Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm tiến hành xét nghiệm và thí nghiệm:
- Phòng thí nghiệm, bộ môn Vệ sinh gia súc – Viện Thú y Quốc gia
- Phòng thí nghiệm, phòng Hệ gen học vi sinh – Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Từ tháng 8 năm 2015 đến tháng 10 năm 2016
Đối tượng/vật liệu nghiên cứu
Vi khuẩnSalmonella đa kháng thuốc phânlập được từ thịt lợn, gà tươi bị nhiễm được bày bán lẻ ở một số địa điểm tại Hà Nội
Môi trường nghiên cứu được sử dụng bao gồm các loại môi trường tổng hợp từ các hãng như Eiken, Oxoid, và Biorad, được pha chế theo công thức có sẵn.
- Môi trường BPW, Muller Kauffmann, MSRV, thạch XLT4, thạch Rambach dùng để nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella
- Môi trườngKligler, Lysine decarboxylase broth (LDC), Ureaza broth, thạch nghiêng Simmoncitrate dùng để thử phản ứng sinh hóa vi khuẩn
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion) dùng để định typ và giữ giống vi khuẩn
- Các loại đường: glucoza, lactoza
- Giấy tẩm kháng sinh (do hãng Oxoid của Anh sản xuất)
* Kháng huyết thanh chuẩn để định typ vi khuẩn Salmonella
Kháng huyết thanh chuẩn (do hãng Denka Seiken Co., Ltd, Tokyo, Nhật Bản sản xuất) dùng để định typ kháng nguyên O và H của vi khuẩn Salmonella
* Hóa chất, mồi dùng cho phản ứng RT-PCR
For RT-PCR, essential components include primers, taq-DNA polymerase, dNTPs, reaction buffer, TAE (Tris-Acetic-EDTA) electrophoresis buffer, gel loading buffer, and DNA stain (Ethidium Bromide), along with other molecular biology reagents.
Dụng cụ và trang thiết bị máy móc trong phòng thí nghiệm rất đa dạng, bao gồm đĩa petri, lam kính, ống nghiệm, bình tam giác, pipet, micropipet, ống hút, que cấy, đèn cồn, nồi hấp khử trùng, tủ lạnh, lò vi sóng và kính hiển vi Những thiết bị này đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các thí nghiệm và nghiên cứu khoa học.
Nội dung nghiên cứu
- Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella bằng các môi trường đặc hiệu, kiểm tra các đặc tính sinh hóa đặc trưng
- Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập được
- Định typ chủng vi khuẩn Salmonella đa kháng sinh trong đó có kháng cả với tetracycline và chloramphenicol
- Phát hiện và đánh giá một số gen kháng thuốc của chủng Salmonella đa kháng thuốc phân lập được.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp
Salmonella spp nuôi cấy và phân lập theo tiêu chuẩn ISO 6579-2005, được tóm tắt ở sơ đồ sau:
Hình 3.1 Sơ đồ nuôi cấy và phân lập vi khuẩn Salmonella theo tiêu chuẩn
Các chủngSalmonella spp dương tính được giữ giống trên môi trường BHI có bổ sung glyxerin, bảo quản ở -20 0 C
3.5.2 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh
Trong nghiên cứu này, các chủng Salmonella được phân lập và kiểm tra khả năng mẫn cảm với kháng sinh thông qua phương pháp khuếch tán trên thạch Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm tính mẫn cảm của các chủng với 10 loại kháng sinh, trong đó có streptomycine.
Môi trường Buffered Pepton Water (225ml) ở 37 0 C/24h
Ria cấy trên thạch Rambach ở 37 0 C/24h Khuẩn lạc màu hồng cánh sen, rìa gọn
Ria cấy trên thạch XLT4 ở 37 0 C/24h Khuẩn lạc màu đen, bóng, rìa gọn
Ria cấy và cấy chích sâu trên thạch nghiêng Kligler
Phản ứng sinh hóa Lysine (+) Ureaza (-) Simoncitrat (+) Lactoza (-) Glucoza (+)
Chọn khuẩn lạc đặc trưng ampicillin, cephalothin, chloramphenicol, amoxicillin, gentamycin, tetracycline, ciprofloxacin, ceftazidine, trimethoprime/sulfamethoxazol
Các chủng Salmonella được phân lập sẽ được cấy chuyển từ đĩa thạch dinh dưỡng sang môi trường Muller Hinton agar Sau đó, sử dụng các khoanh giấy kháng sinh đặt lên trên đĩa thạch và nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Kết quả sẽ được đo đường kính của vòng vô khuẩn và so sánh với tiêu chuẩn đánh giá của CLSI (2011), đảm bảo tuân thủ các tiêu chuẩn lâm sàng trong phòng thí nghiệm.
Bảng 3.1 Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩnvới một số loại kháng sinh
TT Loại kháng sinh Hàm lượng Đường kính vòng vô khuẩn (mm)
3.5.3 Phương pháp định typ bằng phản ứng huyết thanh học
Tiến hành định typ chủng vi khuẩn Salmonellađa kháng thuốc trong đó có
Chúng tôi đã sử dụng hai loại kháng sinh chloramphenicol và tetracycline để thực hiện các phản ứng ngưng kết trên phiến kính và trong ống nghiệm với kháng huyết thanh chuẩn từ hãng Denka Seiken Co., Ltd Tokyo, Nhật Bản Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi tiến hành định danh chủng vi khuẩn kiểm tra theo bảng phân loại Kauffmann and White Popoff (2001).
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella
Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonellatừ môi trường đặc hiệu (XLT4 hoặc Rambach), ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, bồi dưỡng 37 0 C qua đêm
Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt khỏng huyết thanh polyvalent O (20 àl) lờn phiến kớnh
• Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonellađã nuôi cấy qua đêm trên môi trường
Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm và đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành kiểm tra với các nhóm OMA, OMB, OMC, giống như phương pháp kháng huyết thanh poly O Đối với nhóm có phản ứng dương tính, tiếp tục sử dụng các kháng huyết thanh O đơn giá để xác định kết quả chính xác hơn.
Ví dụ: OMA dương tính, tiếp tự với kháng huyết thanh đa giá O 3,10,15; O 9; O4,5, Nếu O 3,10,15 dương tính, tiếp tục với huyết thanh đơn giá O 3, O 10, O15
Nhiều chủng Salmonellacó 2 pha kháng nguyên H Tuy nhiên ở vi khuẩn
Salmonella thường chỉ xuất hiện ở pha 1 khi được nuôi cấy Để phát hiện pha 2, cần ức chế sự xuất hiện của pha 1 bằng cách nhỏ một giọt kháng huyết thanh ức chế pha.
1 vào đĩa thạch Sven Gard
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H
Để chuẩn bị thạch Sven Gard, bạn cần sử dụng môi trường bán cố thể có sẵn trên thị trường và pha theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sử dụng đĩa petri có đường kính 9mm, trước khi đổ thạch, hãy nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh Sven Gard để ức chế pha 1 Lưu ý rằng loại kháng huyết thanh Sven Gard sẽ khác nhau tùy theo pha 1 (SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6).
SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10
SG2: ức chế Hd, Hi, He,h
SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26
SG4: ức chế Hr, Hz
SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15
Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một ít vi khuẩn đã xác định kháng nguyên H pha 1 và nhẹ nhàng chấm lên bề mặt thạch tại vị trí trung tâm của đĩa thạch Sven Gard.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1
3.5.4 Phương pháp xác định một số gen kháng sinh của chủng Salmonella đa kháng bằng phương pháp RT-PCR
• Tách chiết RNA tổng số
Các chủng vi khuẩn Salmonella được lựa chọn sau khi thực hiện định typ trên môi trường thạch dinh dưỡng Nutrient agar Chúng được tăng sinh trong môi trường BHI nhằm đạt được canh khuẩn với nồng độ 10^8, phục vụ cho việc tách RNA.
-Lấy 1,5 ml canh khuẩn cho vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 14000 vòng/ phút trong 10 phút Đổ phần dung dịch, thu cặn vi khuẩn ở đáy ống
-Bổ sung400àl trizol.Siờu õm từ 20amp – 60 amp/ 30 giõy để phỏ màng tế bào
-Bổ sung 200àl chloroform vào mỗi eppendorf, lắc trộn đều
-Ly tâm 14000 vòng/10 phút/4 0 C Hút dịch nổi phía trên cho vào eppendorf mới
-Bổ sung 200àl chloroform, lắc trộn đều, ly tõm 14000 vũng/10 phỳt/4 0 C
-Hút dịch nổi phía trên sang eppendorf mới, tiếp tục bổ sung một lượng tương đương isopropanol, đảo nhẹ Ủ ở -20 0 C trong 3 giờ
-Thu mẫu: ly tâm 14000 vòng/10 phút/4 0 C
-Đổ hết dịch bên trên đi, rửa tủa bằng ethanol 70% pha trong DEPC-DW Rửa vòng quanh 3 lần Úp ngược xuống giấy thấm sạch, để khô tự nhiên
-Bổ sung 70àl DEPC- DW mỗi eppendorf, bỳng nhẹ để làm tan hoàn toàn cặn
-Mẫu RNA tổng số được bảo quản ở -80 0 C cho thí nghiệm tiếp theo
0,1M DTT 2 àl/ mẫu dNTPs 2 àl/ mẫu
Random primer 2 àl/ mẫu RNase inhibitor 0,5 àl/ mẫu mMLV-RT 1 àl/ mẫu
+ Mix đều rồi ủ hỗn hợp ở 75 0 C/5 phút Sau đó chia vào eppendorf có sẵn 8,5àl RNA tổng số (đó được hiệu chỉnh về nồng độ 1 àg/ àl)
+ Lắc trộn đều, ly tâm nhẹ, rồi ủ ở 37 0 C trong 1 giờ
+ Tiếp tục đun sôi ở 95 0 C trong 5 phút Sau đó đặt ngay vào đá 5 phút + Bảo quản ở -20 0 C
Trình tự các cặp mồi và kích thước sản phẩm PCR được sử dụng để xác định gen kháng thuốc của chủng Salmonella đa kháng thuốc đã được xác lập dựa trên các nghiên cứu của Ma et al (2007) và Zhao et al (2001).
Bảng 3.2 Trình tự các cặp mồi đặc hiệu xác định gen kháng kháng sinh
Nhóm kháng sinh Gen Ký hiệu mồi Trình tự nucleotide của mồi 5’ – 3’
• Hỗn hợp phản ứng RT - PCR bao gồm các thành phần:
- 2àl 10X dream taq buffer (bao gồm 2mM MgCl2)
- 1àl mỗi loại primer (10 pmol/àl)
- 0,2àl taq DNA polymerase (5 units/àl) (ABgene)
- Nước cất vừa đủ 20àl cho một phản ứng
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 94 0 C/
3 phút và 25 chu kỳ nhiệt (biến tính 94 0 C/50 giây, ủ bắt cặp mồi 56 0 C/30 giây, kéo dài 72 0 C/45 giây), và kéo dài cuối cùng ở 72 0 C/ 7 phút
Sản phẩm PCR sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu theo tỉ lệ 1:5 và sau đó được chạy điện di trên gel agarose 1% trong dung dịch đệm TAE (Tris-Acetate-EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang ethidium bromide (1 àl/ml) trong vũng5 phỳt
Để đọc kết quả, hãy quan sát dưới ánh sáng UV (300 nm) và sử dụng máy ảnh kỹ thuật số để chụp ảnh Kích thước các băng DNA sẽ được so sánh với thang chuẩn (marker).
3.5.5 Phương pháp xử lý số liệu
Hình ảnh kết quả RT-PCR được phân tích sau khi điện di bằng phần mềm Quantity One (Gel Doc 1000, phiên bản 4.6.3, Bio-Rad, Hercules, CA) Tỷ lệ biểu hiện của gen kháng kháng sinh so với gen đối chứng được xử lý và tính toán trên Excel.
- Vẽ đồ thị bằng phần mềm SigmaPlot v12.0
- Mức độ tin cậy bằng phần mềm GraphPad Prism v5.0
