VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học
Khoa Thú y Phòng thí nghiệm bộ môn bệnh lý Thú y
THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2016 đến tháng 5/2017.
VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Thông tin sơ bộ về nguồn gốc của 02 chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02
Vào năm 2013, Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã phân lập thành công hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 từ mẫu bệnh phẩm thu thập tại hai trang trại ở các tỉnh Thái Bình và Nghệ An.
Bảng 3.1 Thông tin về nguồn gốc 02 chủng virus KTY-PRRS-01,
Các chủng virus PRRS trên đều được phân lập từ các mẫu cơ quan của lợn có triệu chứng và bệnh tích điển hình của bệnh PRRS
Máy móc, trang thiết bị, hóa chất và dụng cụ
Trong các thí nghiệm sinh học, những máy móc và trang thiết bị quan trọng bao gồm máy PCR, máy giải trình tự gene, thiết bị điện di, máy chụp ảnh gel, tủ nuôi cấy tế bào và kính hiển vi soi ngược Những công cụ này đóng vai trò thiết yếu trong việc phân tích và nghiên cứu gen cũng như nuôi cấy tế bào.
Bộ kít tách chiết RNA, kít RT-PCR, kít giải trình tự gene, và kít Elisa là những hóa chất và dụng cụ thiết yếu trong nghiên cứu sinh học phân tử Ngoài ra, DMEM, tế bào Marc 145, và FCS cũng đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy tế bào Các thiết bị như Kit BCA, ống Eppendorf, đầu tuyp, Fancol 15 ml và 50 ml, cùng với xilanh và kim lấy máu, hỗ trợ trong quá trình thực nghiệm Cuối cùng, khay mẫu và khay đệm cho giải trình tự gene là không thể thiếu để đảm bảo kết quả chính xác và hiệu quả.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1 Nghiên cứu đặc tính sinh học chủ yếu của 02 chủng virus KTY-PRRS-
-Xác định hiệu giá của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02.
- Xác định khả năng gây bệnh tích tế bào của 02 chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
- Xác định đường biểu diễn sự nhân lên của virus
- Nghiên cứu khả năng gây miễn dịch của 02 chủng virus KTY- PRRS-01, KTY-PRRS-02 cho động vật thí nghiệm
+ Tinh chế kháng nguyên và tiêm cho động vật thí nghiệm
+ Thu huyết thanh và xác định hàm lượng kháng thể bằng phương pháp
3.4.2 Nghiên cứu đặc tính sinh học phân tử của 02 chủng virus KTY-PRRS-
- Giải trình tự gene của chủng virus KTY-PRRS-01, KTY-PRRS-02
Xây dựng cây sinh học phân tử cho thấy mối quan hệ di truyền giữa hai chủng virus KTY-PRRS-01 và KTY-PRRS-02 với các chủng virus khác trong ngân hàng gene Nghiên cứu này cung cấp cái nhìn sâu sắc về sự liên kết di truyền và giúp hiểu rõ hơn về sự phát triển của virus trong môi trường tự nhiên.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1 Phương pháp nuôi cấy tế bào
Chuẩn bị môi trường đầy đủ (DMEM, 10% FBS làm ấm trong tủ ấm 37 o C trong 30 phút trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy)
Bước 1: Giải đông tế bào Marc 145 ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Tiến hành ly tâm để loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào Bước 3: Chuyển cặn tế bào vào bình nuôi cấy với 5ml môi trường đầy đủ Bước 4: Đặt bình nuôi cấy trong điều kiện 37 độ C và 5% CO2, theo dõi sự phát triển của tế bào hàng ngày.
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS (không chứa Ca 2+ hoặc Mg 2+ )
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin - EDTA Ủ trong 5 đến
10 phút Thêm 7ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm.
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại căn màu trắng.
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6ml môi trường đầy đủ Tiến hành đếm tế bào và pha loãng 100 lần, cụ thể là 10µl tế bào trong 990µl môi trường không đầy đủ Sử dụng buồng đếm để xác định số lượng tế bào trên kính hiển vi, từ đó tính số tế bào trong 1ml.
Bước 5: Tiến hành cấy chuyển tế bào bằng cách pha loãng tế bào đến nồng độ 2x10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, sau đó chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi với thể tích 6ml cho bình T25 và 15ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở
37 0 C, 5%CO 2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào chỉ khác ở bước 5 và bước 6
Bước 5: Tiến hành chia ống tế bào và pha loãng tế bào với nồng độ 5x10^6 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ, thêm 10% DMSO Sau đó, phân chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản với dung tích 1ml cho mỗi ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20 o C trong 2-
3 giờ, chuyển sang -80 o C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng.
3.5.2 Phương pháp gây nhiễm virus PRRS trên tế bào
Phương pháp gây nhiễm virus trên tế bào là một kỹ thuật tiên tiến trong Y học, được sử dụng để phân lập, nuôi cấy và giám định virus Phương pháp này cho phép quan sát hình thái siêu cấu trúc của virus và nuôi cấy vắc-xin trong môi trường tế bào tổ chức Sự nhân lên của nhiều loại virus thường đi kèm với sự thoái hoá của tế bào nuôi, dẫn đến hiện tượng huỷ hoại tế bào chủ (Cytophathogenic Effect - CPE) Mỗi ổ tế bào bị hoại tử được gọi là một đơn vị plague, từ đó có thể đánh giá khối lượng virus gây nhiễm dựa trên số lượng đơn vị plague xuất hiện Một số tế bào nhiễm virus có thể chưa chết nhưng chức năng của chúng đã bị thay đổi.
Căn cứ vào CPE khi phân lập virus quan sát được dưới kính hiển vi soi ngược có thể đánh giá được hiệu quả phân lập, nuôi cấy virus
Phương pháp gây nhiễm virus PRRS cho tế bào Marc 145 được thực hiện trong chai T25 với 200µl huyễn dịch virus cho mỗi chai Các chủng virus được gây nhiễm với tỷ lệ MOI=0,1 và được theo dõi hàng ngày để ghi chép bệnh tích tế bào Quá trình theo dõi tiếp tục cho đến khi virus hoàn toàn phá hủy tế bào Các giếng tế bào có bệnh tích được thu thập và bảo quản ở -80°C để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.5.3 Phương pháp xác định TCID 50
Chuẩn bị tế bào Marc 145 trên đĩa 96 giếng
Tế bào Marc 145 được trypsin hóa thành huyễn dịch có mật độ 5 x
10 3 tế bào/ml Cho 100 àl huyễn dịch tế bào trờn vào tất cả cỏc giếng Đậy nắp, ủ tế bào ở 37 0 C trong môi trường 5 % CO 2 , theo dõi hàng ngày.
Khi quan sát thấy tế bào bám đáy trên 80 % thì tiến hành chuẩn độ vi rút.
– Pha loãng vắc xin trong ống nghiệm theo cơ số 10 bằng môi trường nuôi cấy tế bào từ 10 -1 đến 10 -6 hoặc thấp hơn tùy theo cách bố trí thí nghiệm.
– Lấy đĩa tế bào Marc 145 đã nuôi, loại bỏ môi trường cũ
– Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 àl/giếng, sau đú loại bỏ dung dịch PBS (-)
Pha loãng 100 µl huyết thanh vắc xin vào các giếng tương ứng trên đĩa tế bào từ B1 đến G5 và dãy đối chứng tế bào từ B6 đến G6 Sau đó, thêm 100 µl môi trường duy trì vào mỗi giếng.
– Ủ tế bào ở 37 0 C trong môi trường có 5 % CO 2 trong 30 phút
– Rửa tế bào bằng dung dịch PBS (-), 200 àl/giếng, loại bỏ dung dịch PBS (-)
– Cho 200 àl mụi trường duy trỡ vào mỗi giếng
– Nuôi tế bào ở 37 0 C trong môi trường có 5 % CO 2 , theo dõi hàng ngày, trong 5 ngày
– Đọc kết quả: giếng có bệnh tích tế bào là dương tính
Theo công thức Spearman-Karber: λ.TCID 50 (0,1 ml) = X + 1/2 – (N x /n)
X là logarit cơ số 10 của độ pha loãng vi rút có 100 % giếng xuất hiện bệnh tích tế bào;
N x là tổng số giếng có bệnh tích tế bào trong thí nghiệm; n là số giếng của mỗi độ pha loãng; λ là độ pha loãng vi rút
3.5.4 Phương pháp xác định sự nhân lên của virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5x10 4 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên
Virus PRRS được phân lập và chủng vắc-xin đã được gây nhiễm lên tế bào với MOI 0,01 Sau một giờ ủ để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus được hút bỏ và môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0,5ml PBS Cuối cùng, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 100µl/giếng.
Virus giải phóng ngoài tế bào và virus trong tế bào được thu riêng từ dịch nổi và phần tế bào còn lại ở các thời điểm 12, 24, 36, 48,
60, 72, 84, 96 giờ sau gây nhiễm virus
Tiến hành xác định hiệu giá virus từ các mẫu ống đã thu để định lượng virus Đường biểu diễn sự nhân lên của virus được xây dựng dựa trên logarit của TCID50 tại từng thời điểm thu mẫu virus.
- Phương pháp tách chiết RNA
Các mẫu bệnh phẩm từ lợn mắc PRRS được thu thập và nuôi cấy virus, sau đó được bảo quản ở nhiệt độ -80 độ C Tiến hành tách chiết RNA của virus là bước quan trọng trong chẩn đoán bệnh cho lợn.
- Quy trình tách chiết RNA của virus được thực hiện theo hướng dẫn của bộ KIT của hãng Qiagen
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại hai đoạn gene ORF7 và ORF5:
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
- Chuẩn bị thạch Agarose 1,2%: Cân 1,2g Agarose cho vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi trong lò vi sóng, để nguội đến khoảng 40 o C bổ sung thêm
10 ul Syber green, đổ thạch có số giếng tương ứng số mẫu cần điện di.
- Chuẩn bị mẫu: Thêm 2 l loading dye vào 8 l sản phẩm RT-PCR
- Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch
- Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tích 6 l maker 100bp và 10 l sản phẩm PCR mỗi giếng
- Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút
- Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh
3.5.6 Phương pháp giải trình tự gene
Giải trình tự DNA là quá trình xác định thành phần nucleotide của một đoạn DNA cần nghiên cứu, sử dụng máy giải trình tự gene tự động Beckman Coulter CEQ 8000 tại Phòng thí nghiệm trung tâm Khoa Thú y Nguyên tắc hoạt động của máy dựa trên phương pháp Sanger, trong đó sợi DNA được tổng hợp với các nucleotide gắn thuốc nhuộm huỳnh quang Mỗi loại nucleotide sẽ phát ra màu sắc khác nhau khi được đọc bằng tia laser: Adenin hiển thị màu đỏ, Thymine màu xanh, Guanine màu xanh lá cây, và Cytosine màu đen.
Quá trình thực hiện giải trình tự bao gồm các bước sau:
Phản ứng PCR sequencing: Chuẩn bị phản ứng trong ống PCR 0,2ml theo bảng sau:
Thành phần DTCS Quick Start Master Mix
Với chương trình chạy PCR giải trình tự sau
Tinh sạch sản phẩm PCR giải trình tự
Sản phẩm của phản ứng PCR sequence sẽ được tinh sạch bằng Ethanol kèm theo hóa chất và hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất (Beckman Coulter-Mỹ)
Sản phẩm sau khi tinh sạch được chuyển vào đĩa chạy mẫu để tiến hành giải trình tự
3.5.7 Phương pháp tinh chế kháng nguyên virus và định lượng protein Các chủng virus được lựa chọn để làm nguyên liệu cho các bước nghiên cứu tiếp theo được chúng tôi nhân lên với số lượng lớn để tiến hành tinh chế kháng nguyên Virus sau khi được gây nhiễm vào tế bào Marc
Khi bệnh tích tế bào đạt yêu cầu, tiến hành thu virus và bảo quản trong điều kiện âm sâu Để tối ưu hóa hàm lượng virus, cần thực hiện đông tan tế bào nhiều lần, ít nhất là ba lần.
Huyễn dịch virus được ly tâm ở 3000 vòng/4 o C/30 phút để loại bỏ cặn tế bào, thu lấy dịch trong phía trên, cho vào fancol
Trước khi thực hiện siêu ly tâm, cần khởi động máy siêu ly tâm ít nhất 30 phút để tạo môi trường lạnh cho mẫu nghiên cứu, đồng thời thiết lập chế độ siêu ly tâm phù hợp.
Hỗn hợp dịch kháng nguyên được bảo quản trong khay đá vảy và ly tâm ở tốc độ cao 35.000 vòng/phút tại 4°C trong 2 giờ để thu cặn virus Cặn thu được sẽ được hòa tan trong PBS 1X để tạo thành hỗn dịch kháng nguyên Hỗn dịch này tiếp tục được ly tâm ở tốc độ cao qua gradient đường với các nồng độ khác nhau (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%) Vạch band xuất hiện sau khi ly tâm chính là kháng nguyên virus, và protein kháng nguyên sẽ được định lượng bằng máy quang phổ kế khả kiến.
3.5.8 Phương pháp gây tối miễn dịch cho chuột lang và thỏ