phân nhánh nhiều và có cuống rất dài, trong khi cụm hoa cái chỉ gồm 2 hoa.
Thon gần tròn, mọc trong phần rổng của ruột quả, hạt có thể không phát triển [5]
Quả đu đủ có hình oval hoặc gần tròn, dài từ 15-50cm, bề dày 10-20cm và có thể nặng tới 9 kg Khi còn xanh, quả chứa nhiều mủ và có vỏ cứng Khi chín, vỏ quả chuyển từ vàng nhạt đến vàng đậm hoặc cam Bên trong, trái đu đủ già chứa nhiều hạt hình trứng màu xám đen, bám vào thịt quả nhờ lớp mô sợi mềm Đu đủ thường được trồng từ hạt, với quá trình nảy mầm diễn ra trong 2-4 tuần sau khi gieo Cây đu đủ có ba giới tính: đu đủ đực, đu đủ cái và đu đủ lưỡng tính.
Cây đu đủ có đặc điểm hoa và quả khác nhau tùy thuộc vào giới tính của nó Tuy nhiên, giới tính của cây đu đủ không thể xác định được cho đến 6 tháng sau khi nảy mầm.
Vào thời điểm này, việc tỉa thưa thực vật là cần thiết để đạt được tỷ số giới tính mong muốn, đồng thời giảm thiểu sự cạnh tranh giữa các cây, điều này sẽ ảnh hưởng đến sản lượng sau này (Gonsalves, 1994; Chia et al., 1989).
Cây đu đủ có tốc độ phát triển nhanh chóng, với quả đầu tiên xuất hiện sau 10-14 tháng từ khi nảy mầm Thời gian để quả đu đủ hoàn thiện thường khoảng 5 tháng.
1.1.3 Giá trị dinh dưỡng, ý nghĩa kinh tế và đặc tính dược lý của đu đủ
Cây này dễ trồng, cho quả sớm và có sản lượng cao, với chu kỳ kinh tế ngắn Toàn bộ thân, lá và quả của cây đều được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau như ăn tươi, chế biến, lấy nhựa và chăn nuôi.
Giá trị dinh dưỡng trong quả đu đủ chín bao gồm: 85-88% nước; 0,6% protein;
0,1% lipid; 8,3% đường; 60-122 mg vitamin C; 0,33 mg vitamin B1; 0,04 mg vitamin
B2; 0,33 mg vitamin PP và đặc biệt rất giàu vitamin A Quả đu đủ xanh chứa khoảng 60
– 70% các chất dinh dưỡng so với quả chín [3]
Một kết quả nghiên cứu khác cho thấy, trong 100g đu đủ có 74 - 80mg vitamin
Đu đủ là nguồn cung cấp vitamin C dồi dào, cùng với caroten (tiền vitamin A) từ 500 đến 1250 UI Ngoài ra, đu đủ còn chứa các vitamin B1, B2, các acid gây men và nhiều khoáng chất quan trọng như kali (179mg), canxi, magiê, sắt và kẽm.
Tổng quan về enzyme lipase
Lipase (triacylglycerol acylhydrolase, EC 3.1.1.3) là một enzyme thuộc nhóm hydrolase, có chức năng thủy phân các liên kết ester trong tri-, di-, và monoglyceride Quá trình này tạo ra các sản phẩm như acid béo, diacylglyceride, monoacylglyceride và glycerol trong điều kiện bình thường.
Enzyme lipase và estease đều có khả năng phân giải liên kết ester, nhưng lipase chỉ hoạt động hiệu quả với các cơ chất không tan trong nước Hoạt tính của lipase được tối ưu hóa khi ở bề mặt phân chia giữa pha cơ chất và nước, đặc biệt trong hệ nhũ tương, nơi diện tích tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme được tăng cường đáng kể.
Lipase hoạt động hiệu quả trong các hệ nhũ tương nước-dầu và dầu hòa tan trong dung môi hữu cơ Đặc biệt, lipase có tính linh hoạt cao, có khả năng xúc tác cho các phản ứng chuyển hóa ester và tổng hợp ester với cấu hình không gian đặc hiệu, sử dụng nhiều loại cơ chất phản ứng khác nhau.
Lipase là enzyme phân bố rộng rãi trong vi sinh vật, thực vật và động vật có vú, có vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hóa lipit ở động vật có vú Cụ thể, lipase ở tuyến tụy và dạ dày hỗ trợ tiêu hóa, trong khi lipase ở ruột, gan, lysosome và lipoprotein tham gia vào quá trình đồng hóa và dị hóa lipid.
Lipase là enzyme quan trọng được phát hiện trong các mô dự trữ của hạt dầu như hạt thầu dầu, hạt ngũ cốc và hạt hướng dương, đặc biệt hoạt động mạnh trong quá trình nảy mầm.
Lipase vi sinh vật có mặt rộng rãi từ vi khuẩn, nấm men đến nấm, với phần lớn lipase ứng dụng thương mại có nguồn gốc từ vi khuẩn Các vi sinh vật tổng hợp lipase thường được tìm thấy trong các môi trường phong phú như nước thải công nghiệp, nhà máy chế biến dầu thực vật, sữa, hạt có dầu, thực phẩm thối rữa, than đá và suối nước nóng.
Bản chất enzyme lipase là một protein nên có cấu tạo từ các acid amin
Nhiều trình tự amino acid của lipase đã được suy ra từ lipase tách dòng, cho thấy sự tương đồng giữa cấu trúc không gian của lipase vi sinh vật và động vật có vú Tuy nhiên, số lượng trình tự giống nhau hoàn toàn rất hạn chế, ngoại trừ những trình tự xung quanh trung tâm hoạt động.
Khi so sánh trình tự amino acid xung quanh trung tâm hoạt động của ba enzym xúc tác protease, lipase và cutinase với esterrase, có sự tồn tại của trình tự Gly-X1-Ser-X2-Gly (X là một amino axit bất kỳ) Sự khác biệt duy nhất là alanine thay thế glycine thứ hai trong chuỗi axit amin Không có trình tự cố định nào được tìm thấy quanh gốc histidine hoặc glutamic axit của trung tâm hoạt động, ngoại trừ trong các enzym tương đồng từ các loài họ hàng gần gũi.
1.2.3.2 Cấu trúc không gian của enzyme lipase
Xác định cấu trúc không gian ba chiều là cơ sở để hiểu được động học phản ứng
Enzyme lipase có cấu trúc chung bao gồm một gấp nếp β ở giữa, được bao quanh bởi các xoắn α Nhóm serine hoạt động của enzyme nằm trong một vòng (loop) được gọi là cùi chỏ xúc tác.
The catalytic elbow features a hydrophobic cleft located on serine, which forms following enzyme activation This cleft is characterized by an elongated pocket that adapts to tightly bind the substrate.
Trung tâm hoạt động của lipase là bộ ba gồm: Serine, Aspartate/Glutamate và
Histidine là một amino acid quan trọng trong cấu trúc của lipase Khác với protease, trung tâm xúc tác của lipase không nằm ở bề mặt ngoài mà ẩn sâu dưới chuỗi xoắn bề mặt Mọi lipase đều có vị trí hoạt động chứa Ser và His, đóng vai trò thiết yếu trong chức năng của enzyme này.
Asp (hoặc Glu) được che khuất bởi một đoạn nắp cấu tạo từ một hoặc hai chuỗi xoắn, trong khi bề mặt của Trypsin hoàn toàn không cực và tương tác với đầu kị nước xung quanh trung tâm hoạt động Cấu trúc lipase thường có đầu serine hoạt động trong chuỗi pentapeptit với trình tự Gly-X1-Ser-X2-Gly, cấu trúc này cũng được tìm thấy ở protease serine (Boel và cộng sự, 1998).
Hình 1.2 Cấu trúc không gian của lipase từ Candida rugosa [9]
1.2.4 Cơ chế xúc tác của enzyme lipase
Trong quá trình xúc tác, một đặc điểm quan trọng của lipase là có sự thay đổi về dạng không gian của vùng (trung tâm) hoạt động
Theo nghiên cứu, lipase có các nhóm serin, histidin và acid aspastic tại trung tâm hoạt động Đối với các cơ chất không tan trong nước, hoạt tính của lipase đạt cực đại khi được phân tán ở bề mặt phân pha dầu nước, quá trình này được gọi là hoạt hoá phân pha.
Khi thiếu nước hoặc chỉ có một lượng nước nhỏ, phản ứng este hóa và phản ứng este sẽ được ưu tiên Trong tình huống này, tốc độ xúc tác và tính đặc hiệu của phản ứng phụ thuộc chủ yếu vào điều kiện phản ứng và bản chất của cơ chất.
Hình 1.3 Mô hình cơ chế xúc tác của lipase ở bề mặt tiếp xúc giữa hai pha dầu–nước
E : Là lipase hòa tan có hoạt tính
E* : Là lipase hoạt động được hấp thu
S : Là cơ chất không tan trong nước
E*S: Là các phức hệ cơ chất lipase
P : Là sản phẩm thủy phân
Lipase xúc tác cho một phản ứng hóa học qua ba bước (Martinelle, Hult, 1994)
Bước 1: Lipase thủy phân liên kết ester của lipid tại bề mặt phân pha giữa lipid và nước
Trong nước trung tâm hoạt động chứa serine bị khóa lại bởi vòng xoắn helix (Hình 1.4)
Khi lipase gắn vào bề mặt phân pha, vòng xoắn helix sẽ di chuyển, tạo điều kiện cho cơ chất kết nối với trung tâm hoạt động.
Hình 1.5 Hình thành phức hợp enzyme - cơ chất Bước 3: tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới dạng tự do
1.2.5 Một số phản ứng đặc trưng
Lipase có thể tham gia xúc tác cho rất nhiều phản ứng hóa học khác nhau Đặc biệt là phản ứng thủy phân và este hóa
Phản ứng thủy phân là một phản ứng đặc trưng với sự tham gia của lipase Quá trình thủy phân sẽ tạo thành acid béo và glycerol (Hình 1.6)
Phản ứng ester hóa (Hình 1.7) là phản ứng giữa một acid béo và rượu tạo ra ester
Hình 1.6 Phản ứng thủy phân [10]
Hình 1.7 Phản ứng este hóa [10]
Phản ứng trao đổi giữa các ester (Hình 1.8) là phản ứng trao đổi giữa các ester hoặc giữa este và acid béo
Hình 1.8 Phản ứng trao đổi giữa các ester [10]
Phản ứng chuyển ester (Hình 1.9) là phản ứng giữa ester với rượu hoặc glycerol
Hình 1.9 Phản ứng chuyển este [10]
1.2.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về lipase
1.2.6.1 Tình hình nghiên cứu lipase ngoài nước
Tổng quan về cá hồi
Hình 1.10 Cá hồi (Salmon/Oncorhynchus spp)
Tên khoa học: Salmon/Oncorhynchus spp
Bảng 1.2 Đặc điểm các loại cá hồi [26]
Cá hồi Thái Bình Dương và Đại Tây Dương
Tên khoa học Đặc điểm hình thái
Cá hồi Đại Tây Dương
Trên đường bên của cá có những điểm hình dấu X, có thể xuất hiện hoặc không ở đuôi Hàm trên của cá không mở rộng quá phía sau mắt Ngoài ra, có những điểm đen lớn trên mang giúp phân biệt với cá hồi Thái Bình Dương.
Chim có màu xanh lá và xanh dương trên lưng cùng đỉnh đầu, trong khi hai bên mình mang màu bạc và bụng trắng Đuôi của chúng có những điểm màu đen, và phần thân phía trước cũng có màu sắc tương tự; miệng của chim có màu xám đậm.
Có chiều dài khoảng 58cm, trọng lượng 15,9kg và tuổi thọ tối đa là 7 năm
Có thân thon dài, cá đực thành thục thường có một cái bướu nhỏ Hàm trên kéo dài đến sau mắt Lược mang 18-25, vây lưng 8-10, vây hậu môn 12-14
Có màu bạc sáng ở đại dương, loài cá này khi trở về dòng suối sẽ chuyển sang màu xám nhạt ở mặt lưng và bụng trắng hơi vàng Đặc điểm nổi bật của nó là cái miệng màu trắng với nướu đen, không có răng trên lưỡi, cùng với điểm lớn hình bầu dục màu đen trên lưng và đuôi hình chữ V Ngoài ra, vây đít của nó có từ 13 đến 17 vây tia mềm.
Có chiều dài khoảng 58cm, trọng lượng 7,7kg và tuổi thọ tối đa là 8 năm
Có thân thon dài, 10-12 tia vây lưng, 8-
Cá vây hậu môn có 12 tia, với các chấm màu đen hình cánh sao trên thân Khi cá trưởng thành, lườn cá sẽ xuất hiện các vân màu hồng, đặc trưng cho cá đực trong mùa sinh sản.
Lưng có màu tối, trong khi các sọc trên cơ thể chuyển sang màu đỏ tươi, kết hợp với sắc đỏ thẫm ở bụng, tạo thành một dải màu sắc nhẹ hơn theo chiều dọc.
1.3.2 Thành phần dinh dưỡng của cá hồi
Cá hồi là một loại cá béo, nổi bật với hàm lượng protein cao, acid béo omega-3 phong phú và vitamin D dồi dào, khiến nó trở thành thực phẩm lành mạnh Thịt cá hồi cung cấp cholesterol tốt với mức độ biến đổi từ 23–214 mg/100 g tùy thuộc vào loài Ngoài hương vị thơm ngon, cá hồi còn không lo gây béo Các acid béo omega-3 trong cá hồi mang lại nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm chống lão hóa, giảm cholesterol và huyết áp, giảm nguy cơ đột quỵ, cũng như giảm đau và cứng khớp do viêm khớp.
Protein trong cá hồi hỗ trợ xây dựng và phục hồi mô cơ bắp cùng tất cả các tế bào trong cơ thể Bên cạnh đó, axit béo omega-3 có khả năng giảm thiểu tác hại từ thuốc lá.
Thịt cá hồi có màu sắc từ da cam đến đỏ, với màu sắc tự nhiên này chủ yếu do sắc tố astaxanthin và canthaxanthin trong thịt cá.
Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng của cá hồi trong 100g [26]
Thành phần dinh dưỡng Hàm lượng dinh dưỡng trong 100g cá hồi Đơn vị đo lường
Cá hồi sống tại các bờ biển Bắc Đại Tây Dương và Thái Bình Dương, với các loài di cư như Salmo salar và Oncorhynchus Chúng được biết đến là cá ngược sông để đẻ, bắt đầu cuộc sống tại nước ngọt, di cư ra biển và sau đó quay về nước ngọt để sinh sản Tuy nhiên, một số loài cá hồi lại sống trọn đời trong môi trường nước ngọt.
1.3.4 Tình hình khai thác, chế biến và xuất khẩu cá hồi trên thế giới
Sản lượng cá hồi toàn cầu thấp nhưng giá trị thương mại cao, với xuất khẩu đạt hơn 14 tỷ USD vào năm 2013 Giá trị này chủ yếu do sản xuất tập trung ở một số quốc gia như Na Uy, Chi Lê, Canada và Anh Cá hồi đánh bắt tự nhiên tại Mỹ và Nga thường được chế biến tại châu Á, chủ yếu là Trung Quốc.
Na Uy là quốc gia dẫn đầu thế giới về xuất khẩu cá hồi, với sản lượng khoảng 1 triệu tấn mỗi năm Nước này đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp cá hồi cho thị trường EU và Nga, trong đó cá hồi Na Uy xuất khẩu sang EU có giá trị thương mại cao nhất trong ngành thủy sản.
Cá hồi Chi Lê hiện đứng thứ hai trong xuất khẩu với khoảng 500.000 tấn, chủ yếu sang Mỹ, Nhật Bản và Brazil Kể từ khi Nga ban hành lệnh cấm nhập khẩu vào năm 2014, thị trường cá hồi đã có sự chuyển biến, với việc Chi Lê tăng cường xuất khẩu sang Nga.
Na Uy tăng xuất khẩu sang các thị trường khác như EU, Mỹ và một số thị trường mới nổi ở châu Á và Trung Đông [28]
Hình 1.11 Sản lượng cá hồi Đại Tây Dương năm 2005 – 2020 (dự báo) (Nguồn:
Quy trình làm giàu DHA và EPA bằng phương pháp thủy phân xúc tác bởi
Cho vào bình nón 250ml hỗn hợp 30g dầu cá và nước cất theo tỷ lệ 5:1 với 4ml đệm phosphate (pH = 7.6) Bổ sung bột enzyme lipase thô từ mủ đu đủ theo nồng độ khảo sát Thay không khí trong bình bằng khí nitrogen, sau đó lắc dịch huyền phù ở tốc độ 200 vòng/phút, 29°C trong 48 giờ Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự nhưng không có enzyme.
Sau khi kết thúc quá trình thủy phân, nâng nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng lên
90 0 C trong 15 phút để bất hoạt enzyme
Sản phẩm thu được sau phản ứng được hòa tan trong 50 ml n-hexane và chiết với 15 ml dung dịch NaOH 2N pha trong cồn, tạo ra phân đoạn không phân cực chứa acylglycerol không thủy phân và phân đoạn phân cực chứa acid béo tự do ở dạng muối K Phân đoạn không phân cực được cô quay để tách hexan, thu acylglycerol và tiếp tục thủy phân Sau đó, pha nước được acid hóa bằng 7 ml HCl 6N để thu acid béo ở pha hexan Cuối cùng, quá trình ester hóa chọn lọc với glycerol bằng enzyme Candida antarctica lipase cho sản phẩm giàu DHA và EPA.
Hỗn hợp phản ứng Sục khí N2
FFA (pha nước) pha hexan pha nước
Cô quay tách hexan acylglycerol tiếp tục đem đi thủy phân
Sản phẩm giàu DHA và EPA
-Este hóa chọn lọc với enzyme Candida antarctica lipase và glycerol
Hình 1.12 Sơ đồ quy trình làm giàu DHA và EPA [18]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
Mủ đu đủ: được thu từ một số vườn đu đủ trồng tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam
Thu nhận mủ đu đủ Điều kiện lấy mủ
Để thu hoạch enzyme có hoạt tính cao nhất, nên chọn quả xanh với vỏ mịn, trọng lượng từ 0,5-1 kg, tốt nhất là ở độ tuổi 10 tuần.
Thời gian thu hoạch mủ cao su thường bắt đầu từ sáng sớm và kết thúc vào giữa buổi sáng, khi độ ẩm không khí ở mức cao Trong điều kiện độ ẩm thấp, dòng mủ chảy chậm và đặc, gây khó khăn trong việc thu nhận Vào mùa khô, lượng mủ thu được ít, có độ đặc cao và nồng độ protein cao, trong khi vào mùa mưa, lượng mủ nhiều hơn nhưng lại loãng và nồng độ protein thấp.
− Mủ đu đủ lấy ở quả xanh còn trên cây
Hình 2.1 Vườn thu nhận mủ đu đủ
Dùng dao rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính lớn nhất, với khoảng cách giữa các lát khía từ 3-5 cm Lưu ý không rạch sâu quá 2 mm để tránh làm cho dịch nước và tinh bột từ quả trộn lẫn vào mủ, điều này sẽ ảnh hưởng đến chất lượng dịch mủ thu được.
Hứng mủ bằng lọ miệng rộng trong 4-6 phút, sau đó đậy nắp kín và bảo quản ở nơi tối và lạnh Sử dụng ngay sau khi thu nhận hoặc đóng băng ở -20°C để sử dụng sau này.
Bảo quản lạnh mủ trong phòng thí nghiệm là cần thiết để ngăn chặn mủ tiếp xúc lâu với không khí, từ đó duy trì hoạt tính của lipase có trong mủ.
− Không nên trộn mủ khô với mủ tươi vì nó làm giảm chất lượng
Khi thao tác với mủ tươi, cần tránh để nhựa tiếp xúc với da để ngăn ngừa bỏng Ngoài ra, không nên để mủ tiếp xúc với dụng cụ kim loại nặng như sắt hay đồng, vì điều này có thể làm biến màu và giảm hoạt tính của enzyme Do đó, các dụng cụ như lọ, dao, muỗng nên được làm từ thép không gỉ hoặc nhựa.
− Khi lấy mủ cần tránh không cho các chất bẩn hoặc côn trùng lẫn vào
Quá trình rút mủ từ quả thường diễn ra trong khoảng thời gian từ 4 đến 7 ngày Trong lần đầu tiên, chỉ cần thực hiện một lần rạch là đủ Tuy nhiên, ở những lần thu mủ tiếp theo, cần thực hiện từ 2 đến 3 đường rạch giữa các đường rạch đã có trước đó.
Dầu cá hồi được thu nhận từ lườn cá hồi được mua tại Công ty TNHH chế biến thực phẩm D&N, tại 01 Nguyễn Phục, Thọ Quang, Sơn Trà, Đà Nẵng
Sơ đồ bố trí thí nghiệm (hình 2.3)
Hình 2.2 Lườn cá hồi thu mua tại Công ty TNHH chế biến thực phẩm D&N
Lườn cá hồi sau khi rã đông ở nhiệt độ thường được làm sạch, cắt nhỏ và hấp cách thủy trong 20 phút để thu phần dầu tự chảy ra Sau khi hấp, lườn cá được ép bằng máy thủy lực để lấy triệt để dầu, rồi lắng hỗn hợp và gạn phần dầu ở phía trên Để tách nước lẫn trong dầu, bổ sung muối Na2SO4 khan và lọc qua bông để loại bỏ Na2SO4 Cuối cùng, dầu cá thô được bổ sung chất chống oxy hóa BHA và BHT sau khi đã tách nước hoàn toàn.
Dầu cá sạch đã qua xử lý được bảo quản trong bình kín ở nhiệt độ -4 0 C
2.1.2 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị sử dụng
Xác định các chỉ số của lipid:
- Chỉ số xà phòng hóa
Rửa và làm sạch trong nước lạnh
Hấp cách thủy lườn cá hồi (20 phút) Ép cơ học
Dầu cá lỏng Tách dầu
Dầu cá thô sạch Lắng, lọc tách nước (Na2SO4)
Hình 2.3 Sơ đồ thu nhận dầu cá hồi
Bảng 2 1 Dụng cụ, hóa chất
Hóa chất p-nitrophenyl pamitate (p-NPP), 2-propanol, triton
X-100, muối tris-base, HCl, KOH, Dietyl ete, Gum
Arabic, cồn 96%, thuốc thử phenolphtalein 1%, aceton, NaH2PO4, Na2HPO4
Phòng thí nghiệm của trường Đại học Bách khoa Đà Nẵng và trường Đại học Duy Tân sử dụng một số hóa chất được cung cấp bởi CTCP Hóa chất, Vật tư Khoa học Kỹ thuật Thành Trung tại Đà Nẵng.
Các loại cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 500ml
Các loại ống đong: 100ml, 250ml
Bình tam giác: 100ml, 250ml
Bình định mức 100ml, 1 lít Ống nghiệm, cuvet, phễu chiết, buret Đũa khuấy thủy tinh, xilanh, bông không thấm
Thiết bị phục vụ nghiên cứu
- Cân kỹ thuật điện tử
- Máy đo pH OaKaton (Châu Âu)
- Máy ly tâm EBA 20 Hettich (Đức)
- Máy đồng hóa siêu âm Vibracell (Mỹ)
- Máy sấy thăng hoa Christ (Anh)
- Và một số dụng cụ, máy móc thiết bị thường dùng trong phòng thí nghiệm
Hình 2.4 Máy lắc Hình 2.5 Máy đo pH
Hình 2.9 Cân kỹ thuật điện tử
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
2.2.1.1 Nghiên cứu chọn phương pháp sấy kết thúc cho quá trình thu enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
Sơ đồ thu nhận lipase thô bao gồm hai công đoạn sấy: đầu tiên là sấy bột mủ khô và sau đó là sấy kết thúc để thu được lipase thô đã loại bỏ các thành phần tan trong nước.
Hình 2.7 cân phân tích 4 số
Hình 2.10 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo các phương pháp sấy khác nhau ở giai đoạn kết thúc.
2.2.1.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sấy mủ để thu bột mủ khô
Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo các phương pháp sấy mủ khác nhau được mô tả ở hình 2.11
Bước 1: Mủ đu đủ sau khi lấy về được đem đi sấy bằng các phương pháp sau:
+ Phơi nắng: Mủ được đem đi phơi nắng ở nhiệt độ 30-40 o C trong 48h
+ Sấy thường: Mủ được đem đi sấy thường ở nhiệt độ 55 o C trong 24h
+ Sấy chân không: Mủ được đem đi sấy chân không ở nhiệt độ 55 o C trong 32h
+ Sấy thăng hoa: Mủ được đem đi cấp đông rồi đem đi sấy thăng hoa ở nhiệt độ -
- Ta thu được mủ khô từ các phương pháp
Bước 2: Cân mủ khô và hòa với nước cất theo tỉ lệ 1:33, khuấy trong 3 phút Ly tâm mẫu ở nhiệt độ 4°C với tốc độ 6000 vòng/phút trong 20 phút Sau khi ly tâm, loại bỏ dịch nổi và thu tủa, sau đó hòa thêm nước lạnh và ly tâm thêm 2 lần nữa.
Tủa thu được sấy bằng phương pháp sấy thăng hoa ở -40°C trong 6 giờ Nghiền mịn
Ly tâm lặp lại 3 lần
(55 o C, 36h) mẫu, ta thu được chế phẩm lipase dạng thô, bảo quản trong bình thủy tinh đậy kín ở nhiệt độ -4°C
Hình 2.11 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô theo các phương pháp sấy mủ khác nhau
Để đánh giá chất lượng của các phương pháp thu nhận enzyme lipase thô, nghiên cứu này xác định hiệu suất thu nhận và hoạt lực của chế phẩm enzyme từ bốn phương pháp khác nhau thông qua phương pháp đo quang.
2.2.2.Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi chế phẩm enzyme lipase thô
Hiệu suất thu nhận enzyme lipase thô được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng lipase thu được sau khi sấy hoặc phơi nắng và khối lượng mủ đu đủ khô.
Ly tâm lặp lại 3 lần
Hoạt độ enzyme lipase được xác định bằng phương pháp chuẩn độ, dựa trên lượng acid béo sinh ra khi lipase thủy phân p-nitrophenyl palmitate (p-NPP) thành p-Nitrophenol (p-NP) Độ hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 410 nm tương ứng với hoạt lực của enzyme lipase.
+ Dung dịch A: Cho 0,03g p-NPP vào 10ml 2-propanol, đánh siêu âm 2 phút
+ Dung dịch B: Cho 0,18g gum Arabic, 720àl triton-X 100 vào bỡnh tam giỏc 250ml cú chứa 180ml tris-HCl, hòa tan trên máy lắc
Hũa tan cơ chất chuẩn p-NP vào dung dịch gồm 4860 àl dung dịch B và 540 àl dung dịch 2-propanol sao cho có nồng độ p-NP tăng dần: 0,009; 0,01; 0,012; 0,015; 0,021;
0,03; 0,06 mM Đem đo giá trị OD ở bước sóng 410nm và xây dựng đường chuẩn Đo hoạt độ lipase:
- Dung dịch gồm 4860 àl dung dịch B và 540 àl dung dịch A được nõng lờn nhiệt độ cần khảo sát
- Cho 0,0015g enzyme vào, để phản ứng xảy ra trong vòng 5 phút
- Dừng phản ứng bằng cách lọc enzyme qua xilanh có bông không thấm
Đo độ hấp thụ ở bước sóng 410 nm được thực hiện với mẫu trắng, được chuẩn bị tương tự như mẫu khảo sát hoạt độ enzyme Sự khác biệt duy nhất là thay thế 540 µl dung dịch A bằng 540 µl 2-propanol.
Hoạt độ enzyme: một đơn vị hoạt độ được tính là lượng enzyme cần thiết để giải phúng ra 1 àmol p-nitrophenol trong một phỳt [1]
2.2.4 Phương pháp xác định thành phần của phân đoạn dầu cá hồi không thủy phân sau tác dụng của enzyme lipase từ mủ đu đủ
Sơ đồ quy trình phân đoạn dầu cá hồi sau khi thủy phân bằng enzym lipase từ mủ đu đủ được mô tả ở hình 2.12
Cho vào bình nón (dung tích 250ml) hỗn hợp gồm 5g dầu cá và nước cất với tỷ lệ
Hỗn hợp 4ml đệm phosphate (pH = 7; 0,08M) được chuẩn bị theo tỷ lệ 5:1, sau đó bổ sung 4% enzyme lipase so với lượng cơ chất Bình phản ứng được đậy kín và lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 30°C trong 24 giờ.
Sau quá trình thủy phân, sản phẩm được lọc enzyme và hòa tan trong 50ml n-hexane, sau đó chiết với 15ml dung dịch KOH 1N trong cồn Phân đoạn không phân cực chứa acylglycerol không thủy phân, trong khi phân đoạn phân cực chứa acid béo tự do dưới dạng muối Kali Phân đoạn không phân cực sẽ được phân tích bằng sắc ký khí để xác định thành phần trong mẫu.
2.2.5 Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase thô từ mủ đu đủ Để nghiên cứu ảnh hưởng tương tác giữa các yếu tố công nghệ đến hiệu suất của quá trình thủy phân, ở đây tôi chọn phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc 2 tâm
Pha nước ( Đem đi đo sắc kí để xác định thành phần
Sơ đồ quy trình phân đoạn dầu cá hồi sau khi thủy phân bằng enzym lipase từ mủ đu đủ thể hiện hai yếu tố ảnh hưởng của Box-Hunter Phương pháp này là một trong những kỹ thuật hiện đại và hiệu quả cao, được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu hóa sinh và sinh học Để tối ưu hóa quy trình thực nghiệm, cần phân tích các yếu tố đầu vào, thông số của quá trình thủy phân và hàm mục tiêu.
2.2.5.1.Tối ưu hóa yếu tố nhiệt độ và pH
- Tỉ lệ enzyme/cơ chất : 4% (w/w)
- Tỷ lệ nước/cơ chất: 5:1
- Thời gian thủy phân: 24 giờ
- Tốc độ lắc: 200 vòng/phút
2.2.5.1.2 Các yếu tố cần tối ưu
Các thông số tối ưu trong quá trình thủy phân dầu cá hồi là: Nhiệt độ thủy phân, pH thủy phân
- Nhiệt độ thủy phân (X1) nằm trong khoảng: [28 – 42 o C]
- Giá trị pH thủy phân (X3) nằm trong khoảng: [6,6 – 9,4]
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, ta lập bảng về mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm
Bảng 2 2 Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm
Giá trị pH thủy phân
Với 2 yếu tố tối ưu (k=2), số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2 3 +2*2= 8 thí nghiệm (TN) của quy hoạch cấp 2 tâm xoay và 2 thí nghiệm tại tâm phương án
Bảng 2 3 Ma trận quy hoạch thực nghiệm
Yếu tố thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên
Trong đó :T1, T2 là 2 thí nghiệm tại tâm phương án
X1, X2 là các thông số tối ưu
Hàm mục tiêu là hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
Hiệu suất của phản ứng thủy phân phải đạt tối đa: Y → max
2.2.5.2.Tối ưu hóa yếu tố lượng nước/cơ chất và nồng độ enzyme
- Nhiệt độ thủy phân: dựa vào kết quả 2.2.5.1
- pH thủy phân: dựa vào kết quả 2.2.5.1
- Thời gian thủy phân: 24 giờ
- Tốc độ lắc: 200 vòng/phút
2.2.5.2.2 Các yếu tố cần tối ưu
Các thông số tối ưu trong quá trình thủy phân dầu cá hồi là: Tỉ lệ nước/cơ chất, nồng độ enzyme
- Tỉ lệ nước/cơ chất nằm trong khoảng [2,6-5,4]
- Nồng độ enzyme nằm trong khoảng [ 0,3-1,7%]
Từ các điều kiện biên của các yếu tố quy hoạch thực nghiệm, ta lập bảng về mức và khoảng biến thiên của các yếu tố thực nghiệm
Bảng 2 4 Khoảng biến thiên các yếu tố thực nghiệm Yếu tố
Tỷ lệ enzyme/cơ chất
Tỷ lệ nước/cơ chất
Với 2 yếu tố tối ưu (k=2), số thí nghiệm phải thực hiện là N = 2 3 +2*2= 8 thí nghiệm (TN) của quy hoạch cấp 2 tâm xoay và 2 thí nghiệm tại tâm phương án
Bảng 2 5 Ma trận quy hoạch thực nghiệm
Yếu tố thí nghiệm Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên
Trong đó :T1, T2 là 2 thí nghiệm tại tâm phương án
X1, X2 là các thông số tối ưu
Hàm mục tiêu là hiệu suất của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
Hiệu suất của phản ứng thủy phân phải đạt tối đa: Y → max
2.2.6 Phương pháp xác định hiệu suất thủy phân dầu cá hồi xúc tác bởi enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
Sau khi hoàn tất quá trình thủy phân mẫu cá hồi, 15 ml hỗn hợp aceton và etanol (tỉ lệ 1:1) được sử dụng để bất hoạt enzyme Sản phẩm thu được từ phản ứng này sẽ được xác định chỉ số acid và tính toán hiệu suất của quá trình thủy phân theo công thức đã được quy định.
Chỉ số axit, được xác định từ hàm lượng axit béo tự do trong phản ứng thủy phân, phản ánh số mg dung dịch KOH 0,1N cần thiết để trung hòa lượng axit béo trong 1g dầu cá hồi.
2.2.7 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân Để khảo ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất của quá trình thủy phân Thủy phân mẫu ở các điều kiện thu được sau khi tối ưu là ở nhiệt độ 29 o C, pH=7,6, tỉ lệ nước/cơ chất là 4,36:1 và nồng độ enzyme là 1,34% Lắc với tốc độ 200 vòng/phút Tiến hành thủy phân ở các mức thời gian 24h, 48h, 72h, 96h, 120h, và 168h Từng mẫu sau khi thủy phân ở từng mốc thời gian, dừng phản ứng và tiến hành xác định hiệu suất của quá trình thủy phân bằng phương pháp xác định chỉ số acid của mẫu thu được
2.2.8 Phương pháp đánh giá chất lượng dầu cá hồi
- Xác định chỉ số acid theo TCVN về xác định chỉ số acid [11]
- Xác định chỉ số xà phòng hóa theo TCVN về xác định chỉ số xà phòng [12]
- Xác định chỉ số este: chỉ số este=chỉ số xà phòng – chỉ số axit
2.2.9 Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm Excel và Minitab, với tất cả số liệu được tính toán dựa trên kết quả trung bình cộng của ba lần thí nghiệm lặp lại.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme lipase thô
Enzyme lipase từ mủ đu đủ là “enzyme cố định tự nhiên” được bao bọc trong
“lớp vỏ nhựa cao su tự nhiên” [24] Chế phẩm lipase thô thu được từ phần không hòa tan trong nước sau ly tâm của mủ đu đủ
Quá trình thu nhận chế phẩm lipase gồm 3 bước chính:
- Hòa tan mủ đu đủ để loại bỏ các protein hòa tan trong đó có papain
- Ly tâm để thu phần rắn
Mủ đu đủ sau khi thu hoạch dễ bị hư hỏng, do đó cần được sấy khô để bảo quản tốt hơn Phần rắn thu được từ quá trình ly tâm (chế phẩm lipase thô) cũng cần được sấy khô đến độ ẩm bảo quản thích hợp Quá trình sấy khô phải giữ nguyên hoạt tính của enzyme lipase và đạt hiệu quả kinh tế cao Nghiên cứu này nhằm đánh giá hoạt lực và hiệu suất thu nhận chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ qua các phương pháp sấy khô khác nhau, từ đó xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm này.
3.1.1 Kết quả thu nhận chế phẩm lipase thô theo 2 phương pháp sấy kết thúc
Bảng 3.1 So sánh hiệu suất thu nhận và hoạt lực của chế phẩm lipase thô bằng 2 phương pháp sấy khác nhau (theo mục 2.2.1.1)
Phương pháp sấy kết thúc OD Độ ẩm
Hoạt độ (mUI/ g enzyme khô)
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng enzyme lipase có hoạt lực cao hơn rõ rệt khi sử dụng phương pháp sấy thăng hoa so với sấy thường Vì vậy, phương pháp sấy thăng hoa đã được lựa chọn cho quá trình sấy mẫu sau khi hòa tan mủ sau ly tâm.
3.1.2 Nghiên cứu lựa chọn phương pháp sấy khô mủ đu đủ tươi
Mủ đu đủ khô được sản xuất qua bốn phương pháp làm khô: phơi nắng, sấy thường, sấy chân không và sấy thăng hoa Sau khi hòa tan, mủ đu đủ khô được sấy thăng hoa để thu được lipase thô, sau đó tiến hành phân tích hoạt độ lipase.
Hình 3.1 minh họa sự khác biệt về màu sắc của các sản phẩm thu được từ các phương pháp sấy khác nhau Phơi nắng tạo ra màu sẫm nhất do mủ tiếp xúc lâu với không khí và nhiệt độ, trong khi mẫu sấy thăng hoa hầu như giữ nguyên màu trắng ban đầu của mủ.
Kết quả phân tích các chỉ tiêu hoá lý được thể hiện ở Bảng 3.2
Hình 3.1 Hình ảnh mủ đu đủ khô sau khi sấy theo các phương pháp a phơi nắng b sấy thường c sấy thăng hoa d sấy chân không
Bảng 3.2 So sánh hiệu suất thu nhận và hoạt lực của chế phẩm lipase thô của các phương pháp thu nhận khác nhau
Phương pháp OD Độ ẩm
Hoạt độ (mUI/ g enzyme khô)
Ghi chú: Các giá trị được đánh dấu bởi những chữ cái giống nhau thì khác nhau không có ý nghĩa theo phân tích thống kê ANOVA (α = 0,05) a b c d
Hình 3.2 Biểu đồ so sánh hoạt lực của chế phẩm lipase thô từ các phương pháp thu nhận khác nhau
Từ kết quả thu được ta thấy:
Hoạt lực của enzyme lipase trong phương pháp sấy thăng hoa đạt 120,349 mUI/g enzyme khô, vượt trội hơn hẳn so với ba phương pháp khác Trong khi đó, phương pháp phơi nắng gặp phải vấn đề do thời gian kéo dài và tác động của tia cực tím, dẫn đến biến tính enzyme Bên cạnh đó, quá trình phơi mẫu cũng dễ gây thất thoát và nhiễm tạp chất.
Phương pháp sấy thường có thể làm biến tính enzyme do tác động của nhiệt độ và thời gian sấy kéo dài, dẫn đến việc enzyme mất đi một phần hoạt lực trong quá trình này.
Phương pháp sấy chân không giúp bảo quản sản phẩm tốt hơn, nhưng trong quá trình sấy, dù ở điều kiện chân không, enzyme có thể bị biến tính một phần do nhiệt độ và thời gian sấy kéo dài, dẫn đến việc mất hoạt lực.
Phương pháp sấy thăng hoa ở nhiệt độ thấp và trong môi trường chân không giúp bảo toàn enzyme, giảm thiểu sự biến đổi và tổn thất trong quá trình thu nhận.
Phương pháp sấy thăng hoa cho thấy hiệu quả vượt trội trong việc thu nhận chế phẩm lipase thô từ mủ đu đủ Do đó, tôi đề xuất quy trình thu nhận như sau: b c d a.
Phơi nắng Sấy thường Sấy chân không Sấy thăng hoa
Hoạt độ (mUI/g enzyme khô
Hình 3.3 Sơ đồ thu nhận chế phẩm lipase thô
Ứng dụng chế phẩm lipase thô để thủy phân dầu cá hồi
3.2.1 Kết quả đánh giá chỉ tiêu chất lượng của dầu cá hồi
Chất lượng nguyên liệu ban đầu đóng vai trò quan trọng và ảnh hưởng lớn đến chất lượng dầu cá thu được Các chỉ tiêu chất lượng của dầu cá hồi được xác định bao gồm chỉ số acid, chỉ số xà phòng hóa và chỉ số ester, với kết quả được thể hiện trong bảng dưới đây.
Ly tâm lặp lại 3 lần
Hình 3.4 Dầu cá hồi thu được từ lườn cá hồi
Bảng 3.3 Các chỉ tiêu chất lượng của dầu cá
STT Chỉ tiêu Giá trị Đơn vị
1 Chỉ số acid 9,78 ± 0,11 mg KOH/g dầu
2 Chỉ số xà phòng hóa 211,35 ± 0,42 mg KOH/g dầu
3 Chỉ số ester 201,57 ± 0,25 mg KOH/g dầu
Kết quả thí nghiệm cho thấy chỉ số xà phòng hóa của dầu cá thu đạt mức cao, vượt trội so với một số loài cá khác như dầu cá trích (189 – 194) và dầu cá mòi.
Chỉ số xà phòng hoá, được đo bằng mg KOH cần thiết để trung hòa axit béo tự do trong 1g chất béo, cho thấy rằng dầu cá hồi có chỉ số ester cao tới 201,57, chứng tỏ phần lớn axit béo vẫn ở trạng thái liên kết và chưa bị thuỷ phân nhiều Kết quả đo chỉ số axit cũng phản ánh điều này, với chỉ số acid cho thấy lượng axit béo tự do hình thành từ quá trình thuỷ phân khi tách chiết dầu ở nhiệt độ cao Do đó, dầu thu được có thể được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2.2 Thành phần axit béo của dầu cá hồi trước và sau khi thuỷ phân bằng enzyme lipase thô từ mủ đu đủ
Enzym lipase có tính đặc hiệu đa dạng, trong đó lipase từ mủ đu đủ cho thấy tính đặc hiệu cao đối với axit béo mạch ngắn Enzym này cũng có khả năng thuỷ phân tốt đối với dầu oliu và dầu cọ, những loại dầu chứa nhiều axit béo mạch dài Tuy nhiên, hiện tại chưa có nghiên cứu nào xác định tính đặc hiệu của lipase mủ đu đủ đối với các axit béo khác nhau Do đó, nghiên cứu này sẽ so sánh thành phần axit béo trong dầu trước và sau quá trình thuỷ phân để đánh giá tính đặc hiệu của enzym.
Sau khi thủy phân mẫu dầu cá hồi theo quy trình đã mô tả, phần không thủy phân được tách ra và đo sắc ký cùng với mẫu dầu cá hồi ban đầu, cho kết quả như dưới đây.
Hình 3.5 Kết quả đo sắc ký khí của mẫu dầu cá hồi ban đầu
Hình 3.6 Sắc ký đồ của mẫu dầu cá ban đầu
Hình 3.7 Kết quả sau khi đo sắc kí khí của phân đoạn dầu không bị thủy phân
Hình 3.8 Sắc ký đồ của phân đoạn dầu không bị thuỷ phân
Dựa trên các kết quả thu được, chúng tôi đã xác định tỷ lệ phần trăm khối lượng của các axit béo dưới dạng methyl ester có trong mẫu dầu cá hồi ban đầu và trong phân đoạn dầu cá không bị thủy phân bởi lipase mủ đu đủ.
Bảng 3.4: Phần trăm axit béo có trong dầu cá hồi trước và sau khi thủy phân.
% trong phân đoạn dầu không thuỷ phân
Kí hiệu Tên thông thường
9 C20:1 cis-11-Eicosenoic acid methyl ester 0,99 2,59
10 C20:2 cis-11,14-Eicosadienoic acid methyl ester 2,52 0,95
11 C20:5 cis-5,8,11,14,17-Eicosanpentaenoic acid methyl ester (EPA) 5,1 4,97
Docosanpentaenoic acid methyl ester (DHA)
13 C20:3 cis-8,11,14-Eicosatrienoic acid methyl ester 0 0,25
14 C20:3 cis-11,14,17-Eicosatrienoic acid methyl ester 0 0,83
Kết quả ở bảng trên cho thấy tỷ lệ axit béo có trong dầu không có sự thay đổi lớn
Axit béo trong dầu chủ yếu bao gồm oleic, linoleic và palmitic Gần đây, tỷ lệ axit béo no như myristic, palmitic và stearic đã giảm nhẹ, trong khi đó, tỷ lệ các axit béo như eicosenoic, erucic và arachidonic có xu hướng tăng nhẹ.
Trong nghiên cứu, hai axit béo quan trọng nhất là DHA và EPA cho thấy sự thay đổi khác nhau; trong khi EPA ít thay đổi, DHA có sự tăng nhẹ Tổng phần trăm của hai axit béo này trong dầu ban đầu là 10,8% và sau khi thuỷ phân, con số này tăng lên 12,7%.
Enzyme lipase từ mủ đu đủ không có tính đặc hiệu rõ rệt đối với các axit béo Nó cho thấy sự ưu tiên trong việc thuỷ phân EPA và một số axit béo không no khác, trong khi các axit béo no ít được ưu tiên hơn trong quá trình thuỷ phân.
3.2.3 Tối ưu hóa quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzym lipase từ mủ đu đủ
3.2.3.1 Tối ưu hóa nhiệt độ và pH của quá trình thủy phân dầu cá hồi bằng enzyme lipase từ mủ đu đủ
Dựa trên các nghiên cứu trước, chúng tôi đã chọn khảo sát nhiệt độ từ 28-42 oC và pH trong khoảng 6,6 đến 9,4 Kết quả khảo sát được thu thập bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm xoay Box-Hunter, như đã trình bày ở mục 2.2.5.1, và được thể hiện trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Hiệu suất của phản ứng thủy phân qua các thí nghiệm
Yếu tố thí nghiệm trong hệ tọa độ không thứ nguyên
Bảng 3.6 Giá trị các hệ số b trong phương trình hồi quy, kiểm định T và xác suất p tương ứng
Hệ số Giá trị Sai số chuẩn Kiểm định T Xác suất p bo -221,46 1,2207 30,59 0,000 * b1 3,84 0,8589 -4,732 0,009 * b2 53,92 0,8589 -5,656 0,005 * b12 -0,16 1,6921 -1,383 0,416 b11 -0,06 1,6032 -3,967 0,239 b22 - 3,24 1,6032 -0,906 0,017 *
( * ) các nhân tố có ý nghĩa (p < 0,05)
Sử dụng phần mềm Minitab 16.0, chúng tôi đã xử lý các số liệu đo được của hàm Y để kiểm tra tính có nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy theo chuẩn Student Mức độ tin cậy của từng hệ số được đánh giá qua giá trị p với mức độ tin cậy 95%, và kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Các hệ số được xác định lần lượt là: b0 =-221,46; b1 = 3,84; b2 = 53,92; b12 = -0,16; b11= -0,06; b22 = -3,24
Bảng 3.6 cho thấy chỉ có các hệ số b0, b1, b2, b22 là có ý nghĩa về mặt thống kê
(p < 0,05) Các hệ số còn lại b11, b12 không tác động đến giá trị của hàm mục tiêu
(p>0,05) Loại bỏ các hệ số không có nghĩa thì thu được phương trình hồi quy thể hiện ảnh hưởng của các yếu tố đến mục tiêu như sau:
Để đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy, cần xem xét xác suất p thu được từ phép kiểm định Test of Lack of Fit, nhằm xác định mức độ phù hợp của mô hình với dữ liệu thí nghiệm.
Kết quả thu được với p=0,235 lớn hơn mức ý nghĩa 0,05 cho thấy phương trình hồi quy phù hợp với thực tế, khẳng định tính chính xác của mô hình với ý nghĩa thống kê cao.
Hệ số tương quan R² = 94,67% cho thấy mô hình hồi quy có tính chặt chẽ cao, khẳng định độ tin cậy của nó Vì vậy, phương trình hồi quy này có thể được áp dụng để xác định điểm tối ưu.
Biểu đồ đường mức và biểu đồ bề mặt của phương trình hồi quy được thể hiện như hình 3.9 và 3.10.
Hình 3.9 Biểu đồ đường mức (contour plot) biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân
Hình 3.10 Biểu đồ bề mặt (surface plot) biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ, pH đến hiệu suất thủy phân
Biểu đồ đường mức chỉ ra rằng hiệu suất thủy phân cao nhất đạt được trong khoảng pH từ 6,6 đến 8 và nhiệt độ từ 28 đến 35 độ C Để xác định điểm tối ưu một cách chính xác, chúng tôi đã sử dụng công cụ tìm điểm tối ưu của phần mềm Minitab, và kết quả thu được như sau.
Hình 3.11 Biểu thị các điểm tối ưu sau khi phân tích.
Sau khi tối ưu hóa điều kiện thủy phân ta thu được nhiệt độ tối ưu là 29 o C và pH tối ưu là 7,6