Mở Ðầu
Tính cấp thiết của đề tài
Bệnh Cúm gia cầm (CGC) xảy ra lần đầu tiên ở Việt Nam vào cuối năm
Virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao (HPAI) đã gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và đe dọa sức khỏe con người từ năm 2003 đến 6/2017, với 856 ca bệnh và 452 người chết trên toàn thế giới, trong đó Việt Nam ghi nhận 127 ca mắc và 64 ca tử vong (WHO, 2017) Virus này có khả năng biến đổi nhanh chóng, dẫn đến sự xuất hiện nhiều biến chủng H5N1 tại nhiều quốc gia từ châu Á đến châu Âu Tại Việt Nam, nhiều biến chủng virus A/H5N1 đã được phát hiện, được phân loại thành các nhánh và phân nhánh khác nhau như 1, 1.1, 2.3.4, 2.3.2.1, 3, 5, 7.1, 7.2 (Nguyen et al., 2014) Nghiên cứu cho thấy sự xuất hiện của các biến chủng virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 mới tại Việt Nam do tiến hóa của virus địa phương hoặc lây nhiễm từ nước ngoài qua buôn bán gia cầm và chim di cư, làm giảm hiệu quả của các chiến dịch phòng bệnh bằng vacxin.
Giám sát virus CGC mới là cần thiết để phát hiện biến chủng và xây dựng chiến lược phòng chống hiệu quả Việc thực hiện giám sát tại các chợ gia cầm sống là quan trọng, do đây là nơi tập trung nhiều động vật từ các nguồn khác nhau, tạo điều kiện cho virus CGC lây lan Ở Việt Nam, với phương thức chăn nuôi gia cầm nhỏ lẻ, việc phát hiện virus qua các chợ buôn bán gia cầm sống là phương pháp tối ưu.
Quảng Nam là tỉnh có quy mô chăn nuôi gia cầm lớn, nhưng dịch cúm gia cầm (CGC) có nguy cơ bùng phát cao và có khả năng lây sang người, gây thiệt hại cho kinh tế địa phương Để chủ động phòng chống dịch bệnh, giảm thiểu tổn thất cho nông dân và ngăn chặn lây lan sang người, chúng tôi tiến hành nghiên cứu về tình hình nhiễm và một số đặc tính sinh học của virus cúm gia cầm A/H5N1 và H5N6 tại các chợ gia cầm ở Quảng Nam trong giai đoạn 2016 – 2017.
Công việc này thuộc đề tài “Nghiên cứu sự phân bố các biến chủng mới của virus cúm A/H5N1 trên đàn gia cầm ở Việt Nam”, nhằm cung cấp cơ sở cho việc phòng chống dịch bệnh hiệu quả Đề tài được cấp mã số ĐTĐL.CN-10/15 và được Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ kinh phí.
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
- Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 tại các chợ buôn bán gia cầm sống ở tỉnh Quảng Nam
- Xác định nhánh của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được tại tỉnh Quảng Nam
- Xác định một số đặc tính sinh học của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được tại tỉnh Quảng Nam.
Ý nghĩa khoa học của đề tài
Nghiên cứu xác định tỷ lệ nhiễm virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 trên gà, vịt tại một số chợ ở Quảng Nam nhằm đưa ra các biện pháp quản lý hiệu quả việc buôn bán gia cầm sống tại các chợ.
Virus CGC độc lực cao đã được phân lập, phục vụ cho chẩn đoán và lưu giữ giống virus Việc này giúp cung cấp thông tin kịp thời để phát hiện sớm nguy cơ dịch CGC, từ đó nâng cao hiệu quả công tác phòng và chống bệnh.
Giải trình tự gen các chủng virus cúm A/H5N1 và A/H5N6 tại tỉnh Quảng Nam cho phép xác định các clade virus hiện có, đồng thời theo dõi sự biến đổi của chúng (nếu có) Việc này đóng vai trò quan trọng trong công tác quản lý dịch bệnh và đánh giá hiệu quả của vacxin tại khu vực.
Nội dung - nguyên liệu - phương pháp nghiên cứu
Đối tượng - vật liệu nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, mẫu dịch ngoáy hầu họng (swab) của gà và vịt được thu thập tại các chợ gia cầm ở tỉnh Quảng Nam trong khoảng thời gian 6 tháng của năm 2016 và 6 tháng đầu năm 2017 Mỗi tháng, 90 mẫu swab (bao gồm 30 mẫu từ gà và 60 mẫu từ vịt) được lấy tại 3 chợ thuộc 3 huyện khác nhau.
Phôi trứng gà 8-10 ngày tuổi (lấy từ gà khỏe mạnh, chưa tiêm phòng vacxin cúm gia cầm)
Tế bào xơ phôi gà (tế bào xơ phôi được làm từ trứng gà có phôi 8-10 ngày tuổi)
Kít tách chiết ARN: bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc # 74106 250 prep
Mastermix: Sử dụng kít rRT-PCR Invitrogen superscriptIII qRT-PCR PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen)
Primer và probe matrix thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1, H5N6 Primer và kít để giải trình tự gen
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Xác định được tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A trên gà, vịt
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5 trên gà, vịt
Xác định tỷ lệ lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 trên gà, vịt
Xác định sự lưu hành virus cúm A/H5N1, A/H5N6 theo tháng
Xác định nhánh của các chủng virus cúm A/H5N1, A/H5N6 thu được thông qua giải trình tự gen HA
3.4.2 Xác định được một số đặc tính sinh học của virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Tính thích ứng trên phôi gà
Tính thích ứng trên tế bào xơ phôi gà.
Phương pháp nghiên cứu
3.5.1 Phương pháp phát hiện virus cúm A/H5N1, A/H5N6
3.5.1.1 Phương pháp tách chiết ARN
Các mẫu swab trong dung dịch bảo quản được lắc, ly tâm và chiết tách ARN bằng bộ kít Qiagen Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep hoặc #
74106 250 prep theo quy trình của nhà sản xuất dưới đây:
- Nhỏ 200 l mẫu vào ống ly tâm loại 1,5 ml cùng với 600 l Qiagen buffer RLT có 1 % -ME, lắc đều trên máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ
- Thêm 500 l etanol 70 % vào ống, lắc mạnh bằng máy trộn (vortex) rồi ly tâm nhẹ
- Chuyển tất cả dịch nổi sang cột lọc RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ
10000 vòng/phút trong 15 giây ở nhiệt độ phòng
- Bổ sung 700 l dung dịch rửa RW1 vào cột RNeasy Qiagen, ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới vào cột lọc
- Nhỏ 500 l dung dịch rửa RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm ở
10000 vòng/phút trong 15 giây, thay ống thu mới, lặp lại 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer
- Thay ống thu mới, ly tâm cột lọc và ống thu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 2 phút, bỏ ống thu
Để bắt đầu, hãy đặt cột lọc vào ống thu ARN và thêm 50 l nước sạch nuclease vào cột Ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 10,000 vòng/phút trong 1 phút Cuối cùng, bỏ cột lọc và giữ lại dung dịch trong ống thu ARN.
- Bảo quản mẫu ARN thu được ở 4 o C trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR Nếu để sau 24 giờ, nên bảo quản mẫu ở âm 20 o C hoặc nhiệt độ thấp hơn
3.5.1.2 Phương pháp Real time RT-PCR (rRT-PCR) xác định virus cúm A/H5N1, A/H5N6
Thực hiện phản ứng Real time RT-PCR (rRT-PCR) với các cặp mồi và probe được thiết kế đặc hiệu cho virus cúm A/H5N1 và A/H5N6, theo quy trình chẩn đoán TCVN 8400-26:2014.
Bảng 3 1 Primer và probe để phát hiện virus cúm gia cầm A/H5N1, A/H5N6
Mồi/probe Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’) Đầu
Probe TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG FAM BHQ1
Xuôi GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA
Ngược AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA
Probe TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA FAM BHQ1
Xuôi ACA TAT GAC TAC CCA CAR TAT TCA G
Ngược AGA CCA GCT AYC ATG ATT GC
Probe TGG TCT TGG CCA GAC GGT GC FAM BHQ1
Xuôi TGG ACT AGT GGG AGC AGC AT
Ngược TGT CAA TGG TTA AGG GCA ACT C
Probe CCA ATA ACA GGA GGG AGC CCA GAC CC FAM BHQ1 Xuôi CCC CAC CAA TGG GAA CTG
Ngược TCT AGG AAT GCA AAC CCT TTT ACC
Nucleotide R = nucleotide A hoặc G Nucleotide Y = nucleotide C hoặc T Nucleotide K = nucleotide G hoặc T Nucleotide N = nucleotide bất kì
- Thành phần của phản ứng được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Thành phần của phản ứng Real time RT-PCR
Hỗn hợp phản ứng Lượng dựng cho 1 phản ứng (àl)
- Chu trình nhiệt của phản ứng:
+ Chu trình 40 vòng: 95 o C trong 10 giây + 58 o C trong 50 giây
3.5.2 Phương pháp giải trình tự gen
3.5.2.1 Phương pháp nhân gen HA
- Nhân đoạn gen HA bằng phản ứng RT-PCR (PCR phiên mã ngược) với các cặp primer đặc hiệu (Bảng 3.3)
Bảng 3.3 Trình tự primer để nhân gen HA Tên primer Trình tự chuỗi nucleotide (5’-3’)
S17_H5-F1 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AGC AAA AGC AGG
CAG GAA ACA GCT ATG ACC CAT ACC AAC CAT CTA YCA TTC C
S19_H5-F751 TGT AAA ACG ACG GCC AGT AYG CMT AYA ARA
CAG GAA ACA GCT ATG ACA GTA GAA ACA AGG GTG TTT TTA ACT ACA AT
- Pha master mix để chạy phản ứng PCR: Sử dụng kít PCR superMix (Cat No 11306-016, Invitrogen) và các thành phần phản ứng khác (Bảng 3.4)
+ 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 61 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 59 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút + 1 vòng: 95 °C trong 10 giây + 57 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
+ Chu trình 35 vòng: 95 °C trong 10 giây + 55 °C trong 30 giây + 68 °C trong 1 phút
Bảng 3.4 Thành phần của phản ứng RT-PCR
Hỗn hợp phản ứng Lượng dựng cho 1 phản ứng (àl)
3.5.2.2 Phương pháp xây dựng cây phả hệ
- Sử dụng phần mềm Bioedit 7 để thực hiện việc so sánh các chuỗi trình tự (Alignment)
- Lập cây phả hệ cho virus cúm (chuỗi gen HA) bằng phần mềm
MEGA 7 (Molecular Evolutionary Genetic Analysis) sử dụng phương pháp
Neighbor-joining (NJ) Lập cây phả hệ so sánh với các virus cúm A/H5N1,
A/H5N6 thuộc các clade (nhánh) khác nhau với gốc là virus clade 2.3.2.1c
A/Hong_Kong/6841/2010(H5N1) và A/chicken/Jiangxi/NCDZT1126/2014
3.5.3 Phương pháp phân lập virus trên tế bào xơ phôi và trứng gà có phôi
Bệnh phẩm là dịch swab từ gà được thu thập từ ba chợ ở tỉnh Quảng Nam Quy trình xử lý bao gồm lắc ống dịch swab chứa tăm bông, sau đó ly tâm và chuyển dịch nổi sang ống 1,5ml, cuối cùng là vô khuẩn bằng kháng sinh.
Sử dụng phôi trứng gà 8-10 ngày tuổi
Tiêm 0,2 ml dịch bệnh phẩm vào xoang niệu mô của phôi trứng gà và ấp ở nhiệt độ 37°C trong 96 giờ Hàng ngày soi trứng, thu trứng chết và kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định khả năng gây ngưng kết hồng cầu gà Đồng thời, thực hiện phản ứng HI với kháng thể chuẩn kháng virus cúm gia cầm và kháng thể kháng virus Newcastle để giám định virus phân lập được.
Phôi trứng cần được bảo quản ở nhiệt độ từ 2-8 độ C ít nhất 2 giờ trước khi thu thập dịch niệu mô Sử dụng syring 5ml hoặc 10ml để thu thập dịch niệu mô bằng cách đâm xuyên qua nắp buồng hơi Dịch niệu mô sau đó được chia thành nhiều ống nhỏ, mỗi ống chứa 0,5ml và được lưu trữ ở nhiệt độ -70 độ C.
3.5.4 Xác định chỉ số EID50 Để tính EID50, virus được pha loãng thành nhiều nồng độ theo cơ số 10 và tiêm và xoang niệu mô của phôi trứng, mỗi nồng độ 5 phôi, mỗi phôi 0,1ml dịch virus, ấp ở tủ ấp 37 0 C tới 96 giờ
Kiểm tra trứng hàng ngày để phân loại phôi sống và phôi chết, đồng thời thu hoạch nước trứng Thực hiện phản ứng HA với nước trứng; những mẫu có phản ứng HA dương tính sẽ được xác định là nhiễm virus A/H5N1 hoặc A/H5N6.
Sử dụng công thức Reed- Meunch để xác định chỉ số EID50
3.5.5 Xác định chỉ số TCID50
Sử dụng môi trường tế bào xơ phôi từ phôi trứng gà 9-10 ngày tuổi để chuẩn độ virus cúm gia cầm, tế bào được nuôi cấy trên đĩa 96 giếng với lượng 5x10^4 tế bào/100µl/giếng Virus được pha loãng với các nồng độ từ 10^-2 đến 10^-8 trong môi trường Eagle's MEM, mỗi nồng độ được thực hiện ở 5 giếng, với 100µl dung dịch virus pha loãng CPE được quan sát và xác định sau 2 ngày.
Sử dụng công thức Reed- Meunch để xác định chỉ số EID50
Sử dụng bảng tổng hợp số liệu (bảng 3.5) để tính toán chỉ số EID50 và TCID50
Bảng 3.5 tổng hợp số liệu để tính toán chỉ số EID50 và TCID50, bao gồm độ pha loãng với 100% nhiễm virus (HA dương tính) và độ pha loãng không nhiễm virus (HA âm tính).
Số trứng bị nhiễm virus (HA dương tính)
Số trứng không nhiễm virus (HA âm tính)
Số tích lũy (cộng dồn)
Công thức tính như sau:
Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%-50 Chỉ số Tỷ lệ nhiễm cận trên 50%- Tỷ lệ nhiễm cận dưới 50%
Giá trị EID50 và TCID50 được xác định bằng cách tính hiệu giá pha loãng cận trên 50% và chỉ số tương ứng Chẳng hạn, nếu chỉ số đạt 0,5 với độ pha loãng virus cao nhất có tỷ lệ nhiễm 50% là 10^-7, thì chuẩn độ của virus sẽ là 10^-7,5 Phương pháp HA và HI được sử dụng để giám định virus.
3.5.7.1 Phương pháp ngưng kết hồng cầu (HA)
Phương pháp HA được tiến hành phản ứng trên đĩa microtier 96 giếng đỏy chữ v (tổng lượng hỗn dịch là 75àl/ giếng), cỏc bước tiến hành như sau:
- Cho 25 àl dung dịch PBS pH 7,2 vào cỏc giếng của đĩa phản ứng
- Cho 25 àl dung dịch chứa virus (nước trứng) vào giếng thứ nhất và bắt đầu pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2 từ giếng thứ nhất đến giếng thứ 11
- Nhỏ 25 àl dung dịch PBS vào cỏc giếng từ 1 đến giếng 12
Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu gà 1% (lấy từ gà khỏe mạnh) vào các giếng từ 1 đến 12 Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 15-30 phút và sau đó đọc kết quả ngưng kết.
Hiệu giá ngưng kết hồng cầu gà (HA) là nồng độ pha loãng cao nhất còn có hiện tượng ngưng kết toàn phần
3.5.7.2 Phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Phương pháp HI được thực hiện trên đĩa microtiter 96 giếng đáy chữ V Sau khi xác định hiệu giá HA của virus, virus được pha thành dung dịch kháng nguyên với nồng độ 4 đơn vị HA Các bước tiến hành phản ứng sẽ được thực hiện theo quy trình đã định.
- Cho 25 àl dung dịch PBS pH 7,2 vào cỏc giếng của đĩa phản ứng
- Cho 25 àl khỏng huyết thanh chuẩn A/H5N1, A/H5N6 đó biết được pha loãng với PBS theo cơ số 2
- Sau đú nhỏ vào mỗi giếng 25 àl dung dịch khỏng nguyờn 4 đơn vị HA, để ở nhiệt độ phòng 30 phút
- Tiếp tục nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu gà 1% vào cỏc giếng, để 15-30 phút và đọc kết quả
Hiệu giá ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI) là mức độ pha loãng tối đa của huyết thanh mà vẫn duy trì khả năng ức chế hoàn toàn quá trình ngưng kết hồng cầu.
Khi tiến hành phản ứng HI với kháng huyết thanh chế từ chồn (ferret), huyết thanh được pha loãng trước ở 1/10, rồi tiếp tục pha theo cơ số 2.
