Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Vật liệu nghiên cứu
- Giống virus Viêm gan vịt cường độc.
3.1.2 Nguyên liệu, hóa chất nghiên cứu
- Vắc xin viêm gan vịt
- Trứng gà Leghorn có phôi đã ấp được 9 ngày
- Vịt xiêm 1 - 3 ngày tuổi đạt tiêu chuẩn thí nghiệm.
- Môi trường nuôi cấy tế bào Eagle MEM.
- Trypsin, Phenol red, NaHCO3, Na2HPO4,
Các chất dùng để tách ARN của virus:
- Men sao chép ngược: Reverse Transcriptase.
- Bộ kit tách chiết RNA tổng số, “QIAamp Viral Mini kit (QIAGEN Inc, USA)” và hoá chất do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng RT-PCR do hãng Invitrogen cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng chuyển đổi cDNA hãng Fermentas cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR do hãng Fermentas cung cấp.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR/RT-PCR do hãng QIAGEN và BIOONER cung cấp.
- Bộ kit dùng để tách DNA từ thạch agarose ”MinElute Gel Extraction Kit” do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit tách dòng “TA-cloning kit” do hãng Invitrogen cung cấp.
- Kháng sinh kanamycin, ampicilin (50 mg/ml), X-gal, cồn tuyệt đối.
- Bộ kit tách DNA plasmid tái tổ hợp, “QIAprep Spin Miniprep Kit” do hãng QIAGEN cung cấp.
- Bộ kit dùng cho phản ứng PCR giải trình tự.
- Bộ kit dùng để tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự.
- Các dung dịch sử dụng trong tách dòng.
- Các dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose
Các chất tham gia phản ứng PCR có trong bộ Kit của Hãng Qiagen:
- AMV-RT (enzym sao chép ngược)
- Các loại máy móc bao gồm: Tủ lạnh thường, tủ lạnh âm sâu -80 0 C
The article highlights essential laboratory equipment including the Sanyo incubator set at 37°C, high-speed centrifuges, and the MJ Research Inc PTC-100 thermal cycler It also mentions PCR/RT-PCR product testing gel electrophoresis machines from Fermentas and Bio-Rad, along with the Dolphin-Doc gel imaging system from Wealtech Additional tools include a computer, temperature control machines, cell culture shakers, vortex mixers, and sterile laminar flow hoods Furthermore, it discusses the ABI Avant Genetic Analyzer 3100 and the Applied Biosystems Model 3730XL automated sequencers, as well as a range of pipettes (10µl, 20µl, 100µl, 200µl, 1000µl, and 5000µl) and bioinformatics software.
- Các dụng cụ rẻ tiền mau hỏng: dao, kéo, panh, kẹp, phiến kính, đĩa Petri, các loại Eppendorf, các loại đầu côn, lọ đựng môi trường
- Phòng Virus – Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I.
- Khu thí nghiệm động vật của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y Trung ương I.
Nội dung nghiên cứu
3.2.1 Xác định đặc tính sinh học của giống virus Viêm gan vịt cường độc
Bài viết này trình bày các bước cấy truyền và khả năng gây nhiễm trên tế bào, đồng thời phân tích độc lực, tính ổn định và tính kháng nguyên của giống Ngoài ra, việc giải mã gen đặc trưng cũng được thực hiện để xây dựng dữ liệu sinh học phân tử của giống.
- Tiếp truyền giống trên bản động vật
- Khảo sát đặc tính sinh học gồm các bước:
+ Kiểm tra tính thuần khiết
+ Kiểm tra độc lực: EID50, xác định các chỉ số sinh học trên phôi gà.
- Giải mã cấu trúc và trình tự gen của virus Viêm gan vịt cường độc.
- Đông khô và lưu giữ giống
3.2.2 Ứng dụng chủng virus Viêm gan vịt cường độc để kiểm nghiệm vắc xin Viêm gan vịt nhược độc
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp kiểm tra vô trùng của giống
Giống virus được kiểm tra vô trùng theo TCVN 8684:2011 “ Phương pháp kiểm tra thuần khiết ”.
Giống virus đông khô, được hoàn nguyên trở lại bằng nước muối sinh lý hoặc dung dịch PBS pH 7,2 vô trùng.
Cấy huyễn dịch virus giống với lượng cấy kiểm tra từ 1 – 2% dung tích môi trường vào năm loại môi trường khác nhau, bao gồm thạch máu, thạch nấm, thạch thường, nước thịt và nước thịt gan yếm khí, mỗi loại được thực hiện trong hai ống.
Môi trường đã cấy kiểm tra được theo dõi 7 ngày ở 37 0 C Riêng môi trường nấm để ở nhiệt độ phòng (25 – 30 0 C).
3.3.2 Phương pháp kiểm tra độ thuần khiết của giống
3.3.2.1 Kiểm tra tạp nhiễm Mycoplasma
Để tiến hành kiểm tra giống, cần cấy giống trên môi trường canh thang PPLO với nồng độ từ 1-2%, pha loãng trong 100 ml môi trường Đồng thời, cấy trên đĩa thạch PPLO có bổ sung huyết thanh ngựa và chất chiết nấm men, sử dụng 0,1 ml kháng thể cho mỗi đĩa.
Trong nghiên cứu này, môi trường lỏng được theo dõi trong 14 ngày ở nhiệt độ từ 33-37 độ C Tại các thời điểm 3, 7, 10 và 14 ngày, mẫu canh khuẩn được lấy từ môi trường lỏng và cấy vào 2 đĩa môi trường thạch PPLO Sau đó, các đĩa được ủ trong tủ ấm CO2 ở 37 độ C với 5% khí CO2.
CO2, theo dõi trong 28 ngày Kết quả: Mẫu giống được xem là đạt khi không có khuẩn lạc Mycoplasma mọc trên môi trường kiểm tra.
3.3.2.2 Kiểm tra tạp nhiễm Salmonella
Tiến hành nuôi cấy mẫu giống đã pha trên môi trường kiểm tra như thạch MacConkey hoặc thạch Salmonella-Shigella với nồng độ 1-2% Sau đó, ủ môi trường đã cấy ở 37°C trong 18-24 giờ, rồi chuyển sang ống môi trường nước sử dụng canh thang selenit hoặc canh thang tetrathionat Tiếp tục ủ ở 37°C và theo dõi trong 48-72 giờ Giống được coi là đạt yêu cầu khi không phát hiện vi khuẩn Salmonella trên các môi trường kiểm tra.
3.3.3 Phương pháp thu nhận bảo quản mẫu, tiếp truyền virus giống
- Mẫu virus được tiếp truyền liên tiếp 3 lần trên vịt.
- Mẫu sau khi thu hoạch được đông khô hoặc dạng tươi, bảo quản ở -70 0 C để khảo sát sinh học phân tử và tính ổn định.
3.3.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào xơ phôi gà một lớp
Tiến hành theo các bước sau:
- Trứng gà Leghorn có phôi đã ấp được 9 ngày.
- Soi để chọn những quả có phôi sống, khoẻ.
- Giết chết phôi bằng nhiệt lạnh để làm co mạch máu, sát trùng vỏ trứng, mổ trứng, gắp phôi ra đĩa Petri.
- Rửa phôi 3 lần bằng PBS.
- Cắt nhỏ phôi và rửa trên máy khuấy từ 2 lần.
- Rửa tiếp bằng dung dịch Trypsin 0,125%.
- Hút bỏ phần nước trong ở trên.
- Tiêu hoá tế bào bằng dung dịch Trypsin 0,25% trên máy khuấy từ trong phòng ấm 37 0 C từ 30 – 60 phút.
- Lọc tế bào qua lưới lọc và ly tâm lạnh với tốc độ 2000 vòng/phút.
- Chắt bỏ nước trong, dùng môi trường phát triển để pha loãng tế bào.
- Đếm tế bào trên buồng đếm hồng cầu, định lượng tế bào.
Pha loãng tế bào với nồng độ 0,5% (tương đương 75x10^4 tế bào/ml) và chia tế bào vào các chai nuôi hoặc đĩa nhựa đáy phẳng 96 giếng Sau đó, đặt chúng vào môi trường nuôi trong phòng ấm để phát triển.
- Hàng ngày quan sát sự phát triển của tế bào xơ phôi gà trong các chai tế bào bằng kính hiển vi soi ngược.
3.3.5 Phương pháp xác định liều gây chết 50% vịt thí nghiệm
* Chuẩn bị chuồng trại: 10 ô chuồng được chuẩn bị, có lưới chống chuột, máng ăn, máng uống đã vệ sinh tiêu độc 1 tuần trước khi nhập vịt.
Chuẩn bị vịt xiêm 1-3 ngày tuổi từ đàn vịt bố mẹ sạch bệnh, chưa tiêm vắc xin Viêm gan vịt cường độc Vịt được chia thành 10 lô, mỗi lô gồm 5 con, với 9 lô thí nghiệm và 1 lô đối chứng Cần chăm sóc vịt hàng ngày để đảm bảo sức khỏe và phát triển tốt.
Chuẩn bị giống virus được thực hiện bằng cách bảo quản ở nhiệt độ -80°C Giống đông khô có hình thái đẹp, màu vàng trắng và không bị vỡ vụn Để phục hồi, hòa tan 2 ống giống đông khô 1ml trong PBS pH 7,2 vô trùng và lắc nhẹ Tiếp theo, thêm vào huyễn dịch 4ml PBS pH 7,2 với độ pha loãng 10-1 và lắc nhẹ Sau đó, hòa 1ml giống pha loãng 10-1 với 9ml PBS để đạt được độ pha loãng 10-2, và tiếp tục thực hiện các bước tương tự để có các độ pha loãng 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8 và 10-9.
Để gây bệnh cho vịt, tiến hành tiêm bắp 1ml huyễn dịch virus cho mỗi con vịt với các nồng độ pha loãng từ 10-1 đến 10-9, mỗi nồng độ tiêm cho 5 con Sau 5 ngày, theo dõi và ghi lại số lượng vịt sống và chết, đồng thời mổ kiểm tra bệnh tích ở những con vịt đã chết để tính LD50 theo phương pháp Reed-Muench.
A: Số mũ nồng độ gây chết cận trên 50%
B: Số mũ nồng độ gây chết cận dưới 50%
Logf: Hệ số pha loãng virus
3.3.6 Phương pháp giải trình tự gen của virus
3.3.6.1 Phương pháp tách chiết ARN tổng số
Tách chiết ARN tổng số bằng phương pháp Accuzol như sau:
- Thờm 750 àl dung dịch Accuzol vào ống Eppendorf Bổ sung 250 àl dịch nước trứng và 200 àl chloroform Vortex 15 giõy.
- Ủ đá 5 phút Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ phần dung dịch phía dưới Chuyển toàn bộ hỗn dịch trên sang ống Eppendorf 1,5 ml mới.
- Thêm dung dịch Isopropanol (100%) theo tỷ lệ 1:1.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ toàn bộ dịch phía trên, thu giữ tủa trắng ở đáy ống Eppendorf.
- Thờm 1000 àl dịch Ethanol (800), vortex mẫu.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ toàn bộ dịch phía trên, thu giữ tủa trắng ở đáy ống Eppendorf.
- Làm khô mẫu trong tủ an toàn sinh học.
- Thờm 30 àl nước đặc biệt tinh khiết đó làm ấm ở (37 0 C) để làm tan mẫu
Ghi kí hiệu mẫu và bảo quản ở - 20 0 C cho đến khi sử dụng.
Bước 3: Thờm 500 àl dung dịch WB, ly tõm 13.000vũng/phỳt trong 1 phỳt, đổ bỏ dịch dưới, ly tâm lại thêm một lần nữa để làm khô màng.
Chuyển cột sang ống Eppendorf mới và thêm 30 µl dung dịch EL vào giữa màng lọc Để hỗn hợp ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, sau đó ly tâm ở 13.000 vòng/phút trong 1 phút để thu sản phẩm PCR đã được tinh sạch Ký hiệu mẫu và bảo quản ở -20°C cho đến khi sử dụng.
3.3.6.2 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ARN hệ gen
ARN hệ gen của virus được tách chiết và tinh sạch sử dụng bộ kit QIAamp
ARN Viral kit; của Hãng QIAGEN theo hướng dẫn của nhà sản xuất Đo hàm lượng ARN bằng quang phổ kế (spectrophotometer), hoặc xác định trên thạch agarose.
3.3.6.3 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu
Mồi đặc hiệu của từng gen đối tượng được thiết kế trên cơ sở chuỗi gen đã có trong Ngân hàng gen.
Danh sách các mồi dùng cho phản ứng PCR/RT-PCR trong nghiên cứu virus Viêm gan vịt
Tên mồi Trình tự chuỗi mồi (5’ → 3’)
3.3.6.4 Phương pháp RT- PCR và phân tích kiểm tra gen kháng nguyên của virus giống
Sử dụng phương pháp RT-PCR một bước (one-step RT-PCR) của Hãng
QIAGEN, để thu nhận sản phẩm VP1 của virus viêm gan vịt.
Phản ứng RT-PCR là quá trình nhân một đoạn ARN bằng cách chuyển đổi ARN thành ADN hai sợi, sau đó sử dụng ADN này để thực hiện phản ứng PCR Quá trình này bao gồm hai giai đoạn: đầu tiên là chuyển đổi ARN thành ADN, và tiếp theo là nhân ADN để tạo ra nhiều bản sao.
Phản ứng RT là quá trình chuyển đổi ARN hệ gen thành ADN thông qua enzym sao chép ngược Quá trình này diễn ra ở nhiệt độ 55 độ C trong 30 phút, biến ARN dạng sợi đơn thành ADN dạng sợi kép.
Phản ứng PCR: Đó là giai đoạn gồm 3 bước như đã giới thiệu.
- Cách tiến hành phản ứng RT-PCR
Giai đoạn 1 (RT: 1 chu kỳ) Thực hiện sao chép ngược từ ARN sợi đơn sang ADN sợi kép: 55 0 C 30 phút
Giai đoạn 2 (PCR): Gồm các bước
+ Bước khởi đầu (1 chu kỳ): Bung kiên kết: Bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành ADN 1 sợi làm khuôn và cho mồi bám vào: 94 0 -95 0 C/15 phút.
+ Bước 1: Bung liên kết, bung chuỗi xoắn kép ADN 2 sợi thành ADN 1 sợi làm khuôn và cho primer bám vào 94 0 -95 0 C/1 phút.
+ Bước 2: Bám mồi: thực hiện ở 61 0 C trong 1 phút để gắn mồi.
+ Bước 3: Tổng hợp ADN kéo dài (nhân ADN) ở 72 0 C/1 phút.
(Các bước 1, 2, 3 được thực hiện lặp đi lặp lại trong 35-40 chu kỳ).
+ Bước kết thúc: (1 chu kỳ) Hoàn chỉnh đoạn gen cho ADN sản phẩm:
3.3.7 Phương pháp kiểm nghiệm vắc xin: Theo TCVN 8685-2:2011
- Kiểm tra cảm quan: Kiểm tra bằng mắt thường, vắc xin phải có màu trắng hồng hoặc vàng nhạt, dạng bánh xốp, dễ tách khỏi thành lọ.
- Kiểm tra độ thuần khiết: theo TCVN 8684:2011.
- Kiểm tra tính an toàn
Tiêm 10 liều vắc xin cho 20 con vịt dưới da cổ hoặc bắp thịt và theo dõi tình trạng sức khỏe trong 14 ngày Lô vắc xin được xem là đạt yêu cầu nếu tất cả vịt đều sống khỏe mạnh.
Tiêm vắc xin dưới da cho 20 con vịt, mỗi con một liều theo hướng dẫn, trong khi 20 con còn lại không được tiêm làm nhóm đối chứng Sau 72 giờ, cả 20 vịt đã tiêm vắc xin và 20 vịt đối chứng sẽ được thử thách với virus viêm gan vịt cường độc, liều 10 3,0 LD50/con, cũng được tiêm dưới da Quá trình theo dõi sẽ diễn ra trong 10 ngày sau khi thử thách virus.
Lô vắc xin được coi là đạt nếu ít nhất 80 % vịt miễn dịch sống và ít nhất 80
Chuẩn độ virus vắc xin được thực hiện bằng cách tiêm túi niệu phôi gà từ 8 đến 10 ngày tuổi Một lô vắc xin được coi là đạt yêu cầu khi có ít nhất 10 3,3 ELD50/liều (Embryo Lethal Dose).
3.3.8 Xử lý số liệu trong nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chương trình SeqEd v1.03 để xử lý giản đồ chromatogram của chuỗi nucleotide thô và so sánh các chuỗi bằng AsemblyLIGN v1.9 Phân tích thành phần nucleotide và amino acid, cũng như các đặc tính gen và polypeptide được thực hiện qua hệ chương trình MacVector 8.2 trên máy tính PC Mức độ tương đồng của các chuỗi nucleotide và amino acid được tính toán bằng GeneDoc v2.5, trong khi phân tích phả hệ được thực hiện bằng MEGA3.1 hoặc 4.0 Các chuỗi gen VP2, VP4, VP3 và phân đoạn A được sử dụng để phân tích, so sánh về thành phần nucleotide và amino acid, cũng như để nghiên cứu mối quan hệ phả hệ giữa các chủng của Việt Nam và thế giới.
Phả hệ được xây dựng bằng phương pháp liền kề Neighbour - Joining, với hệ số kiểm định (bootstrap) là 1000 bootstrap (Tamura và cs, 2007).