Vật liệu và phương pháp
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành từ tháng 5/2018 đến tháng 4/2019 tại bộ môn
Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp.
Vật liệu nghiên cứu
Cơ sở dữ liệu trình tự genome của 17 giống lúa kháng đạo ôn bản địa Việt Nam đã được giải trình tự bởi Trung tâm Tài nguyên Thực vật, thuộc đề tài "Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam" của Viện Di truyền Nông nghiệp.
Bảng 3.1 Bảng vật liệu nghiên cứu
3.2.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Máy chủ sever, máy li tâm Eppendorf, máy đo pH HANNA, máy nhân bản gen (PCR), bộ máy điện di đứng và ngang CBS, bộ chụp ảnh gel, tủ sấy Memmert, cân phân tích, nồi hấp, tủ bảo quản mẫu 4°C, pipetman và ống Eppendorf là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm, hỗ trợ nghiên cứu và phân tích chính xác.
TT Tên giống TT Tên giống
1 Khấu điển lư 10 Lúa gốc đỏ
2 Thơm Lài 11 Tám xoan Hải Hậu
5 Tốc lùn 14 Tám xoan Bắc Ninh
6 Ble te lo 15 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2
7 Khấu mặc buộc 16 Nếp lùn
8 Nếp mèo nương 17 Nàng quớt biển
3.2.2.2 Hóa chất a Hoá chất tách chiết ADN
DNA extraction chemicals include Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, and ethanol, sourced from reputable brands such as Sigma, Merck, Prolabo, ICN, and Labscan.
-Đệm tách chiết ADN tổng số (đệm CTAB):
EDTA 0,5M, pH 8,0 b Hoá chất dùng để chạy phản ứng PCR
-Đệm PCR 1x (10 mM Tris-HCl pH8, 1,5 mM MgCl2, 5 mM KCl) hoặc đệm PCR 1x của Quiagen, Invitrogen
-dNTPs (dATP, dGTP, dCT, dTTP) của Fermentas, Invitrogen
-Mồi, Marker 1 kb, Marker GeneRuler TM ADN Ladder Ultra Low của hãng Fermentas, Invitrogen
-Taq polymerase của Fermentas, Invitrogen c Hoá chất chạy điện di Điện di gel polyacrylamide gồm các hóa chất: acrylamide, APS, Temed, chất nhuộm Bromophenol blue, Ethidium bromide.
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp tầm soát gen Pit và Pi21 dựa trên trình tự genome
Lắp ráp và gọi SNP sử dụng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 (SoftGenetics LLC, State College, PA, USA) (Biswas et al., 2015) https://softgenetics.com
Phần mềm NextGENe.php và MEGA 6.0 cho Windows được sử dụng để phân tích di truyền tiến hóa của 17 giống lúa, giúp thực hiện việc dóng hàng và cột hiệu quả (http://www.megasoftware.net/mega.php) (Zheng, S et al., 2017; Tamura et al., 2013; Huu Trung Khuat và cs., 2017).
Phương pháp tầm soát các gen được thực hiện theo 8 bước sau:
Bước 1: Khởi động chương trình NextGENe ver 2.4.2.3 chọn phương pháp đọc trình tự Illumila với ứng dụng SNP/Indel Discovery
Bước 2: Đưa đữ liệu đầu vào bằng các file đọc trình tự ở dạng FastQ vào mục Sample files
Bước 3: Đưa dữ liệu tham chiếu vào mục Reference files dưới dạng Fasta
Bước 4: Lưu lại đầu ra cho file Output với thư mục khác và đuôi *pjt
Sau khi hoàn tất các bước từ 1 đến 4, chúng ta tiến hành phân tích mẫu đọc trình tự với gene tham chiếu bằng cách nhấn vào nút Run NextGENe.
Bước 6: Kết quả thu được được thể hiện thông qua NextGENe Viewer
Sau khi sử dụng chương trình NextGENe ver 2.4.2.3, chúng ta thu được các trình tự tương đồng của mẫu cần so sánh với gene tham chiếu Tiếp theo, sử dụng lệnh Export để xuất ra file fasta cho mẫu cần so sánh, ứng dụng phần mềm này một cách hiệu quả.
Mega ver 6.06 (Tamura et al., 2013) để dóng hàng dóng cột các giống cần so sánh với gen tham chiếu
Bước 8: Kết quả dóng hàng, dóng cột các giống so sánh với gen tham chiếu, và xác định được các SNP và Indel
Hình 3.1 Phương pháp tầm soát các gen Pit và Pi21 của 17 giống lúa đã giải trình tự bằng phần mềm NextGENe_V2.4.2.3 và MEGA 6.0
3.3.2 Phương pháp thiết kế mồi gen Pit và Pi21 kiểm tra gen kháng Pit , Pi21
Cặp mồi đặc hiệu được thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0, được phát hành vào ngày 15/12/2008 bởi hãng Invirogen, Carlsbad (Jia et al., 2002) Phần mềm này cho phép phân tích trình tự đã chọn và thiết kế mồi PCR dựa trên các thông số như nhiệt độ nóng chảy, %GC và chiều dài đoạn khuếch đại Ngoài ra, nó còn có khả năng phân tích ADN/ARN, xác định khung đọc mở (ORFs), xác định các vị trí giới hạn trên phân tử, sắp xếp trình tự của nhiều phân tử ADN/ARN và lắp ghép các đoạn ADN thành trình tự dài hơn.
The method for designing primers to amplify the desired gene segment is carried out in eight steps, ensuring precision and efficiency in the cloning process This systematic approach is crucial for successful gene amplification, facilitating accurate results in molecular biology applications By adhering to these steps, researchers can optimize their primer design, ultimately enhancing the reliability of their genetic experiments.
Bước 1: Khởi động chương trình Vector NTI Advance 11.0, tạo dữ liệu trình tự ADN cần thiết kế mồi
Bước 2: Dán đoạn trình tự cần thiết kế mồi vào mục Edit Sequence
Bước 3: Thiết kế cặp mồi trong phần Primer Design
Bước 4: Kết quả về cặp mồi được thể hiện ở mục PCR Analysis
Hình 1.2 Phương pháp thiết kế mồi bằng phần mềm Vetor NTI 11.0
3.3.2.2 Kiểm tra mồi đối chiếu trên cơ sở dữ liệu
Bước 1: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vertor Nti 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm MEGA 6.0
Bước 2: Cặp mồi thu được sau khi thiết kế bằng phần mềm Vector NTI Advance 11.0 được kiểm tra bằng phần mềm Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)
Bước 3: Kết quả tìm kiếm so sánh trình tự của đoạn mồi với cơ sở dữ liệu của thư viện trên NCBI
Hình 3.3 Phương pháp kiểm tra tính đặc hiệu của mồi bằng phần mềm
3.3.2.3 Kiểm tra mồi trong phòng thí nghiệm
- Mẫu lá lúa (3 tuần tuổi) được thu thập và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của (Obara et al., 1998) có cải tiến
Phản ứng PCR được thực hiện trên máy Veriti 96 giếng Thermal cycler với tổng thể tích phản ứng là 15 µl Thành phần bao gồm 5 µl ADN (nồng độ 10 ng), 0,15 µM mồi, 0,2 mM dNTPs, 1X Buffer PCR, 2,5 mM MgCl2 và 0,25 đơn vị Taq polymerase.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel polyacrylamide 6,0% hoặc trên gel agarose và được phát hiện dưới tia cực tím bằng phương pháp nhuộm ethidium bromide.