HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM PHẠM LÊ MINH NGHIÊN CỨU MỐI LIÊN HỆ GIỮA SỰ ĐA KHÁNG VƠI TỶ LỆ PHÁT HIỆN GEN KHÁNG CEPHALOSPORIN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP ĐƯỢC... Kết quả xá
Đối tượng, nội dung, nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
- 100 mẫu phân nền chuồng lợn được thu thập từ 50 hộ chăn nuôi lợn ở Thái Bình và 50 hộ tạihuyện Sóc Sơn – Hà Nội (mỗi hộ thu thập 1 mẫu)
- Các dụng cụ, hóa chất, môi trường dùng để nuôi cấy, phân lập và giám định vi khuẩn E.coli, bao gồm môi trường có tính đặc hiệu cao Brilliance
TME.coli/coliform selective medium, Macconkey,…
Oxoid offers a range of antibiotic paper discs, including cefoperazone (CFP, 3rd, 75 µg), ceftriaxone (CRO, 3rd, 30 µg), cefuroxime (CXM, 2nd, 30 µg), ceftazidime (CAZ, 3rd, 30 µg), cefamandole (MA, 2nd, 30 µg), and ACM (amoxicillin 20 µg / clavulanic acid 10 µg).
Nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn E coli kháng cefotaxime trong chất thải lợn thu thập từ nền chuồng nuôi Bên cạnh đó, bài viết cũng phân tích mối tương quan giữa mức độ kháng thuốc nhóm cephalosporin và khả năng sinh ESBL của các chủng E coli được phân lập Cuối cùng, nghiên cứu sẽ phát hiện gen kháng kháng sinh nhóm cephalosporin, bao gồm CTX, TEM, và SHV, trong các chủng vi khuẩn E coli sản sinh ESBL.
Địa điểm nghiên cứu và số mẫu nghiên cứu
Nghiên cứu sẽ tiến hành thu thập 100 mẫu chất thải lợn từ 50 hộ chăn nuôi tại Thái Bình và 50 hộ tại Sóc Sơn, Hà Nội, với mỗi hộ lấy 1 mẫu.
Danh sách hộ chăn nuôi lợn sẽ được lựa chọn ngẫu nhiên từ danh mục do cán bộ địa phương cung cấp Nghiên cứu sẽ được thực hiện tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Vệ sinh thú y thuộc Viện thú y.
coli sản sinh ESBL
Muller Hinton Plate count agar Escherichia coli Men beta-lactamase phổ rộng VOGES- PROSKAUER , METHYL RED
Vi khuẩn Para- amino benzoic Cộng sự
Penton saline water Amoxicillin/clavulanic Nutrient agar
Bảng 2.1 Một số kháng sinh thuộc nhóm Cephalosporin 4
Bảng 3.1 Bảng đánh giá đường kính vòng vô khuẩn 22
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23
Bảng 3.3 Các cặp gen mồi để phát hiện các gen kháng kháng sinh TEM, SHV and CTX-M (Hasman et al 2005) 24
Bảng 4.1 Một số loại thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho lợn tại các hộ chăn nuôi thuộc tỉnh Thái Bình 25
Bảng 4.2 Một số loại thuốc kháng sinh trong phòng và trị bệnh cho lợn tại các hộ chăn nuôi thuộc huyện Sóc Sơn 26
Bảng 4.3 Số lượng mẫu phân nền chuồng lợn thu thập được 27
Bảng 4.4 Kết quả phân lập vi khuẩn E coli kháng cefotaxime 27
Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra sinh hóa của một số chủng vi khuẩn E coli phân lập được ở Thái Bình và Sóc Sơn 28
Bảng 4.6 Tỷ lệ đa kháng thuốc nhóm Cephalosporin của các chủng E Coli được kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh 31
Bảng 4.7 Mối tương quan giữa khả năng đa kháng kháng sinh nhóm cephalosporin và tỷ lệ sản sinh men ESBL của vi khuẩn E coli phân lập được 33
Bảng 4.8 Khả năng sản sinh ESBLcủa các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được tỷ lệ vớikhả năng mẫn cảm kháng sinh cephalosporin 35
Bảng 4.9 Tỷ lệ phát hiện các chủng E.coli mang một hoặc cả hai genes (CTX, TEM) kháng cephalosporin 37
Hình 2.1 Hình ảnh vi khuẩn E.coli trên kính hiển vi điện tử 3
Hình 2.2 Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn 8
Hình 2.3 Vị trí tác động của enzyme beta-lactamse 9
Hình 2.4 Cấu trúc xoắn của một số dẫn chất kiểu gen TEM 10
Hình 2.5 Phân bố của vi khuẩn mang gen ESBL trên thế giới Nam và Trung Mỹ 12
Hình 4.1 Tỷ lệ phát hiện các chủng E coli đa kháng cephalosporin ở phân lợn 33
Hình 4.2 Mối tương quan giữa khả năng đa kháng kháng sinh nhóm cephalosporin và tỷ lệ sản sinh men ESBL của vi khuẩn E coli phân lập được 34
Hình 4.3 Khả năng sản sinh ESBLcủa các chủng vi khuẩn E.coli phân lập được tỷ lệ với khả năng mẫn cảm kháng sinh cephalosporin 35
Hình 4.4 Tỷ lệ các gen kháng cephalosporin được phát hiện từ các chủng E coli sản sinh ESBL 41
Tên tác giả : Phạm Lê Minh
Luận văn này nghiên cứu mối liên hệ giữa sự đa kháng của vi khuẩn Escherichia coli và tỷ lệ phát hiện gen nhóm Cephalosporin Các mẫu vi khuẩn được phân lập từ chất thải của lợn, nhằm tìm hiểu tác động của môi trường chăn nuôi đến sự phát triển của kháng kháng sinh Nghiên cứu này đóng góp vào việc hiểu rõ hơn về tình trạng kháng thuốc trong cộng đồng vi sinh vật và các yếu tố ảnh hưởng đến sự lây lan của gen kháng.
Tên cơ sở đào tạo: Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu là làm rõ mối tương quan giữa mức độ kháng kháng sinh cephalosporin, loại kháng sinh thường dùng trong điều trị bệnh đường tiêu hóa và tiết niệu của vi khuẩn E coli, với khả năng sản sinh men beta-lactamase của các chủng E coli phân lập Nghiên cứu sẽ đánh giá nguy cơ mang gen kháng thuốc của E coli phân lập từ chất thải lợn trong thực tế chăn nuôi hiện nay.
- Phương pháp thu thập mẫu phân lợn tại nền chuồng nuôi
- Phương pháp phân lập vi khuẩn E.coli kháng cefotaxime
- Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm kháng sinh của các chủng vi khuẩn E coli kháng cefotaxime phân lập được
- Phương pháp khoanh giấy đôi (Doulble-disks test)phát hiện các chủng E coli sản sinh ESBL
- Phương pháp PCR phát hiện gen kháng cephalosporin (TEM, CTX, và SHV) của các chủng E coli sản sinh ESBL
- Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả chính và kết luận
1 Tỷ lệ nhiễm E.coli kháng cefotaxime ở chất thải lợn thu thập tại nền chuồng là
82% và tương đương ở cả 2 địa phương Thái Bình và Sóc Sơn
2 Tỷ lệ vi khuẩn E coli mẫn cảm với cả 5 loại kháng sinh nhóm cephalosporin được kiểm tra là 11,4% Tỷ lệ E coli kháng cefotaxime tiếp tục kháng với 1,2,3,4,5 loại kháng sinh khác nhóm cephalosporin có chiều hướng tăng, lần lượt là 7,7%, 6,8%, 19,5%, 34,1%, và 20,5%
3 Tỷ lệ vi khuẩn E Coli phân lập từ phân nền chuồng lợn kháng với ít nhât một loại cephalosporin khác cefotaxime, có khả năng sản sinh men ESBL là 80.5% Nghiên cứu cũng xác định được 100% các chủng kháng với 5 loại kháng sinh cephalosporin thế hệ 2 và 3 có khả năng sinh ESBL và 97.3% các chủng kháng 4 loại thế hệ 2 và 3 có khả năng sản sinh ESBL
4 Tỷ lệ vi khuẩn E coli mang gen CTX và TEM của các chủng E.coli sản sinh
ESBL tại nghiên cứu này lần lượt là 68.8% và 19.8% Trong đó, 61.2% số chủng
E coli sản sinh ESBL chỉ mang gen CTX, 12.1% số chủng chỉ mang gen TEM, và 7.7% số chủng mang đồng thời cả 2 gen CTX và TEM Tại nghiên cứu này chúng tôi không phát hiện chủng E coli mang gen SHV
5 Vi khuẩn E coli kháng với ít nhất 2 trong 5 loại (cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, và cefamandole mang một hoặc cả hai genes (CTX, TEM) Trong đó, các chủng kháng với ceftriaxone và cefuroxime thường mang gen CTX, các chủng E coli kháng với cefuroxime là các chủng mang gen TEM, và các chủng kháng với cefamandole và cefuroxime là những chủng thường mang cả 2 gen CTX và TEM
Master student: Minh Pham Le
Study tittle: Study on the relationship between multi-antibiotic resistance levels and the rate carrying-out Cephalosporin resistance gene of Escherichia coli isolated from pig manure
Field of study: Veterinary Master code: 60 64 01 01 University: Vietnam National Agricultural Academy
This study aims to elucidate the relationship between cephalosporin antibiotic resistance in E coli, commonly associated with gastrointestinal and urinary tract infections, and the prevalence of beta-lactamase enzymes in isolated strains Additionally, it evaluates the risk of E coli resistance gene transmission from pig waste in contemporary pig farming practices.
- Method of pig manure sample collection from floor of pig-pens
- Isolation and identification of cefotaxime resistant E coli
- Method of antibiotic sensitive test of cefotaxime resistant E.coli strains isolated
- Determine ESBL producing E coli strains (Doulble-disks test)
- Detection TEM, CTX, and SHV genes of ESBL producing E coli strains by PCR method
1 The prevalence of cefotaxime resistant E coli in pigs manure was 82% and the same prevalence in both Thai Binh and Soc Son provinces
2 The percentage of E coli susceptible to all five cephalosporin antibiotics was
11.4% The rate of isolated strains resistan to 1,2,3,4,5 other kinds of antibiotics were 7.7%, 6.8%, 19.5%, 34 , 1%, and 20.5%, repectively
3 The percentage of E coli isolated from pig manure resistant to at least one other cephalosporin which produced ESBL was 80% The study also identified that ESBL-producing strains were 100% of resistant strains which resistant to 5 kinds of cephalosporin belong to second generation and 3th generation), and 97.3% strains resistaned to of 4-cephalosporin drugs (belong to 2 nd and 3th generations) produced ESBL
4 The percentage of E coli bacteria that carry the CTX and TEM gene in this study were 68.8% and 19.8%, respectively Of those, 61.2% of ESBL-producing
E coli strains carry only the CTX gene, 12.1% of the strains carry only the TEM gene, and 7.7% of the strains carry both CTX and TEM genes simultaneously In this study we did not detect E coli strains carrying the SHV gene
5 E coli resistant to at least 2 out of 5 kind of antibiotics(cefoperazone, ceftriaxone, cefuroxime, ceftazidime, and cefamandole) carry one or both genes (CTX, TEM) In particular, strains resistant to ceftriaxone and cefuroxime nomally carry the CTX gene, strains resistant to cefuroxime are TEM- carrying strains, and strains resistant to cefamandole and cefuroxime are strains that carry both CTX and TEM genes
1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Lây nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh đang trở thành thách thức lớn đối với hiệu quả điều trị bệnh ở cả vật nuôi và con người trên toàn cầu, đặc biệt là các chủng vi khuẩn mang gen kháng thuốc Tại Việt Nam, tình trạng này đã trở nên phổ biến do việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi không được quản lý chặt chẽ, dẫn đến gia tăng khả năng kháng thuốc Vi khuẩn mang gen kháng thuốc, đặc biệt là trực khuẩn gram âm sản sinh men Extended-spectrum β-lactamases (ESBL), có khả năng lây nhiễm qua plasmid giữa các loài và giống khác nhau.
Vi khuẩn Escherichia coli sống trong đường tiêu hóa của vật nuôi và đang gia tăng khả năng kháng kháng sinh, đặc biệt là những chủng sản sinh men β-lactamase phổ rộng Những chủng này kháng với nhiều loại kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin, nhóm kháng sinh thường được sử dụng để điều trị các bệnh do E coli gây ra ở cả người và vật nuôi (Mark de Been, 2014; George, 2009; Bonet, 2004).
Việc sử dụng kháng sinh trong điều trị bệnh cho vật nuôi không đúng quy định và nhiều loại kháng sinh không đạt tiêu chuẩn đang làm giảm hiệu quả điều trị và gia tăng kháng thuốc ở vi khuẩn Nghiên cứu về vi khuẩn E coli sản sinh men ESBL tại Việt Nam còn hạn chế, chủ yếu chỉ được thực hiện tại một số cơ sở y tế Đề tài "Nghiên cứu mối liên hệ giữa sự đa kháng với tỷ lệ phát hiện gen nhóm Cephalosporin của vi khuẩn Escherichia coli phân lập từ chất thải của lợn" nhằm tìm hiểu mối quan hệ giữa kháng thuốc nhóm cephaloporin và sự xuất hiện gen kháng thuốc ở E coli từ chất thải lợn Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu khoa học, hỗ trợ xây dựng bộ số liệu về vi khuẩn E coli kháng thuốc tại Việt Nam và giúp các cơ quan liên quan đưa ra giải pháp hợp lý trong việc sử dụng kháng sinh, nâng cao hiệu quả điều trị bệnh do E coli gây ra ở lợn.
Nghiên cứu này sẽ làm rõ mối liên hệ giữa mức độ kháng kháng sinh cephalosporin, loại kháng sinh phổ biến trong điều trị bệnh đường tiêu hóa và tiết niệu do vi khuẩn E coli gây ra, và khả năng sản sinh beta-lactamase của các chủng E coli được phân lập Qua đó, nghiên cứu sẽ đánh giá nguy cơ mang gen kháng thuốc của E coli từ chất thải lợn trong thực tiễn chăn nuôi hiện nay.
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI (E coli)
Vi khuẩn Escherichia, được phát hiện lần đầu bởi nhà khoa học Escherich vào năm 1885, là đại diện tiêu biểu của họ vi khuẩn đường ruột Giống Escherichia bao gồm nhiều loại vi khuẩn như E.coli, E.adecarboxylase, E.blattae, E.fergusonii, E.hermanii và E.vulneris Trong số đó, E.coli đóng vai trò quan trọng nhất, chiếm 80% các vi khuẩn hiếu khí ký sinh trong đường ruột của người lớn.
Hình 2.1 Hình ảnh vi khuẩn E.coli trên kính hiển vi điện tử