LỜI CAM ĐOAN Dữ liệu trong luận văn là một phần của đề tài “Nghiên cứu tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng và sự phát tán của chủng vi khuẩn kháng thuốc giữa các
Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại các trang trại trên địa bàn Hà Nội và vùng phụ cận
- Phân lập và giám định vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng thu thập tại trang trại trên địa bàn hà nội và vùng phụ cận
- Kiểm tra tính kháng kháng sinh và xác định đặc điểm gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn E.coli phân lập được.
Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn E.coli có khả năng kháng kháng sinh được phân lập từ vỏ trứng gà thu thập tại các trang trại ở Hà Nội và khu vực lân cận Nghiên cứu này nhằm đánh giá mức độ kháng kháng sinh của E.coli, góp phần hiểu rõ hơn về tình trạng kháng thuốc trong môi trường nông nghiệp Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý và kiểm soát vi khuẩn gây bệnh trong ngành chăn nuôi.
Nguyên liệu nghiên cứu
- Mẫu trứng gà thu thập tại các trang trại chăn nuôi
3.3.2 Các môi trường chuyên dụng dùng để phân lập, giám định vi khuẩn
- Các môi trường dùng cho phân lập, nuôi cấy vi khuẩn E.coli gồm: Môi trường thạch MacConkey, thạch Mueller Hinton, Tryptone Bile Glucuronic Agar (TBX), nước thịt pepton
3.3.3 Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài
Tetracyclin, Trimethoprim/Sufamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin và Amoxicillin-clavulanic acid
- Khoanh giấy tẩm kháng sinh được bảo quản theo tiêu chuẩn Kết quả được đánh giá theo qui định của nhà sản xuất
Trong nghiên cứu vi khuẩn, các dụng cụ phòng thí nghiệm đóng vai trò quan trọng, bao gồm tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp, buồng cấy, cân điện tử, đĩa lồng, pipet, ống nghiệm, đèn cồn, bếp điện, bình tam giác, ống đong và giấy đo pH Những thiết bị này giúp đảm bảo quy trình nghiên cứu chính xác và hiệu quả.
- Hoá chất: Dung dịch NaOH 10%, muối tinh, pepton, cồn sát trùng 70%, nước muối sinh lý 0,85%, ống so màu độ đục chuẩn (Mc Farland 0,5)…
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Điều tra tình hình sử dụng thuốc kháng sinh trong chăn nuôi gà đẻ
Chúng tôi tiến hành điều tra ngẫu nhiên thông tin từ các hộ chăn nuôi gà đẻ tại một số trang trại ở Hà Nội và các vùng lân cận như Hưng Yên và Hòa Bình, dựa trên phiếu khảo sát về việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi.
Phiếu điều tra cung cấp các thông tin quan trọng liên quan đến hộ chăn nuôi, bao gồm quy mô đàn, tên thuốc kháng sinh đã sử dụng, liều lượng và thời gian sử dụng, mục đích sử dụng kháng sinh, cũng như cơ sở áp dụng các loại thuốc này.
3.4.2 Phương pháp thu thập trứng
Mẫu trứng được thu thập tại trang trại gà đẻ theo tiêu chuẩn phòng thí nghiệm, với mỗi mẫu gồm 3 quả trứng Quy trình thu thập sử dụng găng tay một lần để đảm bảo vệ sinh, sau đó cho trứng vào túi zip vô trùng, đánh dấu số mẫu và đặt vào hộp chuyên dụng có vụn xốp để tránh bị vỡ Mẫu trứng được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
- Mỗi mẫu trứng lấy với số lượng là 3 quả
- Lấy 4 mẫu/ hộ chăn nuôi gia cầm để xét nghiệm vi khuẩn E coli
3.4.3 Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu vận chuyển về phòng thí nghiệm được xử lý ngay, trường hợp chưa xử lý được thì mẫu được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4 o C không quá 36 giờ
Sử dụng tăm bông vô trùng có tẩm nước muối sinh lý 0,9% để lau quanh vỏ trứng nhằm phân lập vi khuẩn E coli Mẫu tăm bông này có thể được bảo quản ở nhiệt độ -80 o C cho đến khi sử dụng.
3.4.4 Phương pháp bảo quản mẫu
Vi khuẩn E coli thuần khiết được bảo quản trong dung dịch Glycerol với tỷ lệ 1:1 và được cất giữ trong tủ lạnh âm sâu -80 o C
3.4.5 Phương pháp phân lập và giám định vi khuẩn E coli
Vi khuẩn E coli được phân lập từ mẫu lau tăm bông trên môi trường thạch TBX và nuôi ở 37°C trong 24 giờ Các khuẩn lạc màu xanh lá cây, đứng riêng lẻ, được chọn và cấy lại trên môi trường thạch MacConkey để thuần vi khuẩn Tính thuần của vi khuẩn được kiểm tra bằng phương pháp nhuộm Gram.
Vi khuẩn E coli thuần khiết được nuôi cấy trong 10 ml môi trường nước thịt pepton ở nhiệt độ 37 o C trong 18 giờ Sau khi tăng sinh, ống môi trường vi khuẩn được ly tâm để loại bỏ dung dịch peptone và thu cặn vi khuẩn Cặn vi khuẩn thu được được hoàn nguyên với 500 µl dung dịch peptone và 500 µl glycerol, sau đó bảo quản ở -80 o C Các bước phân lập và bảo quản giống vi khuẩn được tóm tắt trong hình dưới đây.
Hình 3.1 Tóm tắt các bước phân lập và bảo quản giống
3.4.6 Thử tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được
Khả năng mẫn cảm của các chủng vi khuẩn với kháng sinh được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch, dựa trên nguyên lý Kirby – Bauer Kết quả được đánh giá theo tiêu chuẩn của Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng và phòng thí nghiệm.
* Phương pháp được tiến hành như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị môi trường thạch đĩa Mueller Hinton
Để nuôi cấy vi khuẩn, bước đầu tiên là ủ chúng trong môi trường thích hợp ở nhiệt độ 37 độ C Tiếp theo, lấy một khuẩn lạc hòa vào 1,5 ml nước sinh lý để đạt độ đục 0,5 theo thang màu McFarland 0,5 Cuối cùng, sử dụng tăm bông vô trùng để tẩm dung dịch đã pha loãng và dàn đều lên môi trường thạch đĩa Muller Hinton.
+ Bước 3: Dùng kẹp đặt các khoanh giấy tẩm kháng sinh lên mặt thạch
Đặt đĩa thạch trong tủ ấm ở 37oC trong khoảng 18 – 24 giờ Để đánh giá mức độ mẫn cảm hoặc kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn kiểm tra, cần đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn.
Kết quả được xác định bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và so sánh với bảng chuẩn để đánh giá tính mẫn cảm hoặc đề kháng của vi khuẩn đối với kháng sinh tương ứng.
Bảng 3.1 Bảng đánh giá khả năng mẫn cảm / kháng kháng sinh của E coli theo (CLSI 2014)
Hàm lượng kháng sinh Đường kính vòng vô khuẩn
Sơ đồ bố trí cho phương pháp kháng sinh đồ được trình bày tại hình 3.2 Để thực hiện, lấy 1ml dung dịch vi khuẩn và cấy đều trên bề mặt đĩa thạch MH Sử dụng kẹp nhọn vô trùng để đặt từng khoanh giấy tẩm kháng sinh theo vị trí đã đánh dấu Để đĩa thạch ở nhiệt độ phòng trong 15-30 phút cho kháng sinh khuếch tán Sau đó, lật ngược đĩa thạch và nuôi ở tủ ấm 37°C trong 18-24 giờ, lưu ý đặt phần có ký hiệu tên kháng sinh áp xuống bề mặt thạch và không được nhấc lên đặt lại để tránh sai lệch kết quả.
Hình 3.2 Sơ đồ bố trí các khoanh giấy kháng sinh
Kết quả được xác định sau 24 giờ nuôi cấy ở nhiệt độ 37°C, với kích thước vòng vô khuẩn được đo chính xác từ mặt sau của đĩa thạch Kích thước này sau đó được so sánh với đường kính vòng vô khuẩn của từng chủng và vòng ức chế vô khuẩn chuẩn, từ đó ghi lại kết quả cho từng loại kháng sinh đã thử nghiệm Kết quả được đánh giá theo thang nhạy cảm, trung gian và kháng kháng sinh Kích thước đường kính vòng vô khuẩn đối với từng loại kháng sinh được trình bày chi tiết trong bảng 3.1.
Xác định gen kháng kháng sinh của chủng E.coli phân lập được
Chủng vi khuẩn E coli đa kháng kháng sinh được gửi tới công ty BGI
(Hồng Kông) để tiến hành giải trình tự genome bằng hệ thống Illumnia HiSeq
Quy trình thực hiện được BGI tiến hành vào năm 2000, bắt đầu bằng việc sử dụng công cụ SPAdes 3.9 để lắp ráp các đoạn trình tự nucleotide (contig) khi đã có trình tự gen Sau đó, phân tích trình tự nucleotide được thực hiện bằng công cụ ResFinder nhằm xác định các gen kháng kháng sinh trong genome của chủng vi khuẩn Đối với phân tích biến đổi gen, các biến thể gen kháng colistin (MCR) được tham khảo từ nghiên cứu trước đây của Wei et al (2018) trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Trình tự gen tham chiếu mcr-1
GenBank Mã số Protein Loài vi khuẩn Biến thể gen MCR
KX276657 anh55937 Escherichia coli MCR1
NG_051170 wp065274078 Klebsiella pneumoniae MCR1.2(Q3L)
LC191581 bav82474 Escherichia coli MCR1
KY075656 aqz20430 Escherichia coli MCR1
NG_054678 wp085562392 Escherichia coli MCR1.7(A215T)
KY271416 apm84489 Escherichia coli MCR1.5(H452Y)
NG_052664 wp076611062 Escherichia coli MCR1.4(D440N)
KX859085 aqs99092 Escherichia coli MCR1.13(M2V)
NG_054697 wp085562407 Escherichia coli MCR1.8(Q3R)
NG_052893 wp077248208 Salmonella enterica MCR1.6(R536H) KX443408 ara74236 Klebsiella pneumoniae MCR1.9(V413A)
NG_052861 wp077064885 Escherichia coli MCR1.3(I38V)
NG_051171 wp065419574 Escherichia coli MCR2
NG_055496 wp078254299 Moraxella pluranimalium MCR2.1
CP014234 ame01623 Moraxella osloensis MCR-M
Phương pháp xử lý số liệu
Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học và sử dụng phần mềm Excel.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh
Hình 4.1 Kết quả điều tra tình hình sử dụng kháng sinh
Ghi chú: 12 nhóm kháng sinh được điều tra, bao gồm: Aminoglycoside (1), Amphenicols (2), Beta-lactam
(3), Cephalosporin (4), Fluoroquinolone (5), Glycopeptides (6), Lincosamides (7), Macrolide (8), Nitrofurans (9), Pleuromutilins (10), Polypeptide (11), Spectinomycin (12), Tetracycline (13) và
Việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi tại Việt Nam đang gia tăng sự xuất hiện của vi khuẩn kháng thuốc, đặc biệt khi thuốc kháng sinh được bán không theo đơn và trộn vào thức ăn cho gia súc, gia cầm và thủy sản mà không có sự giám sát chuyên môn Điều này dẫn đến việc sử dụng kháng sinh một cách thiếu trách nhiệm, ảnh hưởng đến an toàn thực phẩm và sức khỏe con người Nghiên cứu này nhằm tìm hiểu mối liên hệ giữa việc sử dụng kháng sinh và tính kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập từ trứng Để thực hiện, nghiên cứu đã điều tra 50 hộ nuôi gà đẻ về các loại kháng sinh đã sử dụng trong lứa nuôi cho đến thời điểm lấy mẫu Kết quả được trình bày ở Hình 4.1.
Có 9 trong tổng số 14 loại kháng sinh được điều tra đã được sử dụng trong quá trình chăn nuôi gà Các loại kháng sinh được dùng thuộc về 12 nhóm kháng sinh (hình 4.1) Trong 14 loại kháng sinh được điều tra, một số loại được thấy dùng phổ biến nhất, ví dụ như: Amoxicillin (62,1%), Doxycyclin (58,6%), Trimethoprim/sulfamethoxazole (51,7%) Nhận xét về cách dùng thuốc, chúng tôi thấy người chăn nuôi dùng kháng sinh quá lạm dụng chủ yếu dựa vào kinh nghiệm chăn nuôi và làm theo hướng dẫn của nhà sản xuất, có một phần nhỏ các hộ chăn nuôi thì cập nhật kỹ thuật của một số các công ty lớn nhưng không nhiều Về mục đích sử dụng kháng sinh, phần lớn kháng sinh được dùng để phòng và trị bệnh Thời gian ngừng sử dụng thuốc kháng sinh cho gia cầm trước khi xuất chuồng tại các hộ chăn nuôi thường theo kinh nghiệm ( Phụ Lục 1)
Theo báo cáo của WHO năm 1997, 50% lượng kháng sinh được sử dụng trong nông nghiệp, chủ yếu để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Tại Anh, trong năm 2001, trong tổng số 26,6 triệu tấn kháng sinh dùng cho động vật, chỉ có 2 triệu tấn được sử dụng cho điều trị, phần còn lại chủ yếu phục vụ cho mục đích kích thích tăng trưởng và phòng bệnh (Brody, 2001) Việc quản lý sử dụng kháng sinh đã được thực hiện nghiêm ngặt tại nhiều quốc gia Đặc biệt, vào năm 2018, Việt Nam đã ngừng cho phép sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi với mục đích tăng trọng.
Kết quả phân lập và giám định vi khuẩn E coli
4.2.1 Kết quả phân lập vi khuẩn E Coli
Nghiên cứu này đã tiến hành thu thập mẫu từ đàn gà nuôi tại Hà Nội và các vùng lân cận Hình ảnh phân lập và thuần khiết của vi khuẩn E coli được thực hiện trên môi trường thạch chọn lọc Macconkey và Tryptone Bile X-glucuronide Agar (TBX), như được thể hiện trong hình 4.2 và 4.3.
Hình 4.2 Hình ảnh đặc trưng của vi khuẩn E coli trên môi trường (1)
Hình 4.3 Kết quả phân lập E coli trên thạch TBX
Kết quả ria cấy mẫu trên thạch TBX cho thấy sự xuất hiện của các loại khuẩn lạc có màu sắc khác nhau, bao gồm cả màu xanh lục Đặc biệt, chủng E coli thuần khiết trên thạch TBX tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ, đồng nhất màu xanh lục (được đánh dấu bằng mũi tên).
E coli sản sinh enzyme glucuronidase, cho phép phân giải x-glucuronide và tạo ra khuẩn lạc màu xanh lục (Hình 4.3C-D) Tính thuần khiết của chủng E coli được xác nhận qua phương pháp nhuộm Gram, cho thấy sự hiện diện của một dạng vi khuẩn đồng nhất trên vi trường Các mẫu vi khuẩn đồng nhất với khuẩn lạc màu xanh lục trên thạch TBX được xác định là dương tính với E coli, như được trình bày trong bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả phân lập E coli từ trứng và swab ổ nhớp
Loại mẫu Số mẫu kiểm tra*
Số mẫu phân lập được E coli
Ghi chú: * có 62 mẫu lòng trứng trong số 204 quả trứng được dùng phân lập E coli Phân lập E coli từ
50 mẫu swab ổ nhớp lấy ở gà của trang trại thu mẫu trứng
Bảng 4.1 cho thấy vi khuẩn E coli hiện diện trong cả ba loại mẫu: swab ổ nhớp, vỏ trứng và lòng trứng Tỷ lệ dương tính giảm dần từ swab ổ nhớp (84,0%) đến vỏ trứng (33,3%) và lòng trứng (1,6%), cho thấy sự phân lập vi khuẩn này có sự khác biệt rõ rệt giữa các mẫu.
E coli ở vỏ trứng thấp hơn rõ rệt so với mẫu swab ổ nhớp Sự khác biệt này là do cơ chế chống nhiễm khuẩn của trứng (Jonchère et al., 2010; Wellman-Labadie et al., 2008), với sự hiện diện của nhiều loại protein có hoạt tính diệt khuẩn trên vỏ trứng, ví dụ như: ovocleidin-17, ovocleidin-116, ovocalyxin-21, ovocalyxin- 25, ovocalyxin-32 và ovocalyxin-36 (Hamid, 2016) Về tỷ lệ dương tính, một số nghiên cứu trong nước và quốc tế cho biết tỷ lệ nhiễm E coli ở vỏ trứng rất biến động, từ 10,5% (Eid et al., 2015) cho đến 29,1% (Trương Hà Thái và cs., 2017)
Tỷ lệ phân lập E coli ở vỏ trứng trong nghiên cứu này phù hợp với các nghiên cứu trước đó Dữ liệu từ swab ổ nhớp được sử dụng để so sánh với mục tiêu nghiên cứu chính là trứng.
Kết quả nghiên cứu cho thấy vỏ trứng có thể là nguồn lây nhiễm vi khuẩn E coli từ trang trại đến bàn ăn, trong khi tỷ lệ nhiễm E coli ở lòng trứng chỉ đạt 1,6% Do đó, nghiên cứu này chủ yếu tập trung vào việc phân lập vi khuẩn từ vỏ trứng.
E coli ở vỏ trứng và dùng cho nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh Các phần dưới đây tổng hợp kết quả phân lập E coli ở vỏ trứng theo địa phương và theo tình trạng sử dụng kháng sinh trong quá trình nuôi
Bảng 4.2 Kết quả phân lập E coli ở vỏ trứng theo địa phương lấy mẫu
TT Địa điểm* Số mẫu kiểm tra
Số mẫu phân lập được E coli
Các huyện thuộc thành phố Hà Nội bao gồm Chương Mỹ, Đông Anh, Mỹ Đức, Nam Từ Liêm, Quốc Oai, Thanh Trì và Thường Tín Ngoài ra, tỉnh Hưng Yên có các huyện Tiên Lữ và Văn Giang.
Lương Sơn của tỉnh Hòa Bình
Kết quả từ bảng 4.2 cho thấy hiện tượng nhiễm E coli ở vỏ trứng xuất hiện ở hầu hết các địa phương khảo sát, ngoại trừ Đông Anh Nghiên cứu này tập trung vào kháng kháng sinh của E coli phân lập từ trứng, vì vậy không so sánh tỷ lệ nhiễm giữa các địa điểm Trong 29 đàn gà được lấy mẫu, có 10 đàn không sử dụng kháng sinh và 19 đàn sử dụng kháng sinh Tỷ lệ nhiễm E coli được tổng hợp dựa trên tình trạng sử dụng kháng sinh như thể hiện trong hình 4.4.
Có 29/72 (40,3%) mẫu vỏ trứng phân lập được E coli ở nhóm không sử dụng kháng sinh Ở nhóm sử dụng kháng sinh, E coli phân lập được ở 39/139
Nghiên cứu cho thấy 29,5% mẫu vỏ trứng có sự hiện diện của vi khuẩn E coli, xuất hiện ở cả đàn gà không sử dụng và sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi Mặc dù tỷ lệ phân lập khác nhau, nhưng nghiên cứu chưa cung cấp thông tin để làm rõ nguyên nhân của sự khác biệt này.
Hình 4.4 Tỷ lệ phân lập E coli ở vỏ trứng theo tình trạng dùng kháng sinh
Nếu trong quá trình nuôi gà, có ít nhất một loại kháng sinh được sử dụng trước thời điểm lấy mẫu, thì đàn gà đó sẽ được phân loại vào nhóm có sử dụng kháng sinh.
4.2.2 Kết quả giám định vi khuẩn E.coli
Với 68 chủng E.coli phân lập được đã tiến hành giám định một số đặc tính sinh hóa chủ yếu Kết quả thể hiện ở bảng 4.3
Bảng 4.3 Chỉ tiêu sinh hóa của Vi khuẩn E.coli STT Chỉ tiêu sinh hóa Số chủng kiểm tra Số chủng (+) Tỷ lệ (+)
Ghi chú:VP: Voges-proskauer, MR: Red Methyl, LCD: Lysine decaboxy holate Dương tính (+)
Các chủng vi khuẩn E.coli được phân lập đều thể hiện đầy đủ các đặc tính sinh hóa theo mô tả trong tài liệu kinh điển (Nguyễn Như Thanh và cs, 1997).
Kết quả kiểm tra sinh hóa được minh họa bởi hình 4.5
Nghiên cứu về đặc điểm kháng kháng sinh của E coli từ thực phẩm đã được thực hiện nhiều, nhưng còn hạn chế đối với E coli phân lập từ trứng Để khắc phục điều này, nghiên cứu đã phân tích khả năng kháng kháng sinh của E coli từ vỏ trứng ở hai nhóm gà: nhóm có sử dụng kháng sinh và nhóm không sử dụng kháng sinh Kết quả chi tiết được trình bày trong mục 4.3.
Kiểm tra tính kháng kháng sinh và xác định gen kháng kháng sinh của vi khuẩn
4.3.1 Đặc điểm kháng kháng sinh của vi khuẩn E coli phân lập được
Nghiên cứu về đặc điểm kháng kháng sinh của E coli, có khoảng 16 loại kháng sinh thường được dùng: Neomycin, Doxycycline, Rifampicin, Amoxicillin, Vancomycin, Nitrofurantoin, Penicillin-G, Ciprofloxacin,
Erythromycin, Gentamicin, Streptomycin, Tetracycline, Oxacillin, Amoxicillin- clavulanic acid, Sufamethoxazole/Trimethoprim, và Colistin (Okorie-Kanu et al.,
Nghiên cứu năm 2016 đã thử nghiệm 9 loại kháng sinh, bao gồm Tetracyclin, Trimethoprim/Sulfamethoxazole, Vancomycin, Ciprofloxacin, Erythromycin, Gentamicin, Nitrofurantoin, Colistin và Amoxicillin-clavulanic acid Kết quả về độ nhạy cảm với kháng sinh được thể hiện trong hình 4.6.
Hình 4.6 Tính mẫn cảm kháng sinh của E coli phân lập từ vỏ trứng
Không gian xung quanh khoanh giấy tẩm kháng sinh mà không có vi khuẩn mọc được gọi là vòng vô khuẩn, biểu thị bằng mũi tên rỗng Ngược lại, loại kháng sinh mà vi khuẩn kháng hoàn toàn không tạo ra vòng vô khuẩn được thể hiện bằng mũi tên đầy.
Kết quả từ hình 4.6 cho thấy các chủng E coli tạo ra vòng vô khuẩn với kích thước khác nhau Đối với hai loại kháng sinh Vancomycin và Erythromycin, các vi khuẩn Gram âm không mẫn cảm, 100% các chủng E coli không hình thành hoặc chỉ tạo vòng vô khuẩn rất nhỏ (< 1 cm) Do đó, phần dưới sẽ tập trung phân tích tính mẫn cảm của các chủng E coli với 7 loại kháng sinh còn lại.
4.3.1.1 Đặc điểm mẫn cảm với từng loại kháng sinh của vi khuẩn E.coli Đặc điểm mẫn cảm với kháng sinh được phân tích theo 3 nhóm tùy thuộc vào mức độ quan trọng của kháng sinh dùng trong điều trị các bệnh nhiễm khuẩn ở người Kết quả được trình bày ở các hình (hình 4.7 và 4.8)
Hình 4.7 Tính mẫn cảm với Ciprofloxacin, Amoxicillin và Colistin
Ghi chú: kết quả được tổng hợp đối với 68 chủng E coli, và được chia thành nhóm không sử dụng kháng sinh và nhóm có sử dụng kháng sinh
Hình 4.8 Kết quả thử tính mẫn cảm với Gentamycin,
Trimethoprim/sulfamethoxazole, Tetracycline và Nitrofurantoin
Kết quả nghiên cứu được tổng hợp từ 68 chủng E coli, chia thành hai nhóm: không sử dụng kháng sinh và có sử dụng kháng sinh Trục Oy thể hiện tỷ lệ phần trăm các chủng thử kháng sinh đồ theo đường kính vòng vô khuẩn (trục Ox) Mỗi loại kháng sinh có vùng màu xám đánh dấu khu vực kháng kháng sinh, với tỷ lệ phần trăm trong vùng này cho thấy mức độ phổ biến của hiện tượng kháng thuốc.
Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ kháng của các chủng vi khuẩn E coli phân lập từ mẫu trứng gà, bất kể việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi, luôn tồn tại với sự khác biệt giữa các loại kháng sinh Cụ thể, vi khuẩn E coli từ vỏ trứng kháng mạnh nhất với Tetracycline, Trimethoprim/Sulfamethoxazole và Colistin, đạt tỷ lệ kháng từ 88,2% đến 95,6% Ngược lại, tỷ lệ kháng với Amoxicillin-clavulanic acid và Nitrofurantoin chỉ dao động từ 14,7% đến 20,6% Các nghiên cứu trước đây cũng xác nhận E coli có tỷ lệ kháng cao với Tetracycline (78,3%) và Trimethoprim (58,7%), đồng thời phù hợp với kết quả hiện tại về mức kháng phổ biến đối với Tetracycline, Trimethoprim và Ciprofloxacin.
4.3.1.2 Đặc điểm mẫn cảm theo tình hình sử dụng kháng sinh
Kết quả phân tích tính mẫn cảm với kháng sinh cho thấy sự khác biệt rõ rệt về mức độ nhạy cảm và kháng thuốc của vi khuẩn được phân lập từ hai nhóm gà: nhóm không sử dụng kháng sinh và nhóm có sử dụng kháng sinh Hình 4.9 minh họa những khác biệt này.
Hình 4.9 So sánh tính mẫn cảm của E coli phân lập từ vỏ trứng ở nhóm không sử dụng và có sử dụng kháng sinh
Mặc dù E coli được phân lập từ đàn gà có sử dụng kháng sinh đều kháng với một số loại thuốc nhất định, nhưng tỷ lệ chủng kháng thuốc ở nhóm không sử dụng kháng sinh luôn thấp hơn Cụ thể, một số kháng sinh như Colistin và Tetracycline cho thấy E coli từ đàn gà có sử dụng kháng sinh kháng 100%, trong khi vẫn còn một tỷ lệ nhỏ chủng E coli từ đàn gà không sử dụng kháng sinh mẫn cảm, với 8,3% đối với Tetracycline và 22,2% đối với Colistin.
Nghiên cứu cho thấy việc sử dụng kháng sinh ở vật nuôi ảnh hưởng đến tính mẫn cảm và kháng của vi khuẩn E coli Kết quả này tương đồng với nghiên cứu năm 2015 (Nguyen et al., 2015), trong đó đã phát hiện mối liên hệ giữa tỷ lệ kháng kháng sinh của E coli phân lập từ các trang trại gà ở vùng đồng bằng sông Mekong và việc sử dụng kháng sinh.
Tình hình sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi ở Việt Nam cho thấy kháng sinh không chỉ được dùng để điều trị mà còn để dự phòng bệnh, với 45,2% người chăn nuôi áp dụng (Pham et al., 2012) Ngoài ra, một số hóa dược như Monensin, Salinomycin và Maduramycin còn được bổ sung để kích thích sinh trưởng (Pham et al., 2012) Việc sử dụng kháng sinh trở nên phức tạp với hàng chục loại khác nhau, phổ biến nhất là Norfloxacin, Tylosin, Gentamicin, Doxycycline, Tiamulin, Colistin và Enrofloxacin Đáng lo ngại là nhiều người chăn nuôi không tuân thủ thời gian ngưng sử dụng thuốc trước khi xuất bán (Duong and Nguyen, 2015) Những yếu tố này đã làm tăng độ khó trong việc kiểm soát kháng kháng sinh, dẫn đến sự gia tăng kháng kháng sinh của vi khuẩn, bao gồm cả E coli trong gia cầm (Cao Thuấn và Lý Thị Liên Khai, 2018; Nguyễn Hồng Sang và cs., 2017).
4.3.1.3 Tính đa kháng kháng sinh của vi khuẩn E.coli phân lập được Ở Việt Nam, nghiên cứu về tính kháng kháng sinh của E coli đã được quan tâm từ rất sớm (Bùi Thị Tho, 1996), vi khuẩn E coli kháng thuốc được phát hiện phổ biến ở động vật nuôi như gà, vịt và lợn (Cao Thuấn and Lý Thị Liên Khai, 2018; Dang và cs.,2018; Dang and Nguyen, 2016; Lê Văn Lê Anh and Lý Thị Liên Khai, 2017; Trương Hà Thái và cs.,2017) Để tìm hiểu về đặc điểm đa kháng kháng sinh của các chủng E coli phân lập từ trứng trong nghiên cứu này, kết quả thử tính mẫn cảm với kháng sinh đã được tổng hợp theo số loại kháng sinh bị kháng (bảng 4.4)
Theo số liệu, hầu hết các chủng E coli phân lập (67/68) đều kháng với ít nhất 2 nhóm kháng sinh khác nhau Đặc biệt, tỷ lệ kháng với 4 loại kháng sinh là cao nhất, đạt 39,7%.
Trong nghiên cứu này, 67 chủng E coli đa kháng kháng sinh được phát hiện có kiểu hình đa dạng, với sự kết hợp chủ yếu của ba loại kháng sinh: Tetracyclin, Trimethoprim/Sulfamethoxazole và Colistin, như thể hiện trong hình 4.7, 4.8 và bảng 4.4.
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra tính đa kháng kháng sinh
TT Số loại kháng sinh bị kháng
Kiểu hình đa kháng Số lượng chủng Tỷ lệ (%)
1 7 CIP, AMC, CT, CN, SXT, TE, F 3 4,4
CIP, AMC, CT, SXT, TE, F 1
3 CIP, AMC, CT, CN, SXT, TE 1
4 CIP, CT, CN, SXT, TE, F 5
AMC, CT, CN, SXT, TE 1
7 CIP, AMC, CT, SXT, TE 2
8 CIP, CT, CN, SXT, TE 10
Ghi chú: Ciprofloxacin (CIP), Amoxicillin-clavulanic acid (AMC), Colistin (CT), Gentamicin (CN),
Trimethoprim/ Sufamethoxazole (SXT), Tetracyclin (TE), Nitrofurantoin (F)
Kết quả nghiên cứu cho thấy E coli đa kháng với nhiều loại kháng sinh, phù hợp với các kết luận từ nhiều nghiên cứu khác nhau trên toàn quốc (Cao Thuấn và Lý Thị Liên Khai, 2018; Lê Văn Lê Anh và Lý Thị Liên Khai, 2017; Nguyễn Hồng Sang và cs., 2017; Trương Hà Thái và cs., 2017).
So sánh tỷ lệ đa kháng kháng sinh của E coli phân lập ở Việt Nam qua các thời kỳ cho thấy rằng vi khuẩn này đã kháng với 6-7 loại kháng sinh từ những năm 1990 (Bùi Thị Tho, 1996) và hiện nay, tỷ lệ đa kháng đang gia tăng, với 85,3% chủng E coli phân lập từ gà nuôi ở vùng đồng bằng sông Mekong cho thấy tình trạng đa kháng kháng sinh nghiêm trọng (Nguyen et al., 2015).
4.3.2 Xác định gen kháng kháng sinh của chủng vi khuẩn phân lập được
