Luận văn Thạc sĩ Công nghệ sinh học: Nghiên cứu thu nhận levan từ (Bacillus subtilis) và bước đầu ứng dụng sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1-14 ngày tuổi được thực hiện với mục tiêu nhằm bổ sung dinh dưỡng một cách hợp lý cho sự phát triển của gà và giúp cân bằng được dinh dưỡng, tăng sức đề kháng, tăng lợi khuẩn cho đường ruột cũng như cân đối về ngoại hình phục vụ cho mục đích sử dụng. Mời các bạn cùng tham khảo.
TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
Tổng quan về levan
Levan là một trong hai loại fructans, loại carbohydrate thường có trong thực vật, tảo và vi khuẩn Fructans gồm hai loại chính là levan và inulins, được phân biệt bởi các loại liên kết Trong khi các đơn phân của levan liên kết với nhau bằng liên kết β(2-6), thì inulins lại sử dụng liên kết β(2-1) Theo phân loại, levan thuộc nhóm thứ hai của fructans (Han và cs, 1990).
Levan is a polymer of fructose formed by β-(2-6) fructofuranosidic linkages (Ki-Hyo et al., 2001; Mardo et al., 2014) Microorganisms capable of synthesizing levan include Lactobacillus gasseri, B circulans, E amylovora, and Seraria sp.
Acetobacter xylinum NCI 1005, Zymomonas mobilis, and Bacillus subtilis are known for their ability to synthesize levan, an extracellular polysaccharide primarily derived from sucrose These bacteria convert sucrose into levan through the production of levansucrase, showcasing their significant role in polysaccharide synthesis (Anwar et al., 2010; Devi and Alamu, 2013; Oliveira et al., 2007; Mardo et al., 2014).
Năm 2012, nghiên cứu của Esawy và cộng sự chỉ ra rằng vi khuẩn Bacillus spp được chiết xuất từ mật ong có khả năng tổng hợp levan Mặc dù cấu trúc của levan thường có mạch thẳng với liên kết (2-6), nhiều loại levan do vi khuẩn tổng hợp lại có cấu trúc phân nhánh với liên kết (2-1) Các mạch nhỏ thường ngắn và chỉ chứa một đơn phân fructose Fructans ngắn nhất là 6-ketose, đây cũng là fructan ngắn nhất trong các loại levan Levan là một trong số ít polyme tự nhiên của carbohydrate tồn tại dưới dạng furanose.
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của levan
Levan được sản xuất từ các nguồn sinh vật khác nhau có sự khác biệt về khối lượng phân tử và mức độ phân nhánh Levan từ vi khuẩn thường có khối lượng phân tử lớn hơn, khoảng 2 - 100 kDa, so với levan từ thực vật chỉ đạt khoảng 2 - 33 kDa Cụ thể, levan được tổng hợp từ vi khuẩn Zymomonas mobilis có khối lượng phân tử lên tới 107 Da, tương đương với 60,000 đơn phân fructose Ngoài ra, levan từ vi khuẩn B subtilis Natto có hai loại khối lượng phân tử khác nhau: một loại cao 1794 kDa và một loại thấp 11 kDa Sự khác biệt trong khối lượng phân tử của levan là cần thiết cho các ứng dụng cụ thể.
Trong đó chủng B subtilis có khả năng sinh tổng hợp levan cao hơn cả với
40 g/l trên môi trường có chứa 200 g/l sucrose (Shih và cs 2005)
Nghiên cứu của Jothi và cộng sự (2019) chỉ ra rằng levan được tổng hợp bởi vi khuẩn B subtilis MTCC 441 khi sử dụng sucrose làm nguồn carbon Chiết xuất nấm men (YE) được xác định là nguồn nitơ tối ưu Điều kiện tối ưu để tổng hợp levan bao gồm nồng độ sucrose 100 g/l, pH 7, nồng độ YE 2 g/l và tốc độ lắc thích hợp.
150 vòng/phút là giá trị tối ưu cho sản xuất levan Kết quả cho thấy năng suất levan thu được tương ứng là 0,395 g/g sucrose
Nghiên cứu cho thấy levan có khả năng chống ung thư, với khả năng này được xác nhận qua các dòng tế bào ung thư khác nhau (Calazans cs, 2000; Yoo cs, 2004) Levan được sản xuất từ các vi khuẩn như Microbacterium laevaniformans, Rahnella aquatilis và Zymomonas mobilis, và có khả năng chống lại tám dòng tế bào ung thư (El-Safty cs, 2012) Ngoài ra, levan còn được nghiên cứu vì vai trò trong điều trị sâu răng (Aridson cs, 2006) và giảm cholesterol (Yamamoto cs, 1999), cũng như điều hòa hoạt động miễn dịch (Calazans cs, 1997; Yamamoto cs, 1999) Levan cũng có thể được sử dụng để sản xuất DFA IV, một chất tạo ngọt với độ ngọt chỉ bằng một nửa so với sucrose, rất ổn định và phù hợp cho bệnh nhân tiểu đường (Jaecho cs).
Trong vài thập kỷ qua, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy các chủng vi khuẩn nhằm nâng cao khả năng tổng hợp levan Oliveira và cộng sự (2007) đã tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy Zymomonas mobilis bằng phương pháp đáp ứng bề mặt, đạt được hàm lượng levan cao nhất là 21,68 g/l Tương tự, Santos và cộng sự (2013) cũng áp dụng phương pháp này để tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy B.subtilis Natto, đạt hàm lượng levan lên tới 111,6 g/l với nồng độ sucrose 400 g/l và thời gian nuôi 16 giờ.
Levan hiện đang thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học và nhà sản xuất nhờ vào các đặc tính vượt trội như khả năng hòa tan tốt trong dầu và nước, độ kết dính mạnh, tính tương thích sinh học cao, khả năng chống ung thư và khả năng tạo màng (Santos và cs, 2013) Chính vì vậy, levan đã được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm và dược phẩm (Jaecho và cs, 2001; Santos và cs, 2013).
Levan là một hợp chất được ứng dụng rộng rãi trong chăm sóc cá nhân, y tế, công nghệ nano, nuôi trồng thủy sản và thực phẩm Các nhà sản xuất lớn như Natural Polymers Inc (Hoa Kỳ), Real Biotech Co., Ltd (Hàn Quốc) và Advance Co., Ltd (Nhật Bản) đang sản xuất levan ở quy mô thương mại Hai sản phẩm tiêu biểu trên thị trường dựa vào levan là Proteolea® và Slimexir®.
Hình 1.2 Sản phẩm dưỡng da mặt với Proteolea®
Hình 1.3 Sản phẩm dưỡng thể với Slimexir®
Công ty RealBiotech (www.realbio.com) đã cho ra mắt một số sản phẩm thực phẩm chức năng tại các hệ thống siêu thị ở Hàn Quốc và Nhật Bản.
Hình 1.4 Các sản phẩm levan trên thị trường (www.realbio.com)
Levan là bột tinh thể màu trắng với tính chất kết dính mạnh mẽ, có các hạt hình cầu có đường kính từ 75 đến 200 nm Thành phần và tính chất của levan phụ thuộc vào môi trường nuôi cấy của vi sinh vật tổng hợp loại bột này (Khadiga và cs, 2015).
Levan, khác với các polysaccharides thường được sử dụng làm chất nhũ hóa và chất làm đặc, không trương lên trong nước và có độ nhớt thấp chỉ 0,38 dl/gm ở nhiệt độ 25°C (In Young Bae và cs, 2007).
Levan có khả năng tan trong nước nóng cao, nhưng gần như không hòa tan trong nước ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ dưới 0,5% So với inulin, levan có cấu trúc mạch nhỏ hơn và liên kết β(2-6) mạnh mẽ hơn so với liên kết β(2-1), điều này có thể là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng hòa tan của nó (Justin và cs, 2007).
Levan là một homopolymer của fructose không hòa tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ như (Ashton và cs, 2012):
- Methyl caprylate/caprate, methylpalmitate/ oleate;
- Propylene carbonate, methoxypolyethylene glycol, polyethylene glycol;
Levan không bị phân cắt và thủy phân bởi enzyme invertase và amylase, nhưng dễ dàng bị thủy phân bởi acid, dẫn đến sự hình thành fructose Nghiên cứu của Kang và Cottrell (1979) chỉ ra rằng levan có thể bị thủy phân hoàn toàn thành fructose trong dung dịch HCl 1N ở nhiệt độ 70 độ C Ngoài ra, levan cũng có thể bị thủy phân bởi axit oxalic 0,5% theo nghiên cứu của Shin và cộng sự (2005).
Thức ăn chăn nuôi gà cảnh
1.2.1 Giới thiệu về một số giống gà cảnh
Gà rừng, bao gồm hai giống chính là gà lôi và gà đỏ, hiện đang trở thành loài vật nuôi được ưa chuộng trong các hội sinh vật cảnh tại Việt Nam Tuy nhiên, giống gà này khó nuôi và khó tìm cá thể thuần chủng, do đó, nhiều người sẵn sàng chi một số tiền lớn để sở hữu chúng.
Hình 1.5 Gà rừng đỏ tại miền Trung và Tây Nguyên
Gà Quý Phi, đúng như tên gọi, là giống gà “quý phái” và mạnh mẽ, nổi bật với chiếc mào đặc trưng giống như quả Phật thủ, điều mà không giống gà nào có được.
Gà Quý phi nổi bật với bộ lông độc đáo hai màu đen và trắng, luôn bồng bềnh như chiếc nón, cùng với đôi mắt đỏ đặc trưng thu hút sự chú ý.
Hình 1.6 Giống gà Quý phi
Gà vảy cá, hay còn gọi là gà Sebright, đang trở thành một thú nuôi độc đáo được yêu thích trong cộng đồng yêu sinh vật cảnh tại Việt Nam.
Hình 1.7 Giống gà lai cá
Gà lai cá nổi bật với những chiếc lông vũ tròn trịa viền đen, mang hình dáng giống vảy cá, tạo nên vẻ quyến rũ đặc trưng cho loài này.
Gà vảy cá sở hữu một lịch sử tự hào, được phát triển từ thế kỷ 19 thông qua chương trình nhân giống chọn lọc của nhà nghiên cứu người Anh John Saunders Sebright (1767 - 1846).
Gà lông xù, hay còn gọi là gà Silkie, là một giống gà đặc biệt với bộ lông xù đáng yêu và nhiều màu sắc như vàng, trắng, đen Trọng lượng của mỗi con gà trưởng thành dao động từ 1,5 đến 2 kg, và chúng có thể sống từ 7 đến 8 năm, thậm chí lên đến 9 năm nếu được chăm sóc tốt.
Hình 1.8 Giống gà lông xù
Gà lông xù với bộ lông tơ mịn và kích thước nhỏ không thể bay nhảy như các giống gà thông thường Chúng chỉ đẻ từ 7 đến 10 quả trứng mỗi chu kỳ, dẫn đến việc loại gà này trở nên hiếm hoi trên thị trường sinh vật cảnh Việt Nam.
Gà Serama, được biết đến là giống gà nhẹ nhất thế giới, có trọng lượng chỉ từ 300 - 500g khi trưởng thành Mặc dù nhỏ bé, giống gà này lại khó nuôi và cần nhiều công sức để luyện tập nhằm đạt được dáng đứng chuẩn, vì vậy nó thu hút sự quan tâm của nhiều hội sinh vật cảnh trên toàn cầu.
1.2.2 Quy trình sản xuất thức ăn chăn nuôi gà giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
Mỗi loại gà có nhu cầu dinh dưỡng khác nhau và cần các loại cám riêng biệt Tuy nhiên, gà con từ 1-14 ngày tuổi có nhu cầu dinh dưỡng tương tự nhau Dưới đây là quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà.
Hình 1.10 Quy trình công nghệ sản xuất thức ăn chăn nuôi gà
Thuyết minh quy tình công nghệ
- Nguyên liệu nhà máy sử sựng trong sản xuất thức ăn chăn nuôi bao gồm: + Nguyên liệu thô: Ngô, khô đậu tương, sắn lát, bã bia, bã cải;
+ Nguyên liệu mịn: Cám gạo, bột cá, bột thịt, bột lông vũ, nguyên liệu khóang;
+ Nguyên liệu lỏng: Rỉ mật, dầu cá, dầu cám gạo
Dây chuyền tiếp nhận và xử lý nguyên liệu là bước đầu tiên trong quy trình sản xuất, nhằm tiếp nhận, dự trữ và bảo quản nguyên liệu cho nhà máy Sau đó, nguyên liệu sẽ được xử lý sơ bộ và làm sạch để sẵn sàng cho các công đoạn tiếp theo.
+ Làm sạch: Nguyên liệu được loại bỏ các tạp chất bằng kích thước lưới sàng 5mm, sử dụng hệ thống nam châm để loại bỏ kim loại
Nghiền nguyên liệu nhằm đạt kích thước yêu cầu, tăng tính đồng đều giữa các thành phần, phân bố dinh dưỡng đồng nhất và cải thiện khả năng tiêu hóa Nguyên liệu được nghiền mịn sẽ hỗ trợ quá trình tạo viên, giúp viên thức ăn có bề mặt bóng và dễ liên kết với các thành phần khác.
Máy trộn đóng vai trò quan trọng trong việc đảo trộn nguyên liệu, giúp tăng tính đồng đều cho sản phẩm Quá trình trộn được chia thành hai giai đoạn: trộn khô (15 giây) và trộn ướt (15 giây) Ngoài việc cải thiện các phản ứng hóa học và sinh học trong chế biến thức ăn, máy trộn còn tăng cường quá trình trao đổi nhiệt khi đun nóng hoặc làm lạnh Trong quá trình này, các chất phụ gia, chất lỏng và khoáng được bổ sung, trong đó rỉ mật được phun qua máy phun mật trước khi thêm vào cám, giúp tăng độ kết dính của viên cám và làm cho thức ăn trở nên hấp dẫn hơn cho vật nuôi.
Máy ép viên hoạt động bằng cách đưa nguyên liệu đã được phối trộn vào máy, nơi nhiệt độ được cấp khoảng 70 - 80 độ C tùy thuộc vào loại cám Quá trình này diễn ra trong một khoảng thời gian nhất định để tạo ra viên thức ăn chất lượng.
Trong 30 giây, viên cám được làm chín đều và định hình qua quả lô ép, sau đó được cắt bằng dao ép để đạt độ dài phù hợp Đặc biệt, độ ẩm của cám được kiểm soát và duy trì dưới 12%.
MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu nghiên cứu
Xác định được các điều kiện nuôi cấy tối ưu chủng B subtilis sinh tổng hợp levan cao
Nghiên cứu được điều kiện thu nhận và tinh sạch levan để ứng dụng trong lĩnh vực sản xuất thức ăn chăn nuôi gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi.
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc phân tích ảnh hưởng của các yếu tố môi trường và điều kiện nuôi cấy đến quá trình sinh tổng hợp và thu nhận levan từ vi khuẩn Bacillus subtilis Các yếu tố được xem xét bao gồm nguồn carbon, nhiệt độ, pH, tốc độ lắc và thời gian nuôi cấy, nhằm tối ưu hóa quy trình sản xuất levan.
- Tối ưu hóa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy cho chủng B subtilis sinh tổng hợp levan cao
- Nghiên cứu điều kiện thu nhận levan
- Bước đầu ứng dụng levan trong sản xuất thức ăn chăn nuôi cho gà cảnh giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi.
Vật liệu nghiên cứu
Chủng B subtilis do Viện Công nghệ sinh học lâm nghiệp - Đại học Lâm nghiệp cung cấp
- Môi trường hoạt hóa B subtilis (môi trường L1): Nước chiết thịt bò 3 g/l, peptone 5 g/l, pH 7
- Môi trường nhân giống B subtilis (môi trường L2): Nước chiết thịt bò 3 g/l, peptone 1,5 g/l, NaCl 5 g/l, nước cất, pH 7
- Môi trường sinh tổng hơp levan (môi trường L3): Sucrose 100 g/l, cao nấm men 2 g/l, (NH4)2SO4 3 g/l, KH2PO4 1 g/l, MgSO4 0,6 g/l, MnSO4 0,2 g/l; pH 7
- Môi trường xác định mật độ vi sinh vật (TGA): Trypton 5 g/l, glucose 4 g/l, cao nấm men 2,5 g/l, agar 18 g/l, pH 7
- NaOH 1N, ethanol 96 o (ethanol thực phẩm nhà máy đường Tuy Hòa), HCl 1%
- Các loại thuốc nhuộm như: thuốc tím kết tinh, lugon và fuchsin
- Các hợp chất tinh khiết được sử dụng trong nghiên cứu
2.3.4 Thiết bị và dụng cụ
Phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Công nghệ Vi sinh - Hóa sinh, Viện CNSH Lâm nghiệp trường Đại học Lâm nghiệp được trang bị nhiều thiết bị và dụng cụ cần thiết cho nghiên cứu, bao gồm bình tam giác với thể tích 50 ml và 250 ml, đĩa petri, ống nghiệm, ống đong, cốc đong, cùng với Pipetman 100 µl, 200 µl và 1000 µl Ngoài ra, phòng thí nghiệm còn có que cấy, que trang, nồi hấp tiệt trùng, máy đo pH, cân điện tử, tủ cấy, tủ lạnh, lò vi sóng, máy li tâm vi sinh và tủ ấm nuôi vi sinh vật, tủ lắc, tạo điều kiện thuận lợi cho các hoạt động nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực vi sinh và hóa sinh.
Máy quang phổ cận hồng ngoại DS 2500F, Kjeltec 8000, và các quy trình chính thức AOCS Am5-04, AOAC Ba-6a 05, cùng với máy đo độ cứng Kahl, độ bền và độ bụi, đều được sử dụng tại Phòng Quản lý chất lượng của công ty Cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam, chi nhánh Xuân Mai, Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình sinh tổng hợp levan (Jothi và cs, 2019)
Phương pháp nghiên cứu theo Jothi và cộng sự (2019) nhằm xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan Chủng B subtilis được hoạt hóa trong môi trường L1 qua đêm, sau đó được nhân giống trong môi trường L2 ở nhiệt độ 37°C trong 48 giờ với tốc độ lắc 120 vòng/phút Sau khi hoạt hóa, vi khuẩn được đưa vào bình 250 ml chứa 50 ml môi trường sinh tổng hợp levan để tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu.
2.4.1.1 Ảnh hưởng của nồng độ sucrose
Vi khuẩn sẽ được nuôi trong môi trường chứa các nồng độ đường sucrose lần lượt là 20, 40, 60, 80 và 100 g/l Quá trình nuôi được thực hiện với tốc độ lắc 150 vòng/phút, ở nhiệt độ 37°C và pH 7 trong 24 giờ, với nồng độ nito là 1,5 g/l Hàm lượng levan thu được sẽ được xác định cho từng nồng độ sucrose.
Tiến hành nuôi cấy B subtilis trong môi trường sinh tổng hợp levan với nguồn sucrose có nồng độ thích hợp, đồng thời điều chỉnh pH ban đầu để đạt hiệu quả tối ưu trong quá trình phát triển.
4, 5, 6, 7 và 8 trên máy lắc 150 vòng/phút ở 37 o C trong 24 giờ, nồng độ cấp nito 1,5g/l; môi trường YE Xác định hàm lượng levan ở các nồng độ pH trong thí nghiệm
2.4.1.3 Ảnh hưởng của nguồn nito
Nuôi vi khuẩn trong môi trường nuôi cấy sinh tổng hợp levan với sucrose và pH thích hợp Các môi trường thử nghiệm bao gồm YE (cao nấm men), BE (cao thịt bò), và ME (cao thịt lợn) Tất cả các thông số được duy trì ở tốc độ lắc 150 vòng/phút, nhiệt độ 37°C trong 24 giờ, với nồng độ nito 1,5 g/l, sau đó xác định hàm lượng levan thu được từ các nguồn nito khác nhau.
2.4.1.4 Ảnh hưởng của nồng độ cấp nito
Sau khi xác định các điều kiện tối ưu như nồng độ sucrose, pH và nguồn nito, chủng vi khuẩn được nuôi cấy với các nồng độ nito khác nhau: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0 g/l Các thông số khác được giữ cố định, bao gồm tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ Mục tiêu của thí nghiệm là xác định hàm lượng levan thu được từ các nồng độ nito khác nhau.
2.4.1.5 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống cấp
Sau khi xác định các điều kiện tối ưu như nồng độ sucrose, pH, nguồn nito và nồng độ nito, chủng vi khuẩn được thử nghiệm ở các tỷ lệ giống cấp khác nhau: 2,5%; 5,0%; 7,5%; 10,0% và 12,5% Các yếu tố khác được giữ cố định với tốc độ lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ Kết quả thí nghiệm sẽ được bố trí và tính toán để xác định hàm lượng levan thu được.
2.4.1.6 Ảnh hưởng của tốc độ lắc
Sau khi xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp, chủng B subtilis được nuôi cấy và lắc với các tốc độ 100, 125, 150 và 175 vòng/phút Các thông số khác được duy trì ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ, và hàm lượng levan được xác định theo từng tốc độ lắc khác nhau.
2.4.2 Phương pháp tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp levan theo quy hoạch bậc hai Box-Behnken (Bruna và cs, 2013)
Quá trình tối ưu hóa các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp levan được thực hiện theo thiết kế Box-Behnken, sử dụng phần mềm Design-Expert từ State - Ease, Inc, Minneapolis, Mỹ.
Bước 1 Xây dựng mô hình toán học dạng y = y0 + b1X1 + b11X1 2 + b2X2 + b22X2 2 + b3X3 + b33X3 2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3
Trong quá trình nghiên cứu, việc xác định các biến ảnh hưởng, mức độ và khoảng thay đổi của từng biến là rất quan trọng Điều này được thực hiện thông qua khảo sát thực nghiệm và tham khảo các tài liệu đã công bố Các biến số cùng khoảng chạy của chúng được tổng hợp và trình bày rõ ràng trong bảng 2.1.
Bảng 2.1 Bảng xác định các biến ảnh hưởng, các mức và khoảng thay đổi từng biến số
Biến số Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
X3 Tốc độ lắc vòng/phút 100 150
Lập ma trận thực nghiệm theo phương pháp Box-Behnken bao gồm 17 thí nghiệm, trong đó các yếu tố được kết hợp với 3 mức độ: +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình) Đặc biệt, trong ma trận này có 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm, khi tất cả các yếu tố đều ở mức 0.
Quá trình tổng hợp levan được thực hiện thông qua phương pháp nuôi cấy lỏng, trong đó sử dụng bình tam giác 250 ml chứa 100 ml môi trường nuôi cấy Sau 24 giờ nuôi, levan sẽ được kết tủa và thu nhận.
Bước 2 Cực đại hóa hàm mục tiêu theo phương pháp hàm kì vọng
Tìm cực trị của phương trình hồi quy y = b0 + b1X1 +b11X1 2 + b2X2 + b22X2 2
+ b3X3 + b33X3 2 + b12X1X2 + b13X1X3 + b23X2X3 bằng phần mềm Design-Expert cho kết quả giá trị cực trị tại X1, X2, X3 tương ứng với pH, nồng độ nito và tốc độ lắc
Do vậy, hàm lượng levan đạt cao nhất tại các giá trị cực trị X1, X2, X3 đó
2.4.3 Phương pháp nghiên cứu điều kiện thu nhận levan
Levan từ vi khuẩn B subtilis được thu nhận thông qua phương pháp kết tủa bằng các dung môi như ethanol 96%, iso propanol và aceton Quá trình kết tủa được thực hiện với tỉ lệ thể tích dịch chiết levan và dung môi là 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, ở các nhiệt độ -5°C, 0°C và 32°C trong khoảng thời gian 1 giờ, 3 giờ và 5 giờ Sau khi lọc, cặn levan thu được sẽ được xác định hàm lượng.
* Phương pháp xác định hàm lượng levan
Levan được thu nhận sau khi kết tủa cồn và được thủy phân bằng HCl 1M ở nhiệt độ 100°C trong 1 giờ Dịch thủy phân sau đó được trung hòa bằng NaOH 2M, và hàm lượng fructose được xác định thông qua phản ứng tạo màu với DNS, được đo ở bước sóng 540 nm (Berte và cs, 2013).
Do levan là polymer của fructose nên hàm lượng levan được tính theo công thức: L = F × 0,9 (Szwengiel và cs, 2004)
0,9: Là hệ số chuyển đổi
2.4.4 Phương pháp xây dựng quy trình sản xuất cám gà cảnh bổ sung levan (giai đoạn 1-14 ngày tuổi)
2.4.4.1 Tỷ lệ levan phối trộn
Sử dụng công thức cám cho gà con từ 1 đến 14 ngày tuổi theo bảng 2.2 của Công ty Cổ phần chăn nuôi C.P Việt Nam, sau đó bổ sung levan với tỷ lệ 0,1; 0,2 và 0,3% vào thức ăn Việc này nhằm lựa chọn chế độ dinh dưỡng phù hợp cho gà con Thí nghiệm được thực hiện theo bảng 2.3.
Bảng 2.2 Thành phần nguyên liệu trong công thức cám gà con giai đoạn 1 - 14 ngày tuổi
Loại nguyên liệu Tỷ lệ (%)
Bảng 2.3 Thành phần dinh dưỡng sau khi bổ sung levan theo các tỷ lệ
Bổ sung 0,1% levan (Công thức 1)
Bổ sung 0,2% levan (Công thức 2)
Bổ sung 0,3% levan (Công thức 3)
2.4.4.2 Phương pháp xác định nhiệt độ ép viên
Sau khi lựa chọn công thức cám tối ưu, quá trình phối trộn và ép viên sẽ được tiến hành Nhiệt độ máy ép viên được thiết lập ở ba mức: 70°C, 80°C và 90°C, nhằm xác định hàm lượng levan còn lại tương ứng với từng mức nhiệt độ, thông qua việc đo hàm lượng đường tổng số và các chỉ tiêu ảnh hưởng đến chất lượng cảm quan của cám thành phẩm Các máy đo độ bền, độ cứng và độ bụi sẽ được sử dụng tại phòng kiểm tra chất lượng, cùng với phương pháp xác định hàm lượng đường tổng số trong mẫu.
2.4.4.3 Bố trí thí nghiệm và thể hiện kết quả được thực hiện trong bảng 2.4
Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến chất lượng cám viên
Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức 1
Hàm lượng đường tổng số (%) Độ ẩm (%)
Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức 1
Lysin (%) Độ ẩm (%) Độ bền (%) Độ cứng (kg) Độ bụi (%)
Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ ép viên đến các chỉ tiêu vi sinh
Chỉ tiêu Công thức đối chứng Công thức 1