Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu
Chủng virus KTY-PRRS-06, được phân lập từ ổ dịch ở Hải Phòng vào năm 2015, hiện đang được lưu trữ tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y thuộc Khoa Thú y của Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
Chủng virus KTY-PRRS-06 đã được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của lợn mắc hội chứng suy giảm miễn dịch ở lợn (PRRS), được bảo quản tại phòng Thí nghiệm trọng điểm CNSH Thú y thuộc Khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
* Dụng cụ, máy móc, thiết bị
- Chai nuôi cấy tế bào, khay 24 giếng, khay 96 giếng, pipet.
- Tủ ấm 37 0 C/ 5% CO2, nồi hấp, tủ sấy, tủ lạnh các loại: -4 0 C, -20 0 C, -80 0 C, bình nitơ lỏng, kính hiển vi soi nổi, máy chụp ảnh tế bào
- Sử dụng buồng cấy vô trùng, máy ly tâm lạnh, máy spin, vortex, máy lắc ấm, máy PCR,
The Beckman Coulter CEQ 8000 automated sequencer from the USA is equipped with essential data processing software, including CEQ 8000 (version 9.0), Genetyx (version 5.0.4), and MEGA5 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 5.10).
- Tế bào Marc-145 được nuôi cấy trong bình nuôi (T25 hoặc T75) và trên khay 24 giếng.
- Hóa chất sử dụng trong nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy DMEM, FCS, khỏng sinh (Penicillin (100 U/àl), Streptomycin (100 àg/ml), EDTA, Trypsin, DMSO),…
- Các chất dùng để tách chiết RNA của virus: Trizol (1ml Trizol/2ml hỗn dịch), PCS, Chloroform, Iso-propy alcohol, Ethanol 70%.
- Các hóa chất dùng cho phản ứng PCR: Mồi xuôi, mồi ngược, enzyme…
- Bộ môn Bệnh lý Thú y - Khoa Thú y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
- Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thú y - Khoa Thú Y - Học Viện Nông nghiệp Việt Nam.
Từ tháng 9 năm 2015 đến tháng 6 năm 2016.
N ội dung nghiên cứu
3.2.1 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng virus KTY-PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Hồ sơ giống virus KTY-PRRS-06 lựa chọn nghiên cứu.
- Khả năng gây bệnh tích tế bào qua các đời cấy chuyển.
- Hiệu giá virus KTY-PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
3.2.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học phân tử của chủng virus KTY-
PRRS-06 qua 40 đời cấy chuyển trên môi trường tế bào Marc-145
- Giải trình tự gen ORF5 của chủng virus KTY-PRRS-06;
- So sánh trình tự nucleotide của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY-
PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
- So sánh trình tự axit amin của đoạn gen ORF5 của chủng virus KTY-
PRRS-06 qua các đời cấy chuyển.
- Xây dựng cây sinh học phân tử thể hiện mối quan hệ di truyền của chủng virus KTY-PRRS-06.
3.3.1.Nuôi cấy virus KTY-PRRS-06 trên môi trường tế bào Marc-145
* Chuẩn bị tế bào Marc-145
- Gọi tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: Môi trường DMEM bổ sung 5% FCS làm ấm trong tủ 37 0 C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy.
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng.
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào.
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FCS, chuyển tế
Chuẩn bị 22 bào và bình nuôi cấy với 5ml môi trường DMEM và 5% FCS Đảm bảo đóng chặt bình nuôi cấy và ghi rõ tên tế bào cùng ngày gọi dậy lên nắp bình.
Giữ tế bào trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C với 5% CO2 và theo dõi sự phát triển hàng ngày Khi tế bào mọc dày và kín bề mặt đáy bình, có thể thu hoạch tế bào để bảo quản hoặc chuyển sang bình nuôi cấy mới.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS.
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin-EDTA Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ Trypsin, đem ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Tiến hành đếm tế bào sau khi pha loãng 100 lần (10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ) và sử dụng buồng đếm trên kính hiển vi để xác định số lượng tế bào trong 1ml.
Bước 5: Tiến hành cấy chuyển tế bào bằng cách pha loãng tế bào đến nồng độ 2x10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, sau đó chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi với thể tích 6ml cho bình T25 và 15ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào.
* Gây nhiễm virus KTY-PRRS-06
Khi tế bào Marc-145 phủ kín bề mặt giếng nuôi cấy mà không chồng chéo lên nhau, quá trình gây nhiễm có thể tiến hành Sau khi tế bào đã mọc kín hầu hết mặt giếng, cần hút bỏ môi trường nuôi cấy và bổ sung môi trường mới.
100àl mẫu đó chuẩn bị Hỗn dịch virus tế bào được ủ ở 37 0 C với 5% CO2 trong 60 phút.
Bổ sung 1,5ml môi trường DMEM có chứa 10% TPB vào các giếng nuôi và ủ ở 37 0 C với 5% CO2.
Hằng ngày, tiến hành theo dõi sự phát triển của bệnh tích tế bào bằng kính hiển vi soi nổi vào các thời điểm 24, 36, 48, 60 và 72 giờ sau khi nhiễm.
Hằng ngày, việc theo dõi sự phát triển của bệnh tích tế bào được thực hiện bằng kính hiển vi soi nổi Quá trình này bao gồm chụp ảnh tế bào và thu virus khi chúng gây hủy hoại từ 80% đến 90% số tế bào bị nhiễm.
- Chủng virus được bảo quản trong tủ -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2 Phương pháp xác định hiệu giá virus TCID 50
Tế bào Marc-145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng với mỗi giếng chứa 2,0x10^4 tế bào, sau đó dịch môi trường được hút bỏ Huyễn dịch chứa bệnh phẩm được ly tâm để loại bỏ cặn, lấy phần nước trong và pha loãng theo tỷ lệ 1:10, sau đó ủ trên bề mặt tế bào trong các giếng đã đánh dấu, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần với 25 µl cho mỗi giếng Sau 1 giờ ủ, dung dịch DMEM có chứa 5% FBS được bổ sung vào các giếng tế bào để gây nhiễm virus với 100 µl cho mỗi giếng.
Bệnh tích tế bào (CPE) được theo dõi hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi nhiễm, trong khi TCID50 được xác định bằng phương pháp Behrens-Karber (Lan NT et al., 2005).
3.3.3 Xác định đường cong sinh trưởng của virus PRRS qua các đời cấy chuyển
Virus PRRS được nhiễm vào tế bào với tỷ lệ MOI là 0,01 Sau 1 giờ ủ, huyễn dịch chứa virus được loại bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0,5ml PBS Tiếp theo, môi trường DMEM có chứa 10% TPB được bổ sung Virus được giải phóng cả bên ngoài và bên trong tế bào, và được thu thập tại các thời điểm khác nhau sau khi nhiễm virus, cụ thể là ở 24, 36, 48, 60 và 72 giờ.
84 giờ, 96 giờ và 108 giờ) Đường cong nhân lên của virus được xây dựng có biến là Log10 của TCID50/25àl tại mỗi thời điểm thu virus.
3.3.4 Phương pháp tách chiết RNA tổng số của hệ gen virus PRRS
RNA tổng số là toàn bộ RNA được tách chiết từ mẫu nghiên cứu, cần loại bỏ DNA để đảm bảo hiệu quả của RT-PCR RNA này bao gồm RNA của hệ gen virus và các loại RNA cấu trúc, RNA hoạt động như tRNA và mRNA của tế bào và virus Mục tiêu là thu nhận RNA của hệ gen virus PRRS với hàm lượng cao, đủ để làm khuôn cho RT-PCR.
Tách chiết RNA virus bằng Kit QIAgen
Chuẩn bị: Pha hỗn hợp buffer theo hướng dẫn của nhà sản xuất Kit.
Bước 1: Hỳt 560àl Buffer AVL vào ống Eppendorf loại 1,5ml.
Bước 2: Thêm 140 µl dung dịch mẫu vào ống Eppendorf, tạo thành hỗn dịch chứa virus và dung dịch PCS được thêm vào khi nghiền mẫu bệnh phẩm Sau đó, tiến hành vortex trong 15 giây.
Bước 4: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 5: Thờm 560 àl dung dịch Ethanol (96% - 100%) vào ống, vortex 15 giây và Spin down để loại bỏ các giọt trên nắp.
Bước 6: Hỳt 630àl huyễn dịch trờn sang cột QIAamp spin (cột lọc) Ly tõm
8.000 vòng/phút, trong 2 phút, giữ cột, loại bỏ dung dịch phía dưới ống.
Bước 7: Lặp lại bước 6 một lần nữa với phần mẫu còn lại.
Bước 8: Thờm 500àl dung dịch AW1, ly tõm 8.000 vũng/phỳt, trong 2 phỳt rồi giữ cột, bỏ nước dưới.
Thực hiện bước 9 bằng cách thờm 500 ml dung dịch AW2 và ly tâm ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 3 phút Sau khi giữ cột, cần loại bỏ dung dịch phía dưới cột Tiếp theo, ly tâm thêm một lần nữa ở tốc độ 14.000 vòng/phút trong 1 phút để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn dung dịch AW2.
Bước 10: Đặt cột QIA vào ống Eppendorf 1,5ml mới sau đó thêm 60ml dung dịch AVE để ở nhiệt độ phòng 1 phút.
Sau đó ly tâm 8.000 vòng, trong 1 phút rồi bỏ cột, giữ nước dưới Dịch lỏng bên dưới chính là dung dịch chứa RNA tổng số.
Cuối cùng ký hiệu mẫu và bảo quản mẫu ở -20°C hoặc -80°C.
* Các bước tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được tiến hành phản ứng RT- PCR theo bộ Kit one-step Invitrogen với các thành phần được trình bày dưới bảng 3.1
Bảng 3.1 Thành phần và thể tích cho phản ứng RT- PCR
Các cặp mồi cho phản ứng RT-PCR bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, được thiết kế để khuếch đại đoạn gen ORF5 dài 603bp của virus PRRSV, như được thể hiện trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Các cặp mồi cho phản ứng RT- PCR
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Bảng 3.3 Chu kỳ nhiệt độ cho phản ứng RT- PCR
Sản phẩm của phản ứng RT-PCR sẽ được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
* Phương pháp điện di kiểm tra sản phẩm
Kỹ thuật điện di được sử dụng trong phân tích định tính, định lượng, thu nhận, tách các acid nucleic và protein từ một hỗn hợp mẫu.
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
Trong nghiên cứu này, thạch Agarose và dung dịch đệm TAE được sử dụng để tạo bản gel cho quá trình điện di Hai loại thạch phổ biến thường được sử dụng là Agarose và Polyacrylamid, hòa tan trong dung dịch đệm TBE hoặc TAE.
Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm TAE 1 x hòa tan với 1,5 gram Agarose đặt trong lò vi sóng ở 100 0 C trong 5 phút, đợi tới khi thạch nguội (khoảng
50 0 C-60 0 C) cho thờm 3àl Ethidium Bromide rồi đổ vào khuụn cú cỏc