Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Địa điểm: phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.
Thời gian nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu
- Giống hoa hồng Pháp (Rosa gallica L.) thu thập tại Sapa tỉnh Lào Cai
- Chế phẩm nano được cung cấp bởi bộ môn Sinh học, khoa Công nghệ sinh học, Học viện nông nghiệp Việt Nam.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Khử trùng mẫu
Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp
Nội dung 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 2.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Nội dung 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 3.1: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp
Nội dung 4: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Nội dung 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 in vitro hoa hồng Pháp.
Phương pháp thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần, số mẫu thí nghiệm cho mỗi công thức là 20
Môi trường MS được sử dụng trong nuôi cấy với thành phần gồm 6,5g agar/l, 30g sucrose/l, pH 5,8, cùng với các chất điều tiết sinh trưởng và nano bạc Trước khi tiến hành nuôi cấy, môi trường này cần được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C, áp suất 1 atm trong 20 phút.
3.5.2 Các chỉ tiêu nghiên cứu
Tỉ lệ mẫu sạch (%) = (Tổng số mẫu sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100
Tỉ lệ mẫu sống sạch (%) = (Tổng số mẫu sống sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100
Tỉ lệ số mô bật chồi (%) = (Tổng số mô bật chồi/Tổng số mẫu thí nghiệm)
Tỉ lệ mẫu nhiễm (%) = (Tổng số mẫu nhiễm/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100
Tỉ lệ mẫu tạo callus (%) = (Tổng số mẫu tạo callus/Tổng số mẫu thí nghiệm)*100
Hệ số nhân chồi = Số chồi nhân lên/Tổng số mẫu ban đầu
Tỉ lệ chồi ra rễ (%) = (Tổng chồi ra rễ/Tổng số mẫu in vitro)*100
Chiều dài trung bình của chồi (cm) = Tổng chiều dài của chồi/Số chồi
Số lá/chồi = tổng số lá của chồi/Số chồi
Chiều dài trung bình của rễ (cm) = Tổng chiều dài của rễ/Số rễ
3.5.3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu
Trước khi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu với nồng độ và thời gian xử lý hỗn hợp nano, chúng tôi thực hiện các bước chuẩn bị cần thiết.
B1 Rửa sạch mẫu dưới vòi nước chảy cho sạch bụi đất
B2 Đưa mẫu vào phòng nuôi và rửa lại bằng nước cất vô trùng thêm 2-3 lần nữa
B3 Cho mẫu vào box cấy, đổ ngập cồn 70 o trong 1 phút
B5 Rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần cho sạch cồn
Thí nghiệm 1.1: Ảnh hưởng của nồng độ hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp
Khử trùng mẫu với các công thức khác nhau:
- CT1: javen thương mại 5% lắc mẫu trong vòng 5 phút (đối chứng).
- CT2: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 100 ppm
- CT3: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 150 ppm
- CT4: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 200 ppm
- CT5: dung dịch hỗn hợp nano bạc–đồng 250 ppm
(CT2, CT3,CT4, CT5 thực hiện trong 1 giờ, cú 15 phút lắc một lần)
Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần tiên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống
Thí nghiệm 1.2: Ảnh hưởng của thời gian xử lý hỗn hợp nano bạc-đồng đến hiệu quả khử trùng mẫu hoa hồng Pháp
Sử dụng nồng độ hỗn hợp nano tốt nhất ở thí nghiệm 1.1 và xử lý ở 5 thời gian khác nhau là (30, 45, 60, 75, 90 phút) tương ứng với 5 công thức
Mẫu được theo dõi ở thời điểm sau 2, 3, 4 tuần nuôi cấy, các thí nghiệm được thực hiện lặp lại 3 lần liên tiếp, mỗi công thức thí nghiệm 20 mẫu
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ mẫu nhiễm, tỷ lệ mẫu sạch, tỷ lệ mẫu sống
3.5.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 2.1 nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ của hoa hồng Pháp Đoạn thân này, sau khi được khử trùng bằng hỗn hợp nano bạc - đồng ở nồng độ và thời gian tối ưu, đã được sử dụng để tiến hành tái sinh chồi.
Chất điều tiết sinh trưởng BA được bổ sung vào môi trường nuôi cấy với 5 công thức tương ứng như sau:
CT1: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA
CT2: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA
CT3: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA
CT4: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA
CT5: MS + 0,05 mg/l -NAA + 30 g/l sucrose + 2,5 mg/l BA
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là 20 mẫu
Mẫu được đánh giá sau 2, 3,4 tuần trên môi trường nuôi cấy
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi
Sau khi xử lý dữ liệu, chúng tôi sẽ xác định được công thức với nồng độ BA tối ưu (M1) cho quá trình tái sinh chồi từ đoạn thân có mắt ngủ.
Thí nghiệm 2.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ hoa hồng Pháp
Sau khi xác định môi trường M1 có nồng độ BA tối ưu cho việc bật chồi hoa hồng Pháp, chúng tôi tiến hành thí nghiệm để khảo sát tác động của nồng độ nano bạc bổ sung vào môi trường M1 đối với quá trình tái sinh chồi từ đoạn thân mang mắt ngủ Các nồng độ nano bạc được sử dụng trong thí nghiệm sẽ được trình bày cụ thể.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
Mẫu được đánh giá sau 2, 3, 4 tuần trên môi trường nuôi cấy
Chỉ tiêu theo dõi:Tỷ lệ tái sinh chồi (%), hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm), số lá/chồi
3.5.3.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA và nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 3.1 nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng IBA đến quá trình tạo mô sẹo (callus) của hoa hồng Pháp Mẫu lá cây hoa hồng in vitro có kích thước từ 0,5 cm đến 1,5 cm được cắt bỏ răng cưa và tạo vết thương, sau đó được đưa vào môi trường tạo callus với 5 nồng độ IBA khác nhau, tương ứng với 5 điều kiện thí nghiệm.
CT1: MS + 30g/l sucrose + 0,0 mg/l IBA
CT2: MS + 30g/l sucrose + 0,1 mg/l IBA
CT3: MS + 30g/l sucrose + 0,3 mg/l IBA
CT4: MS + 30g/l sucrose + 0,5 mg/l IBA
CT5: MS + 30g/l sucrose + 0,7 mg/l IBA
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
20 mẫu Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ mẫu tạo callus
Sau khi có kết quả, chúng tôi tìm ra công thức phù hợp nhất (M2) cho quá trình tạo mô sẹo từ lá in vitro
Thí nghiệm 3.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến quá trình tạo mô sẹo (callus) hoa hồng Pháp
Sau khi xác định môi trường bổ sung BA tối ưu cho quá trình tạo mô sẹo hoa hồng Pháp là M2, chúng tôi tiến hành thí nghiệm để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nano được bổ sung vào môi trường M2 đến quá trình hình thành mô sẹo Các nồng độ nano được thử nghiệm bao gồm nhiều mức khác nhau nhằm đánh giá tác động của chúng.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
20 mẫu Đánh giá mẫu sau 4, 5, 6 tuần trên môi trường nuôi cấy để xác định chỉ tiêu: Tỷ lệ tạo callus
3.5.3.4 Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng BA và nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 4.1: Ảnh hưởng của của chất điều tiết sinh trưởng BA đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Chồi phát triển từ mắt ngủ có chiều dài khoảng 1,5 - 2,0 cm và thường có từ 3 đến 4 lá Những chồi này được cắt và nuôi trong môi trường tái sinh chồi in vitro với sự bổ sung BA ở các nồng độ khác nhau, tương ứng với 5 CT.
CT1: MS + 30 g/l sucrose + 0,0 mg/l BA
CT2: MS + 30 g/l sucrose + 0,5 mg/l BA
CT3: MS + 30 g/l sucrose + 1,0 mg/l BA
CT4: MS + 30 g/l sucrose + 1,5 mg/l BA
CT5: MS + 30 g/l sucrose + 2,0 mg/l BA
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
Chỉ tiêu theo dõi trong nghiên cứu này bao gồm việc đánh giá mẫu sau 2, 3, 4, 5 và 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy Các chỉ tiêu cần xác định bao gồm hệ số nhân chồi (lần), chiều cao trung bình của chồi (cm) và số lá mỗi chồi.
Sau khi xử lý số liệu, chúng tôi tìm được ra công thức thích hợp nhất (M3) cho quá trình tái sinh chồi in vitro
Thí nghiệm 4.2: Ảnh hưởng của nano bạc đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro hoa hồng Pháp
Sau khi xác định môi trường bổ sung BA tối ưu cho quá trình nhân chồi in vitro hoa hồng Pháp là M3, tôi đã tiến hành thí nghiệm để nghiên cứu tác động của các nồng độ nano bổ sung vào môi trường M3 đối với quá trình này Các nồng độ nano được thử nghiệm bao gồm nhiều mức khác nhau.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
Để đánh giá sự phát triển của mẫu, cần theo dõi các chỉ tiêu sau sau 2, 3, 4, 5 và 6 tuần nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy Các chỉ tiêu quan trọng bao gồm hệ số nhân chồi (số lần nhân giống), chiều cao trung bình của chồi (tính bằng cm) và số lượng lá trên mỗi chồi.
3.5.3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA và nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Thí nghiệm 5.1: Ảnh hưởng chất điều tiết sinh trưởng -NAA đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Chồi được lấy từ mắt ngủ và chuyển sang môi trường nhân nhanh, sau 6 tuần, các chồi này sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ có bổ sung -NAA với các nồng độ khác nhau tương ứng với 5 CT.
CT1: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 0mg/l -NAA
CT2: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 1mg/l -NAA
CT3: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 2mg/l -NAA
CT4: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 3mg/l -NAA
CT5: ẳ MS + 1g/l than hoạt tớnh + 4mg/l -NAA
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
20 mẫu theo dõi sự phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần
Chỉ tiêu theo dõi bao gồm tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm) và số rễ/chồi Qua việc xử lý kết quả, chúng tôi xác định được môi trường có nồng độ α-NAA tối ưu (M4) để thúc đẩy sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp.
Thí nghiệm 5.2: Ảnh hưởng nano bạc đến sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp
Sau khi xác định được nồng độ -NAA tối ưu, chúng tôi tiến hành thí nghiệm để nghiên cứu tác động của nồng độ nano bạc bổ sung vào môi trường M4 đối với sự ra rễ của chồi cấp 2 hoa hồng Pháp, với các công thức được thiết lập cụ thể.
Thí nghiệm được bố trí gồm 5 công thức, 3 lần nhắc lại, mỗi công thức là
20 mẫu theo dõi sư phát triển ra rễ sau 4, 5, 6 tuần
Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ chồi ra rễ, chiều cao trung bình của rễ (cm), số rễ/chồi
- Các số liệu được xử lý thô trên Microsoft Office Excel 2007
- Các số liệu được tính toán trên máy tính theo chương trình IRRISTAT 5.0.