Nội dung, nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
- Tình hình chăn nuôi gà thịt tại Hà Nội
- Phân lập, xác định tỷ lệ nhiễm vi khuẩn Salmonella spp từ các mẫu phân gà thịt
- Định type huyết thanh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập được.
Nguyên liệu nghiên cứu
* Loại mẫu: Mẫu phân gà nuôi tại các trang trại gà thịt ở khu vực Hà Nội
* Đối tượng nghiên cứu: Giống gà Ross 308, 21 ngày tuổi
* Địa điểm nghiên cứu: Các trại gà nuôi gia công ở khu vực Hà Nội
- Quy mô trại: 5.000-8.000 con /trang trại
- Phương thức chăn nuôi: Chăn nuôi gia công
- Hệ thống chuồng trại: chuồng kín, có các thiết bị máng ăn, máng uống bán tự động hoặc tự động
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ
Tủ ấm được sử dụng với nhiệt độ ổn định (37±0.5) °C và (41.5±0.5) °C, kết hợp với kính hiển vi, đĩa petri, và pipette các loại (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml) Ngoài ra, cần có que cấy, lam kính, và tủ cấy được trang bị đèn UV Để đảm bảo vệ sinh, nồi hấp tiệt trùng hoạt động ở nhiệt độ (121±1) °C với áp suất 1 atm cũng là thiết bị không thể thiếu.
Các thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm tất cả đều được vô trùng tuyệt đối
Buffered Peptone Water (BPW), Muller-Kauffmann Tetrathionate Novobiocin (MKTTn), Rappaport Vassiliadis Soy (RVS), and various agar mediums such as Xylose Lysine Deoxycholate (XLD) agar, Hektoen Enteric (HE) agar, and Nutrient agar (NA) are essential for microbiological analysis Additionally, Triple Sugar Iron (TSI) agar, Lysin Decarboxylase Broth, Christensen's Ure agar, VP Broth, and Tryptophan Medium, along with a 0.85% NaCl solution, play crucial roles in the cultivation and identification of microorganisms in laboratory settings.
- Đĩa giấy O.N.P.G (Thuốc thử phát hiện β-Galactosidaza)
- Sử dụng chủng chuẩn Salmonella enteritidis ATCC ®13076 TM
Phương pháp nghiên cứu
Sử dụng phương pháp thống kê chuyên môn
- Túi nilon vô trùng , ticker dán mẫu, bút viết kính, dây chun, thùng xốp có chứa đá lạnh để vận chuyển mẫu
Hình 3.1 Trang trại gà thịt, huyện Ba Vì, Hà Nội
Hình 3.2 Trang trại gà thịt, huyện Chương Mỹ, Hà Nội
Để lấy mẫu từ gà, trước tiên cần cố định gà và sử dụng bông cồn để lau sạch vùng lỗ huyệt Sau đó, dùng tăm bông vô trùng đưa vào lỗ huyệt và ngoáy nhẹ nhàng Chuyển tăm bông vào ống fancol chứa môi trường thạch Carry Blaird, bẻ bỏ phần tăm đã cầm tay và cho ống vào túi nilon buộc chặt hai lớp Ghi thông tin lên giấy và dán lên mẫu, bảo quản ở nhiệt độ 2-8 độ C, và vận chuyển mẫu về phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu.
Trong đó 1 mẫu gồm 20 que tăm bông/ 1 chuồng (1 chuồng có 4 ô, mỗi ô bắt ngẫu nhiên 5 con gà ở 5 vị trí khác nhau)
Hình 3.3 Cố định gà để lấy mẫu
Hình 3.4 Mẫu được bảo quản lạnh trong thùng xốp
3.3.3 Phương pháp nuôi cấy và giám định vi khuẩn Salmonella spp
Nuôi cấy, phân lập và giám định Salmonella theo TCVN 4829:2005/SĐ
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập vi khuẩn Salmonella T Ă N G S IN H C H Ọ N L Ọ C Đ Ổ Đ ĨA V À N H Ậ N D Ạ N G K H Ẳ N G Đ ỊN H
Mẫu + dung dịch đệm pepton Ủ ở 37 o C ± 1 o C/ 18 h ± 2 h
0.1 ml chủng cấy + 10 ml môi trường RVS Ủ trong 24h ± 3h ở 41.5 o C ± 1 o C
1 ml chủng cấy + 10 ml môi trường MKTTn Ủ trong 24h ± 3h ở 37 o C ± 1 o C
Môi trường XLD và môi trường thạch thứ hai Ủ trong 24h ± 3h ở
Từ mỗi đĩa thử một khuẩn lạc đặc trưng Nếu âm tính, thử bốn khuẩn lạc khác đã được đánh dấu
Khẳng định huyết thanh Khẳng định sinh hóa
Bảng 3.1 Cấu trúc kháng nguyên và các kháng huyết thanh đặc hiệu cần ngưng kết để định type của một số chủng Salmonella gây bệnh quan trọng
Tên chủng Cấu trúc kháng nguyên
(Nguồn: Lab gốc giống và sinh phẩm chẩn đoán, Khoa sản xuất, Viện Pasteur TP HCM)
Tiến hành xét nghiệm
Mẫu đã được chuẩn bị đảm bảo tiêu chuẩn để gửi đến phòng xét nghiệm
+ Tăng sinh sơ bộ trong môi trường lỏng không chọn lọc
Bổ sung dung dịch đệm pepton ở nhiệt độ phòng vào ống mẫu có chứa môi trường vận chuyển Carry Blaird, sau đó ủ ở (36 ± 2) 0 C trong (18 ± 2) giờ
+ Tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc
Lắc ống mẫu trên máy lắc để trộn đều dịch tăng sinh trong môi trường không chọn lọc Sau đó, sử dụng pipet vô trùng để hút 0,1 ml dịch tăng sinh và cho vào 10 ml môi trường Rappaport-Vassiliadis (RVS) Tiếp theo, hút 1 ml dịch tăng sinh và cho vào 10 ml môi trường Muller Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn).
Môi trường RVS được ủ ở nhiệt độ 41.5 ± 1 °C trong 24 ± 3 giờ, trong khi môi trường MKTTn được ủ ở 37 ± 1 °C cũng trong khoảng thời gian tương tự Sau quá trình ủ, canh trùng xuất hiện đồng đều, với một lớp màng mỏng trên bề mặt môi trường và cặn lắng ở đáy ống nghiệm.
Hình 3.5 Salmonella trên môi trường MKTTn và RVS
+ Đỗ đĩa và nhận dạng
Lắc đều các ống nghiệm chứa môi trường RVS và MKTTn, sau đó dùng que cấy vòng để cấy dịch tăng sinh từ môi trường lỏng vào hai môi trường đặc là Xylose lysine deoxycholate agar (XLD agar) và Hektoen Enteric agar (HE agar) Thạch XLD và HE được ủ ở nhiệt độ 37 ±.
1) 0 C trong (24 ± 3) giờ Sau thời gian ủ, quan sát khuẩn lạc trên các môi trường
Môi trường XLD tạo ra khuẩn lạc có hình dạng tròn, lồi và trong suốt, với khả năng xuất hiện tâm đen, đôi khi tâm đen này lớn đến mức bao phủ toàn bộ khuẩn lạc, làm cho môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.
Môi trường HE cho thấy khuẩn lạc có màu sắc biến đổi từ xanh dương sang xanh lục, có thể xuất hiện tâm đen hoặc không Đôi khi, tâm đen có kích thước lớn, bao trùm toàn bộ khuẩn lạc.
Qua các bước tiền tăng sinh, tăng sinh chọn lọc và phân lập thì tế bào
Salmonella cần được phục hồi trong các môi trường thạch dinh dưỡng để tăng sinh khối, do chúng bị già và suy thoái Từ mỗi môi trường phân lập, cần chuyển ít nhất 5 khuẩn lạc đặc trưng sang môi trường dinh dưỡng như TSA.
Nutrient Agar Ủ ở 37 0 C trong 18 – 24 giờ Dùng sinh khối trên môi trường dinh dưỡng này để thử phản ứng sinh hóa và huyết thanh
3.4.3.1 Phản ứng trên môi trường TSI
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar lên phần nghiêng của môi trường TSI agar bằng que cấy vòng, sau đó dùng que cấy thẳng để đâm sâu xuống đáy môi trường Mẫu được ủ ở nhiệt độ (37± 1) °C trong thời gian (24 ± 3) giờ.
+ Salmonella spp cho phản ứng kiềm ở phần bề mặt nghiêng của ống môi trường (cho màu đỏ)
+ Phản ứng acid ở phần đáy (màu vàng) glucose dương tính có sinh khí, có sinh H2S (thạch bị đen)
3.4.3.2 Phản ứng Voges-Proskauer (VP)
- Chuẩn bị môi trường VP broth Hút vào mỗi ống nghiệm 3ml môi trường
- Dùng que cấy tròn cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ thạch Nutrient agar (NA) vào 3ml môi trường VP broth Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ
Sau khi ủ mẫu trong ống môi trường, thêm 2 giọt dung dịch creatin, 3 giọt Alpha-napthol 5% và 2 giọt KOH 40% Lắc nhẹ hỗn hợp và để yên trong 15 phút trước khi quan sát màu sắc của ống môi trường.
- Kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-), môi trường không đổi màu + Nếu phản ứng (+): dung dịch màu hồng đến màu đỏ sáng
+ Nếu phản ứng (-): dung dịch không đổi màu
- Chuẩn bị môi trường Trytophan Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào môi trường Trytophan bằng cách sử dụng que cấy tròn Sau khi cấy, ủ ở nhiệt độ 37 ± 1 độ C trong thời gian 24 ± 3 giờ để đạt được kết quả tối ưu.
- Sau khi ủ thêm 1ml thuốc thử Kovacs’Indol
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-),
+ Nếu phản ứng (+): dung dịch màu hồng đến màu đỏ sáng
+ Nếu phản ứng (-): dung dịch không đổi màu
- Chuẩn bị môi trường Lysine decarboxylase broth Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào 5ml môi trường Lysin decarboxylase broth Ủ ở (37 ± 1) 0 C trong (24 ± 3) giờ
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (+)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường nuôi cấy đục và có màu tím
+ Nếu phản ứng (-): Môi trường nuôi cấy có màu vàng
- Chuẩn bị môi trường thạch Urea Hút vào mỗi ống nghiệm 5ml môi trường
- Cấy khuẩn lạc nghi ngờ Salmonella spp từ thạch Nutrient agar (NA) vào môi trường thạch Urea Ủ ở 37 0 C ± 1 0 C trong 24 giờ ± 3 giờ
- Đọc kết quả: Salmonella spp cho phản ứng (-)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường nuôi cấy có màu hồng, sau đó đỏ hồng + Nếu phản ứng (-): Môi trường nuôi cấy không đổi màu
3.4.3.6 Phát hiện β-galactosidase (sử dụng đĩa giấy O.N.P.G)
- Cho đĩa giấy O.N.P.G vào ống nghiệm chứa 0,1 ml nước muối 0.85%
- Cấy 1 vòng sinh khối vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường
NA vào ống nghiệm chứa NaCl 0.85% và đĩa giấy O.N.P.G
- Ủ ống nghiệm ở (36±1) 0 C/ (24±3) h trong bể điều nhiệt, phản ứng thường xuất hiện sau từ 1-6 giờ
- Salmonella sẽ cho phản ứng β-galactosidase (-)
+ Nếu phản ứng (+): Môi trường có màu vàng
+ Nếu phản ứng (-): Môi trường không đổi màu
Bảng 3.2 Giải thích các phép thử sinh hóa P hé p th ử* (3 4 3 1 đ ến 3 4 3 6 )
Các chủng Salmonella, bao gồm Salmonella Typhi và Salmonella Paratyphi, có phản ứng khác nhau đối với các loại đường như glucose, lactose và sucrose Theo tài liệu tham khảo, các tỷ lệ phần trăm phản ứng cho thấy không phải tất cả các loại huyết thanh Salmonella đều có phản ứng dương tính hoặc âm tính với từng loại đường Đặc biệt, Salmonella Typhi cho thấy phản ứng mạnh với glucose, trong khi phản ứng với lactose và sucrose lại yếu hơn Nghiên cứu về các chủng này cần tiếp tục được thực hiện để xác định rõ hơn về đặc tính sinh học và khả năng kháng thuốc của chúng.
3.4.4 Khẳng định huyết thanh & type huyết thanh
Việc phát hiện sự có mặt của Salmonella kháng nguyên O, kháng nguyên
Vi và kháng nguyên H được kiểm tra qua phương pháp ngưng kết trên phiến kính sử dụng huyết thanh phù hợp, sau khi đã loại trừ các chủng có khả năng tự ngưng kết từ các khuẩn lạc thuần khiết.
3.4.4.2 Loại trừ chủng tự ngư ng k ết
Cho một giọt dung dịch nước muối sinh lý 0,85% NaCl lên phiến kính thuỷ tinh sạch Dùng que cấy vòng trộn đều dung dịch với khuẩn lạc cần thử để thu được huyền phù đục và đồng nhất Lắc nhẹ phiến kính từ 30 đến 60 giây và quan sát kết quả trên nền tối, tốt nhất là dùng kính lúp Nếu vi khuẩn có hiện tượng tự ngưng kết, chủng này sẽ không cần thử nghiệm tiếp vì không thể phát hiện kháng nguyên Nếu huyền dịch vẫn đục đều, sẽ tiến hành giám định theo các bước tiếp theo.
Sử dụng khuẩn lạc thuần khiết không tự ngưng kết, thực hiện theo phương pháp 3.4.4.2 với một giọt huyết thanh kháng nguyên O thay cho dung dịch nước muối sinh lý Nếu có hiện tượng ngưng kết, phản ứng sẽ được xác định là dương tính Tiến hành lần lượt với huyết thanh đa giá và đơn giá.
3.4.4.4 Kiểm tra kháng nguyên Vi
Tiến hành theo 3.4.4.2 nhưng sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên Vi Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính
Cấy khuẩn lạc thuần khiết không có khả năng tự ngưng kết vào môi trường thạch dinh dưỡng nửa đặc Semi-solid nutrient ager Ủ ở 37 °C trong 24 h ± 3h
Sử dụng chủng cấy này để kiểm tra kháng nguyên H, tiến hành theo 3.4.4.2 nhưng sử dụng một giọt huyết thanh kháng nguyên H
Nếu xuất hiện ngưng kết thì phản ứng được xem là dương tính
Có hay không có Salmonella trong mẫu
Bảng 3.3 Giải thích các kết quả các phép thử khẳng định
Phản ứng huyết thanh Giải thích Điển hình Không Kháng nguyên O,
Các chủng được coi là
Salmonella Điển hình Không Tất cả các phản ứng âm tính
Có thể là Salmonella Điển hình Có Không thử nghiệm
Phản ứng không điển hình Không/ Có Kháng nguyên O,
Vi hoặc H dương tính Phản ứng không điển hình Không/ Có Tất cả các phản ứng âm tính
Các chủng Salmonella được lấy sinh khối từ môi trường thạch dinh dưỡng và bảo quản trong ống eppendorf có bổ sung Tryptic Soy Broth (TSB) và glycerin 80% theo tỉ lệ 0.8 ml : 0.2 ml Mẫu này được lưu trữ ở nhiệt độ -20°C để duy trì giống Để xác nhận định danh Salmonella, các mẫu cần được gửi đến trung tâm chuẩn Salmonella đã được công nhận.
Kiểm soát kết quả xét nghiệm
Thực hiện mẫu đối chứng âm, mẫu đối chứng dương và mẫu trắng Mẫu dương được thực hiện bằng cách nhiễm 1ml chủng chuẩn có nồng độ pha loãng
Để thực hiện mẫu âm, hãy pha loãng 1ml chủng chuẩn không phải Salmonella (sử dụng E.coli) với nồng độ 10 -2 và làm theo hướng dẫn Đối với mẫu trắng, bạn cần thêm 1ml nước muối sinh lý vào mẫu và cũng thực hiện theo hướng dẫn.
Xác nhận định danh Salmonella
Các chủng vi khuẩn Salmonella sẽ được xác định type huyết thanh thông qua phương pháp White-Kauffmann theo tiêu chuẩn của WHO (1983).
- Bộ kháng huyết thanh Salmonella
- Các môi trường, hóa chất, dụng cụ, trang thiết bị phòng thí nghiệm
* Chuẩn bị vi khuẩn Salmonella
Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella từ môi trường đặc hiệu, ria cấy lên ống thạch Nutrient agar đã chuẩn bị, ủ ở 37 o C / 24 giờ
Thử kháng huyết thanh đa giá poly O
• Nhỏ 1 giọt khỏng huyết thanh Salmonella polyvalent O (20 àl) lờn phiến kính
• Nhỏ 1 giọt nước sinh lý lên vị trí khác trên phiến kính
• Lấy 1 ít vi khuẩn Salmonella đã nuôi cấy qua đêm trên môi trường Nutrient agar trộn đều vào 2 giọt kháng huyết thanh và nước sinh lý trên phiến kính
• Lắc nhẹ phiến kính 5-10s (20 lần)
Phản ứng dương tính: Có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti
Phản ứng âm tính: Huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục
Nhóm đơn giá kháng huyết thanh O
Tiến hành với các nhóm OMA, OMB, OMC, tương tự kháng huyết thanh poly O Với nhóm cho phản ứng dương tính, tiếp tục với các kháng huyết thanh
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ phân type kháng nguyên O
+ Nếu chủng âm tính với OMA, OMB, OMC, thì cần phải làm phản ứng tiếp theo với OMD, OME, OMF và OMG
+ Nếu chủng ngưng kết với OMA, tiếp tục kiểm tra với nhóm 2; 4; 9; 9,46; 3,10; 1,3,19; 21
+ Nếu chủng ngưng kết với OMB, tiếp tục kiểm tra với nhóm 7; 8; 11; 13; 6,14
+ Nếu chủng ngưng kết với OMC, tiếp tục kiểm tra với nhóm 16; 17; 18; 28; 30; 35; 38
+ Nếu chủng ngưng kết với OMD, tiếp tục kiểm tra với nhóm 39; 40; 41; 42; 43; 44; 45
+ Nếu chủng ngưng kết với OME, tiếp tục kiểm tra với nhóm 47; 48; 50; 51; 52; 53; 61
+ Nếu chủng ngưng kết với OMF, tiếp tục kiểm tra với nhóm 54, 55, 56,
+ Nếu chủng ngưng kết với OMG, tiếp tục kiểm tra với nhóm 60, 62, 63,
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ phân type kháng nguyên H
Nhiều chủng Salmonella có hai pha kháng nguyên H, nhưng trong vi khuẩn Salmonella nuôi cấy thường chỉ thấy một pha Để phát hiện pha hai, cần ức chế sự xuất hiện của pha một bằng cách nhỏ một giọt kháng huyết thanh ức chế pha một vào đĩa thạch Sven Gard.
Pha 1: Tiến hành tương tự như kháng nguyên O với kháng huyết thanh đa giá poly H, kháng huyết thanh nhóm H (HMA, HMB, HMC), kháng huyết thanh đơn giá H
Để chuẩn bị thạch Sven Gard, bạn cần sử dụng môi trường bán cố thể có sẵn trên thị trường và pha chế theo hướng dẫn của nhà sản xuất Sử dụng đĩa petri có đường kính 9mm, trước khi đổ thạch, hãy nhỏ 1 giọt Anti Sven Gard Serum để ức chế pha 1 Lưu ý rằng loại Anti Sven Gard Serum sẽ khác nhau tùy thuộc vào pha 1, bao gồm SG1, SG2, SG3, SG4, SG5 và SG6.
SG1: ức chế Ha, Hb, Hc, H z10
SG2: ức chế Hd, Hi, He,h
SG3: ức chế Hk, Hy, Hl,w, Hl,z13, Hl,z26
SG4: ức chế Hr, Hz
SG5: ức chế He,n,x, He,n,z15
Sử dụng que cấy vô trùng, lấy một lượng nhỏ vi khuẩn đã xác định kháng nguyên H pha 1 và nhẹ nhàng chấm lên bề mặt thạch tại vị trí trung tâm của đĩa thạch Sven gard.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1
Bảng 3.4 Kháng huyết thanh ức chế Kháng nguyên H pha 1
STT Kháng huyết thanh Các kháng nguyên H pha 1 bị ức chế
(Ví dụ: Kháng nguyên H pha 1 xác định là Ai thì dùng SG2 để ức chế A)
Phương pháp xử lý số liệu
Các kết quả thu thập được xử lý bằng toán thống kê sinh vật học, sử dụng phần mềm Excell 2007.
Kết quả nghiên cứu và thảo luận
Tình hình chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
4.1.1 Khái quát về các điều kiện tự nhiên, kinh tế- xã hội ảnh hưởng tới chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
4.1.1.1 Khái quát về các điều kiện tự nhiên
Các trang trại gà thịt nghiên cứu được đặt tại các huyện ngoại thành của thành phố Hà Nội, bao gồm Sơn Tây, Ba Vì, Quốc Oai và Thạch Thất.
Mỹ Đức và Chương Mỹ nằm trong khoảng vĩ độ Bắc từ 20034’ đến 21018’ và kinh độ Đông từ 104017’ đến 1060 Khu vực này tiếp giáp với Hưng Yên ở phía Đông, Hà Nam ở phía Đông Nam, Hòa Bình ở phía Tây Nam, cùng với Vĩnh Phúc và Phú Thọ ở phía Tây Bắc và phía Bắc.
Hà Nội, nằm ở trung tâm châu thổ Sông Hồng, là nơi hội tụ của các mạch núi Tây Bắc và Đông Bắc, như Hoàng Liên Sơn, Con Voi, và Tam Đảo Với diện tích 3.323,6 km², Hà Nội có nhiều lợi thế về điều kiện tự nhiên và tài nguyên, góp phần phát triển kinh tế, xã hội và văn hóa Thành phố là đầu mối giao thương quan trọng với các tuyến đường bộ, đường sắt, hàng không và đường sông kết nối với các vùng khác trong nước và quốc tế Tuy nhiên, sự giao lưu này cũng tạo ra thách thức trong công tác phòng chống dịch bệnh cho gia súc và gia cầm do nguy cơ lây lan mầm bệnh qua các trục giao thông Địa hình Hà Nội chủ yếu gồm đồng bằng và đồi núi, với đồng bằng chiếm khoảng 3/4 diện tích, thuận lợi cho phát triển chăn nuôi, đặc biệt là chăn nuôi gà.
Khí hậu Hà Nội đặc trưng cho kiểu khí hậu Bắc bộ với khí hậu nhiệt đới gió mùa ẩm, mùa hè nóng và mưa nhiều, trong khi mùa đông lạnh và mưa ít Nằm trong vùng nhiệt đới, Hà Nội nhận được lượng bức xạ mặt trời dồi dào với nhiệt độ trung bình hàng năm đạt 23,6ºC Độ ẩm tương đối trung bình hàng năm là 79%, với lượng mưa trung bình khoảng 1800mm và 114 ngày mưa mỗi năm Sự khác biệt rõ nét giữa hai mùa nóng và lạnh là đặc điểm nổi bật của khí hậu Hà Nội, với mùa nóng từ tháng 5 đến tháng 9 có nhiệt độ trung bình là 29,2ºC.
Từ tháng 11 đến tháng 3 năm sau, Hà Nội trải qua mùa đông với thời tiết khô ráo và nhiệt độ trung bình khoảng 15,2ºC Giữa mùa đông và mùa hè có hai thời kỳ chuyển tiếp vào tháng 4 và tháng 10, giúp Hà Nội có đủ bốn mùa Xuân, Hạ, Thu, Đông Khu vực Hà Tây (cũ) kết hợp với Hà Nội tạo ra những đặc điểm địa hình riêng, hình thành các tiểu vùng khí hậu như vùng núi, vùng gò đồi và đồng bằng Tuy nhiên, sự khác biệt về thời tiết và chênh lệch nhiệt độ giữa các địa phương trong Hà Nội hiện nay không lớn.
4.1.1.2 Khái quát về các điều kiện kinh tế- xã hội
Hà Nội, với dân số ước tính 7.558.965 người vào cuối năm 2015, là thành phố đông dân thứ hai tại Việt Nam, chiếm hơn 8% tổng dân số cả nước Thành phố đang trong giai đoạn cơ cấu dân số vàng, tạo điều kiện thuận lợi cho nguồn nhân lực phục vụ các hoạt động kinh tế - xã hội Hà Nội bao gồm 12 quận, 1 thị xã và 17 huyện, với lượng dân cư đông đảo và ngày càng nhiều người có tri thức, đây là tiềm năng lớn thúc đẩy sự phát triển kinh tế xã hội, đặc biệt là trong lĩnh vực phát triển kinh tế nông thôn và chăn nuôi.
Mặc dù đối mặt với nhiều khó khăn như thời tiết khắc nghiệt, dịch bệnh ở gia súc, gia cầm và suy thoái kinh tế, sản xuất nông nghiệp tại Thủ đô vẫn tiếp tục phát triển Tổng giá trị sản xuất nông, lâm, ngư nghiệp ước đạt 33.640 tỷ đồng, cho thấy những kết quả đáng khích lệ trong bối cảnh hiện tại.
Tính đến năm 2010, lĩnh vực chăn nuôi và thủy sản chiếm tỷ lệ 55,89%, trong khi dịch vụ chỉ đạt 2,97% Giá trị sản phẩm nông nghiệp thu hoạch trên mỗi hecta đất nông nghiệp ước đạt 233 triệu đồng Hệ thống hạ tầng nông thôn đã được nâng cấp và đổi mới, bao gồm việc củng cố hệ thống đê điều và công trình thủy lợi, nhằm đảm bảo an toàn trong sản xuất, phòng chống lụt bão và khắc phục thiên tai Những cải thiện này đã nâng cao đời sống vật chất và tinh thần của nông dân, góp phần vào việc giữ vững an ninh chính trị và phát triển kinh tế - xã hội trong khu vực.
4.1.2 Tình hình phát triển chăn nuôi gà thịt tại khu vực Hà Nội
Hình 4.1 Trang trại gà thịt, huyện Quốc Oai, Hà Nội
Thủ đô Hà Nội sở hữu điều kiện tự nhiên đa dạng với 150 nghìn ha đất đồi gò, 125 nghìn ha đất bãi phù sa, 35 nghìn ha đất đồng bằng và phần còn lại là đất trũng Sự thuận lợi này đã tạo điều kiện cho ngành nông nghiệp phát triển, đặc biệt là chăn nuôi gia cầm, trong đó chăn nuôi gà thịt của thành phố Hà Nội đã có những chuyển biến tích cực trong những năm gần đây nhờ sự hỗ trợ đồng bộ từ các cấp, các ngành.
Bảng 4.1 Số lượng trang trại tại khu vực Hà Nội từ năm 2012-2015
(Nguồn: Tổng cục thống kê Hà Nội, 2016)
Bảng 4.2 Số lượng gia cầm tại khu vực Hà Nội từ năm 2012-2015
Số gia cầm 17996 21244 21616 21801 ĐVT: Triệu con (Nguồn: Tổng cục thống kê Hà Nội, 2016)
Quy mô chăn nuôi gà thịt hiện nay chủ yếu nằm trong khoảng từ 2.000-5.000 con/trang trại, chiếm 68,8% tổng số trang trại Các quy mô khác bao gồm từ 5.000-8.000 con (20,6%), từ 8.000-11.000 con (4,2%), từ 11.000-15.000 con (3,4%) và trên 15.000 con (3,4%) Về đất trang trại, phần lớn được xây dựng trên đất vườn nhà và đất nông nghiệp, với diện tích phổ biến từ 1-2 ha/trang trại.
Hình 4.2 Trang trại gà thịt, Thị xã Sơn Tây, Hà Nội
Vốn đầu tư cho chăn nuôi trang trại : Bình quân đầu tư chuồng trại, trang thiết bị, con giống đối với chăn nuôi gà thịt 50-60 triệu đồng/1.000 con gà
Về giống: Hầu hết các giống cao sản của thế giới đều được nhập khẩu và nuôi ở trang trại như là: hướng thịt USA, Hubbard, Lohmann, AA, Cobb, Ross
Nhiều trang trại hiện nay đã đầu tư mạnh mẽ vào chuồng trại và thiết bị chăn nuôi theo tiêu chuẩn tiên tiến, kết hợp với việc sử dụng giống cao sản Kiểu chuồng phổ biến là chuồng sàn 1-2 tầng với hệ thống làm mát, mang lại nhiều ưu điểm nhờ chi phí đầu tư hợp lý và vật liệu tiết kiệm Một số ít trang trại lựa chọn chuồng kín và chuồng kiên cố, trang bị các thiết bị máng ăn và máng uống bán tự động hoặc tự động.
Năng suất chăn nuôi hiện nay đã có sự cải thiện rõ rệt so với phương thức truyền thống, nhờ vào việc áp dụng giống ngoại và giống cải tiến, cùng với công nghệ chăn nuôi tiên tiến và thức ăn công nghiệp Cụ thể, thời gian nuôi gà thịt công nghiệp chỉ kéo dài từ 42-49 ngày mỗi lứa, với khối lượng xuất chuồng đạt từ 2,3-2,4 kg mỗi con, và tiêu tốn từ 2,1-2,3 kg thức ăn cho mỗi kg tăng trọng.
Trong chăn nuôi trang trại hiện nay, có ba phương thức tiêu thụ sản phẩm chính: tự sản tự tiêu, tiêu thụ qua thương lái, và tiêu thụ qua chăn nuôi gia công Gần đây, phương thức tiêu thụ thông qua các hợp tác xã cũng đang bắt đầu hình thành.
Tự sản tự tiêu là hình thức phổ biến trong các trang trại quy mô, trong đó chủ trang trại tự bỏ vốn đầu tư, kinh doanh và tiêu thụ sản phẩm Mặc dù có thể mang lại lợi nhuận cao và giúp người chăn nuôi tự chủ trong kinh doanh, hình thức này cũng gặp nhiều hạn chế như thiếu vốn đầu tư, khó khăn trong tiêu thụ sản phẩm, thiếu hỗ trợ kỹ thuật và rủi ro cao, đặc biệt khi xảy ra dịch bệnh.
Người chăn nuôi thường phải bán sản phẩm thông qua thương lái, dẫn đến việc họ dễ bị ép giá, đặc biệt trong những thời điểm cung vượt cầu hoặc khi gặp dịch bệnh.
Tỷ lệ phân lập và kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt
4.2.1 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn Salmonella spp ở mẫu phân gà thịt
Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella spp từ 120 mẫu phân gà thịt được nuôi tại các trang trại ở khu vực Hà Nội, được trình bày ở bảng sau:
Bảng 4.3 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà Địa điểm
Kết quả từ bảng 4.3 cho thấy trong 120 mẫu phân gà được xét nghiệm, có 22 mẫu dương tính với vi khuẩn Salmonella, chiếm tỷ lệ 18,33% Tỷ lệ phân lập Salmonella cao nhất được ghi nhận ở Thị xã Sơn Tây với 40,00%, tiếp theo là huyện Quốc Oai với 27,78% và huyện Thạch Thất với 25,00% Trong khi đó, các huyện Mỹ Đức, Chương Mỹ và Ba Vì có tỷ lệ mẫu dương tính lần lượt là 13,33%, 8,11% và 6,67%.
Biểu đồ 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà
Kết quả phân lập cho thấy sự khác biệt rõ rệt về tỷ lệ Salmonella trong mẫu phân gà thịt ở các trang trại tại Hà Nội Thị xã Sơn Tây ghi nhận tỷ lệ mẫu dương tính cao nhất trong 6 địa điểm nghiên cứu Tại 15 trại gà thịt ở Sơn Tây, một số trại có cơ sở vật chất và trang thiết bị như máng ăn, máng uống còn thô sơ, và vấn đề an toàn sinh học chưa được đảm bảo, dẫn đến tỷ lệ nhiễm Salmonella cao ở gà.
Mỹ có số lượng trại gà lớn nhất trong nghiên cứu, nhưng chỉ có 3/37 trại bị nhiễm Salmonella Các trang trại gà ở huyện Chương Mỹ được trang bị máng ăn và máng uống hiện đại, cùng với quy trình vệ sinh chuồng trại nghiêm ngặt trước khi nhập gà, đảm bảo an toàn sinh học Kết quả nghiên cứu cho thấy mô hình chăn nuôi và các yếu tố liên quan đến an toàn sinh học, như nguồn cung cấp gà, quy trình sát trùng chuồng trại, và chăm sóc, có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ nhiễm Salmonella tại các trại gà thịt.
Biểu đồ 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella trong phân gà
Salmonella là vi khuẩn có khả năng kháng cao và thích ứng tốt, gây bệnh cho nhiều loại động vật, đặc biệt là gia cầm Tỷ lệ phân lập Salmonella ở các trại gà không có triệu chứng bệnh cho thấy tình trạng mang trùng trong đàn, làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh Việc phát hiện Salmonella trong mẫu phân gà không chỉ đe dọa sức khỏe vật nuôi mà còn ảnh hưởng đến chất lượng thịt và trứng gà, đặc biệt là ở các đàn gà thịt nuôi theo quy mô công nghiệp trước khi được đưa vào chế biến thực phẩm.
Salmonella có nguy cơ ảnh hưởng đến chất lượng thịt thương phẩm và các sản phẩm của thịt gà trong quá trình chế biến giết mổ
Theo báo cáo của Tổ chức an toàn vệ sinh thực phẩm châu Âu năm 2010, sự lưu hành Salmonella ở gia cầm từ 0 tới 26.6 % Ở các nước phát triển như
Mỹ, Anh, sự lưu hành Salmonella trên thịt gà là 4.2 % (n!2), và 4 % (n7)
Tại Việt Nam, tỷ lệ Salmonella trong gia cầm thấp hơn so với nhiều quốc gia Đông Nam Á như Thái Lan (57%), Campuchia (88.2%) và Trung Quốc (52.2%), nhưng lại cao hơn so với Malaysia (35.5%).
4.2.2 Kết quả giám định một số đặc tính sinh vật, hóa học của các chủng
Salmonella spp phân lập từ mẫu phân gà thịt
Tất cả các chủng Salmonella spp được phân lập đều đã được đánh giá sơ bộ dựa trên các đặc điểm hình thái và tính chất nuôi cấy Để xác định serotype và đánh giá chính xác, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các đặc tính sinh vật và hóa học của chúng trên các môi trường giám định.
Kết quả cho thấy 100% chủng Salmonella spp nghiên cứu đều mọc và phát triển tốt trên các môi trường với những đặc điểm như sau:
- Môi trường XLD: Vi khuẩn Salmonella spp hình thành khuẩn lạc kích thước nhỏ, đường kính trung bình 0,5-1,5 mm, màu đen, trên nển môi trường màu sáng đỏ (hình 4.8)
Hình 4.4 Salmonella trên môi trường XLD
Trong môi trường HE, vi khuẩn Salmonella phát triển thành các khuẩn lạc có màu sắc biến đổi từ xanh dương đến xanh lục, có thể có hoặc không có tâm đen Đôi khi, tâm đen có thể lớn đến mức bao trùm toàn bộ khuẩn lạc.
- Trên môi trường TSI: Các chủng Salmonella làm mặt thạch nghiêng chuyển màu đỏ, đáy màu vàng hoặc màu đen (sản sinh H2S) (hình 4.10)
Bài viết trình bày kết quả kiểm tra hình thái, khả năng di động, tính chất bắt màu, đặc tính sinh vật và hóa học của 22 chủng Salmonella spp được phân lập từ mẫu phân gà thịt Các thông tin chi tiết được tóm tắt trong bảng 4.4.
Hình 4.5 Salmonella trên môi trường HE
Hình 4.6 Salmonella trên môi trường TSI và Lysine
Kết quả từ bảng 4.3 và 4.4 cho thấy 100% các chủng Salmonella spp phân lập là trực khuẩn, bắt màu Gram âm và có khả năng di động Tất cả các chủng này đều có các đặc tính sinh hóa đặc trưng: sinh H2S trên môi trường TSI, không sản sinh indole, và cho kết quả âm tính với phản ứng VP, β-galactosidase và ureaza Đặc biệt, phản ứng Lysine decarboxylase dương tính, cho thấy khả năng khử carboxyl của Lysine thành Cadaverin, làm môi trường chuyển từ màu hồng sang màu tím nhờ chỉ thị Bromocresol.
Bảng 4.4 Đặc tính sinh vật, hoá học của các chủng Salmonella sppphân lập từ mẫu phân gà thịt trên một số môi trường
STT Môi trường nuôi cấy Đặc tính Tỷ lệ (%)
Bảng 4.5 Biểu hiện đặc trưng của Salmonella trong các phản ứng sinh hóa
Thử nghiệm Môi trường Biểu hiện đặc trưng
Phần thạch nghiêng màu đỏ, đáy ống nghiệm màu vàng, nứt thạch và xuất hiện vạch đen
VP VP Không đổi màu khi nhỏ α – napthol 5% và KOH 40%
Indole Tryptophan Không xuất hiện vòng đỏ khi nhỏ thuốc thử Kovac’s
Ureaza Urea Không đổi màu
Lysine decarboxylation medium Môi trường đục và có màu tím β-galactosidase Đĩa giấy O.N.P.G Không đổi màu
Hình 4.7 Các phản ứng sinh hóa vi khuẩn Salmonella
(TSI/ β-galactosidase/ Lysine decarboxylase / VP/ Ureaza/ Indole)
Trong quá trình kiểm tra các đặc tính sinh vật và hóa học trên các môi trường đặc hiệu, chúng tôi đã thực hiện các phản ứng lên men đường của các chủng Salmonella phân lập được Kết quả được trình bày trong bảng 4.6.
Bảng 4.6 Kết quả thử phản ứng lên men đường của các chủng Salmonella phân lập
Loại đường Kết quả phản ứng
Dương tính Tỷ lệ (%) Âm tính Tỷ lệ (%)
Kết quả nghiên cứu cho thấy 100% (22/22) các chủng Salmonella được phân lập từ mẫu phân gà thịt có khả năng lên men các loại đường như glucose, dextrose, maltose, mannitol và sorbitol Tuy nhiên, vi khuẩn này không có khả năng lên men lactose, sucrose và salicin.
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi tương thích với thang mẫu phân lập Salmonella mà Quinn và cộng sự (1994) đã đề xuất Các phản ứng lên men đường cho thấy những đặc tính chung của giống Salmonella, như đã được Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) và Đặng Thị Oanh (2013) công bố Tất cả các chủng Salmonella spp phân lập đều thể hiện các đặc tính sinh vật và hóa học điển hình, phù hợp với tiêu chuẩn nhận diện vi khuẩn.
Salmonella của Carter và Cole (1990), Nguyễn Như Thanh và cộng sự (2001)
Từ kết quả ban đầu này cho phép tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo về vi khuẩn
Hình 4.8 Hình ảnh vi khuẩn Salmonella trên kính hiển vi
Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập
Bài viết đề cập đến 22 chủng Salmonella spp có đặc tính sinh vật và hóa học điển hình, giúp xác định serotype của các chủng vi khuẩn này thông qua phương pháp huyết thanh học Dựa trên phân loại của White-Kauffman (WHO, 1983), quá trình xác định nhóm vi khuẩn Salmonella spp được thực hiện theo hướng dẫn của hãng Remel, với kết quả được trình bày trong bảng 4.7.
Kết quả định type kháng nguyên O theo nhóm cho thấy, các chủng
Trong nghiên cứu về Salmonella spp được phân lập từ mẫu phân gà thịt nuôi tại khu vực Hà Nội, nhóm E1 chiếm tỷ lệ cao nhất với 12/22 mẫu (54,55%), tiếp theo là nhóm D1 với 8/22 mẫu (36,36%), trong khi 2/22 mẫu (9,09%) không xác định được nhóm Kết quả cho thấy các chủng Salmonella phân lập chủ yếu thuộc hai nhóm E1 và D1.
Bảng 4.7 Kết quả xác định nhóm kháng nguyên O của các chủng vi khuẩn
Salmonella spp phân lập (n") Nhóm huyết thanh Số mẫu dương tính Tỷ lệ (%) Cấu trúc kháng nguyên
Ghi chú: (-) = Không xác định được cấu trúc kháng nguyên
Biểu đồ 4.3 Kết quả xác định nhóm huyết thanh Salmonella spp
Hình 4.14 Phản ứng ngưng kết giữa Salmonella với kháng huyết thanh O đa giá
Sau khi xác định nhóm huyết thanh của các chủng Salmonella bằng kháng huyết thanh O đơn giá, chúng tôi tiếp tục xác định serotype vi khuẩn Salmonella phân lập bằng kháng huyết thanh H pha 1 Âm tính Dương tính và pha 2 Kết quả được trình bày trong bảng 4.8.
Bảng 4.8 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Salmonella spp phân lập (n") Kháng nguyên H
Thành phần pha 2 g, m - 8/22 36,36 S enteritidis e, h l, w 5/22 22,73 S meleagridis g, m - 4/22 18,18 S suberu g, m, s - 3/22 13,64 S amsterdam
Trong nghiên cứu 22 chủng Salmonella spp, kết quả cho thấy có 8 chủng thuộc nhóm D1 là Salmonella enteritidis, chiếm tỷ lệ 36,36% Ngoài ra, có 5 chủng thuộc nhóm E1 là S meleagridis với tỷ lệ 22,73%, 4 chủng (18,18%) là S suberu và 3 chủng (13,64%) là S amsterdam.
Biểu đồ 4.4 Kết quả định chủng Salmonella từ mẫu phân gà thịt tại khu vực Hà Nội
Theo nghiên cứu, chủng Salmonella S enteritidis hiện đang chiếm tỉ lệ lưu hành cao nhất tại các trang trại gà thịt trong khu vực.
Hà Nội, sau đó là chủng S meleagridis chiếm tỷ lệ 22,73%
Nghiên cứu của Nguyễn Thị Ngọc Liên (1997) về bệnh phó thương hàn vịt ở tỉnh Hà Tây cho thấy sự xuất hiện của nhóm E1 12.5% (bao gồm S amsterdam) và nhóm D1 18.75% với S enteritidis là đại diện chính Trần Thị Hanh và cộng sự (2009) đã báo cáo vi khuẩn S enteritidis có mặt ở cả hai hình thức giết mổ công nghiệp và thủ công Trong nghiên cứu trên thủy cầm tại tỉnh Hậu Giang, Trần Ngọc Bích (2012) đã phát hiện S enteritidis trên mẫu thân thịt và mẫu phân Ngoài ra, Nguyễn Viết Không và cộng sự (2012) cũng phát hiện S enteritidis tại các điểm giết mổ gia cầm quy mô nhỏ ở các huyện ngoại thành.
Sự phát hiện Salmonella ở 5 khâu của chuỗi sản xuất tại Hà Nội (Phạm Thị Ngọc và cộng sự, 2015) cho thấy tình trạng nhiễm Salmonella đang ở mức báo động Nghiên cứu chỉ ra rằng hai serotype Salmonella chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm ở người là S enteritidis và S typhimurium Việc phát hiện S enteritidis trong các mẫu nghiên cứu là cơ sở khoa học quan trọng để đề ra các biện pháp phòng ngừa, nhằm giảm thiểu nguy cơ lây nhiễm Salmonella Sự nhiễm Salmonella ở thịt gà và trứng gà không chỉ ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm mà còn tác động tiêu cực đến sức khỏe của người tiêu dùng.
Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong nghiên cứu đạt 18,33%, cho thấy việc kiểm soát Salmonella trong chăn nuôi gà thịt vẫn chưa hiệu quả Cụ thể, tỷ lệ nhiễm theo chuỗi sản xuất từ cơ sở gà giống bố mẹ, cơ sở ấp trứng, trang trại gà, cơ sở giết mổ đến điểm tiêu thụ lần lượt là 32,8%, 11%, 32,08%, 43,3% và 36,9% (Phạm Thị Ngọc và cộng sự, 2015) Các trang trại nuôi gà thịt quy mô lớn cung cấp nguồn gà cho các điểm giết mổ và nhà máy chế biến thực phẩm Nếu quy trình giết mổ không được kiểm soát chặt chẽ, nguy cơ nhiễm Salmonella vào thịt gà sẽ gia tăng.
Theo tiêu chuẩn Việt Nam số 7046/2002 QĐ-Bộ Y tế, không được phép có vi khuẩn Salmonella trong 25 gram mẫu thịt sản phẩm Tỷ lệ nhiễm vi khuẩn
Tỷ lệ Salmonella trong khảo sát là khá cao, đặc biệt với sự hiện diện của chủng S enteritidis chiếm 36,36% trong các mẫu phân lập Điều này cho thấy nếu không kiểm soát tốt trong quá trình vận chuyển, giết mổ và tiêu thụ, Salmonella có thể trở thành nguồn lây nhiễm nghiêm trọng cho người tiêu dùng Do đó, việc thiết lập quy trình giết mổ hợp lý và đảm bảo điều kiện bày bán thịt gia cầm ở nơi sạch sẽ, khô ráo là rất cần thiết để phòng ngừa sự lây nhiễm vi khuẩn.
Salmonella vào thân thịt gà, từ đó giúp hạn chế ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Salmonella gây ra cho con người.
