TỔNG QUAN
Tổng quan bệnh học xơ gan
Bệnh gan mạn tính là tình trạng bệnh lý đặc trưng bởi sự rối loạn chức năng gan kéo dài, được xác định qua các triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm sinh hóa.
Bệnh gan mạn tính gây ra sự phá hủy và thoái hóa liên tục của mô gan, tiến triển qua các giai đoạn từ xơ hóa gan (fibrosis) đến xơ gan (cirrhosis) trong vòng 6 tháng.
Bệnh xơ gan được định nghĩa dựa trên các tổn thương giải phẫu bệnh của gan, trong đó sự cân bằng giữa tạo sợi và phân hủy sợi bị rối loạn, dẫn đến tích tụ mô sẹo quá mức Mô sẹo hình thành là phản ứng bình thường của cơ thể với tổn thương, nhưng trong xơ gan, quá trình làm lành này không thành công Tùy thuộc vào nguyên nhân, xơ gan có thể đi kèm với các triệu chứng lâm sàng đặc trưng khác Dù nguyên nhân gây bệnh khác nhau, các thành phần của mô sẹo trong xơ gan thường giống nhau, bao gồm chất nền ngoại bào, collagen type I và III, muối sulfate proteoglycan và glycoprotein.
Xơ hóa gan thường tiến triển âm thầm, với hầu hết các biến chứng và tử vong xảy ra khi bệnh đã phát triển đến giai đoạn xơ gan Đặc biệt, nhiều bệnh nhân có thể mất đến 15-20 năm để tiến triển từ xơ hóa gan sang xơ gan.
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vào năm 2015, xơ gan đứng thứ 11 trong danh sách nguyên nhân gây tử vong toàn cầu, với hơn 1 triệu ca tử vong.
Trên toàn cầu, khoảng 400 triệu người đang sống với virus viêm gan B (HBV), chủ yếu tập trung ở các khu vực Châu Á, Châu Phi và Địa Trung Hải Việt Nam, nằm trong khu vực Châu Á, đang phải đối mặt với gánh nặng cao từ bệnh viêm gan virus.
11 người thì có 1 người bị viêm gan B và C mạn tính Tại Việt Nam, viêm gan B và
Xơ gan, ung thư gan và tử vong do gan là những nguyên nhân chính gây ra nhiều vấn đề sức khỏe nghiêm trọng tại Việt Nam Theo thống kê năm 2012, xơ gan đứng thứ 9 trong danh sách nguyên nhân tử vong, với hơn 14.000 ca tử vong, chiếm 2,7% tổng số ca tử vong Đến năm 2017, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) ước tính có khoảng 104.460 người mắc viêm gan virus chuyển sang xơ gan mất bù, trong đó 86,8% trường hợp là do nhiễm virus viêm gan B.
Biểu đồ 1.1 Nguyên nhân gây xơ gan
- Xơ gan do nhiễm virus: Đứng hàng đầu là viêm gan B, C và hay phối hợp
D gây xơ gan nốt lớn (xơ gan sau hoại tử) [4]
- Xơ gan do biến dưỡng
- Xơ gan do gan nhiễm mỡ không do rượu (NASH) [47]
- Xơ gan đồng huyết thanh tăng
- Xơ gan do rối loạn miễn dịch
- Xơ gan mật nguyên phát: Xơ gan cơ học
- Xơ gan mật thứ phát: Xơ gan do thuốc
- Các nguyên nhân khác chưa được chứng minh
1.1.4 Sinh lý b ệ nh c ủa xơ hóa gan và xơ ga n
1.1.4.1 Cấu trúc gan bình thường
Hình 1.1 Cấu trúc xoang và vị trí tế bào sao ở gan bình thường [16 ]
- Tế bào gan (thành phần biểu mô)
- Lớp nội mô hình sin
- Tế bào Kupffer (đại thực bào mô)
Tế bào sao, còn được biết đến với tên gọi tế bào Ito, tế bào mỡ, hay tế bào quanh xoang, nằm trong khoảng Disse và có chức năng chính là lưu trữ vitamin A cùng các retinoids Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành xơ hóa gan.
Bình thường, các tế bào gan được bao phủ bởi lớp nội mô có các khe Tế bào Kupffer nằm trong lòng xoang, sát thành lớp nội mô [Hình 1.1]
1.1.4.2 Thay đổi cấu trúc gan khi bị tổn thương
Sau tổn thương gan cấp tính như viêm gan virus, các tế bào gan tăng sinh để thay thế cho các tế bào bị hoại tử hoặc chết theo chương trình Quá trình này gắn liền với phản ứng viêm và sự tích tụ có giới hạn của chất nền ngoại bào Tuy nhiên, nếu tổn thương tiếp tục kéo dài, khả năng tái sinh của gan sẽ không đủ để phục hồi, dẫn đến việc các tế bào gan bị thay thế bởi một lượng lớn chất nền ngoại bào, chủ yếu là sợi collagen.
Quá trình xơ hóa gan diễn ra với bốn thay đổi chính trong mô gan xơ hóa so với mô gan bình thường, bao gồm: (1) tái sắp xếp mô học; (2) thay đổi vi cấu trúc của chất nền ngoại bào (ECM); (3) tăng hàm lượng ECM; và (4) thay đổi thành phần của ECM.
- Các quá trình ảnh hưởng đến phát triển và duy trì ECM :
Hoạt hóa tế bào hình sao là sự kiện quan trọng trong quá trình xơ hóa gan Trong gan khỏe mạnh, tế bào sao ở trạng thái nghỉ và chỉ sản sinh một lượng nhỏ collagen type III và IV Tuy nhiên, sau tổn thương mạn tính, chúng chuyển sang trạng thái hoạt hóa, trở thành nguyên bào sợi và di chuyển đến các vùng mô cần sửa chữa Tại đây, tế bào hình sao tiết ra lượng lớn collagen và chất nền ngoại bào, đồng thời kích thích tế bào miễn dịch giải phóng cytokine, yếu tố tăng trưởng và các chất hóa học khác Những chất này hỗ trợ tế bào gan hoạt hóa, dẫn đến sự giải phóng collagen type I, III, IV, VI, acid hyaluronic và glycoprotein, tạo ra sự tích tụ chất nền ngoại bào trong gan, trong khi quá trình phân hủy collagen bị suy giảm.
Biểu đồ 1.2 Sự hoạt hóa tế bào sao và xơ hóa gan [16]
Ngoài tế bào hình sao, vai trò của tế bào nguồn gốc từ tủy xương trong hình thành và lắng đọng ECM ngày càng được làm rõ Trong quá trình xơ gan, có sự xuất hiện của các kháng nguyên chống tế bào gan, chống hồng cầu và chống gama-globulin, dẫn đến hủy hoại tế bào gan, tiêu hủy hồng cầu, gây thiếu máu và gia tăng nguy cơ nhiễm trùng.
Sự chết theo chương trình của tế bào gan là một hiện tượng thường gặp trong tổn thương gan, đóng vai trò quan trọng trong việc gây viêm mô, xơ hóa và phát triển bệnh xơ gan Nhiễm HCV và tiêu thụ ethanol đều dẫn đến hiện tượng này ở cả mô hình động vật và con người.
Hydroxyproline là một axit amin quan trọng trong collagen, được hình thành từ quá trình hydroxyl hóa proline Sự hiện diện của hydroxyproline trong ma trận ngoại bào (ECM) do các tế bào hình sao sản xuất giúp duy trì tính toàn vẹn và chức năng của tế bào gan Mức độ hydroxyproline trong mô gan, huyết thanh và nước tiểu có thể phản ánh chính xác tốc độ và tiến triển của bệnh xơ gan Việc định lượng hydroxyproline được sử dụng trong các nghiên cứu như một dấu hiệu chẩn đoán hoặc để đánh giá hiệu quả của các biện pháp can thiệp điều trị, bao gồm cả thảo dược và không thảo dược Test này có vai trò quan trọng trong việc phát hiện không xâm lấn sự xơ hóa của bệnh gan mạn tính.
1.1.5 Mô b ệ nh xơ gan sau ho ạ i t ử
Xơ gan sau hoại tử là hệ quả của quá trình hoại tử gan, thường do viêm gan virus B, viêm gan virus không A không B, bệnh tự miễn, hoặc ngộ độc từ thuốc như oxyphenisat, methyldopa và isoniazid Về đại thể, gan bị thu nhỏ, mật độ trở nên cứng và mô sợi tăng sản chia tách gan thành các cục không đều Về vi thể, tế bào gan xuất hiện thoái hoá mỡ, hoại tử và xơ hóa diễn ra đồng thời, tạo thành các dải xơ nối các khoảng cửa Mô sợi tăng sản hình thành nhiều ổ tái tạo và ổ hoại tử, trong khi khoảng cửa cũng gia tăng sợi và thâm nhập tế bào viêm như lymphô bào và tương bào Các ống mật trong dải xơ cũng trải qua tình trạng tăng sản.
Hình 1.2 Xơ gan - Mô sợi xơ tăng sản phân cắt gan thành các tiểu thùy giả và thâm nhập nhiều tế bào viêm mạn ( HE x 500 )
Nguồn: Cirrhosis_ Nephron, Wikimedia Commons
Các mô hình gây xơ gan trên động vật thí nghiệm
Các mô hình động vật đã được sử dụng trong nhiều thập kỷ để nghiên cứu quá trình xơ hóa và đánh giá tiềm năng chống xơ hóa của các liệu pháp Dù rất hữu ích cho việc hiểu biết về sinh lý bệnh, nhưng không mô hình nào tái tạo hoàn toàn căn bệnh ở người Mỗi mô hình, bao gồm tác nhân, thiết kế, chủng và loài, thể hiện các đặc điểm riêng trong sinh bệnh học, định khu và tiến triển của xơ hóa Hiện nay, nhiều mô hình xơ gan trên động vật như chuột nhắt, chuột cống, thỏ và lợn đã được phát triển để mô phỏng quá trình xơ hóa và xơ gan ở người Bài viết này sẽ đề cập đến một số mô hình gây xơ hóa gan phổ biến trên động vật thực nghiệm.
1.2.1 Gây xơ gan bằ ng các tác nhân hóa h ọ c
Các tác nhân hóa học như CCl4, thioacetamid, dimethylnitrosamin, diethylnitrosamin, dioxin, natri asenat và ethanol thường gây tổn thương trực tiếp tế bào gan, dẫn đến hoại tử và kích hoạt phản ứng viêm Những tác nhân này khởi động một loạt quá trình phức tạp, cuối cùng dẫn đến xơ hóa và xơ gan.
Nhóm mô hình này rất phổ biến nhờ vào độ lặp lại cao và tính dễ thực hiện, đồng thời có nhiều điểm tương đồng với cơ chế gây xơ hóa gan ở người Tuy nhiên, việc kiểm soát trở nên khó khăn khi tác nhân gây xơ hóa được đưa vào một cách tự do qua thức ăn hoặc nước uống, hay khi quá trình hấp thu và chuyển hóa bị ảnh hưởng Sử dụng các tác nhân hóa học khác nhau cũng dẫn đến sự khác biệt về thời gian gây xơ hóa, thời gian phát triển thành xơ gan, và vị trí tổn thương điển hình của từng mô hình.
1.2.1.1 Gây xơ gan bằng carbon tetraclorid
Carbon tetrachlorid (CCl4) là chất gây xơ hóa phổ biến trong nghiên cứu xơ gan trên động vật gặm nhấm Mô hình xơ gan từ carbon tetrachlorid tương đồng với quá trình hình thành xơ gan ở người do tiếp xúc với các tác nhân độc hại.
Khi sử dụng CCl4, xơ hóa gan phát triển theo một quy trình tuyến tính, bắt đầu từ trung tâm tiểu thùy và lan rộng ra vách tĩnh mạch trung tâm, sau đó là vách tĩnh mạch cửa Xơ hóa thường trở nên rõ rệt sau 2-4 tuần phơi nhiễm, với xơ hóa nghiêm trọng xuất hiện sau 5-7 tuần và xơ gan thường xảy ra sau 8-10 tuần Các triệu chứng như xơ gan nốt nhỏ, tăng áp lực tĩnh mạch cửa và cổ trướng thường xuất hiện trong khoảng 10-20 tuần Thời gian hình thành xơ hóa và tiến triển thành xơ gan có sự khác biệt tùy thuộc vào liều lượng, đường dùng và loại động vật thí nghiệm Đặc biệt, độ nhạy cảm với CCl4 có thể thay đổi giữa các chủng động vật, và xơ hóa có thể đảo ngược trong thời gian ngắn sau khi ngừng sử dụng CCl4.
Để tăng cường độc tính của CCl4, một số nghiên cứu đã kết hợp CCl4 với chất cảm ứng enzym CYP2E1, như phenobarbital, nhằm thúc đẩy quá trình hình thành xơ hóa và rút ngắn thời gian mô hình Tuy nhiên, phương pháp này cũng dẫn đến tỷ lệ tử vong cao ở động vật thí nghiệm Mặc dù tổn thương ngoài gan là tối thiểu do CYP2E1 chủ yếu tồn tại trong gan, tình trạng viêm và hoại tử vẫn có thể xảy ra tại chỗ tiêm, ảnh hưởng tiêu cực đến sức khỏe của động vật.
Thời gian giữa liều CCl 4 cuối cùng và khi giết động vật thí nghiệm để lấy mẫu nghiên cứu là yếu tố quan trọng Nếu giết chuột quá sớm, viêm và hoại tử sẽ chiếm ưu thế, trong khi nếu giết quá muộn (sau 3 ngày), quá trình phục hồi tổn thương sẽ trở nên nổi bật Do đó, thời điểm lý tưởng để giết chuột và lấy mẫu xét nghiệm là trong khoảng 48 đến 72 giờ sau liều CCl 4 cuối cùng.
Tiêm màng bụng là phương pháp phổ biến nhờ tính thuận tiện và khả năng dung nạp tốt, nhưng có thể gây viêm phúc mạc mạn tính, ảnh hưởng đến sức khỏe động vật và kết quả nghiên cứu Về việc sử dụng CCl4 qua đường uống, một số tác giả cho rằng đây là cách cho kết quả xơ hóa cao với tỷ lệ sống sót chấp nhận được, trong khi những người khác không khuyến khích do tỷ lệ tử vong cao ở giai đoạn đầu Tiêm dưới da giúp giảm tỷ lệ tử vong nhưng có thể gây u hạt và hoại tử tại chỗ tiêm Ngoài ra, CCl4 đường hít cũng được sử dụng để gây xơ hóa gan, với ưu điểm không xâm lấn và không gây phản ứng viêm, nhưng yêu cầu dụng cụ chuyên biệt và kinh nghiệm.
1.2.1.2 Gây xơ gan bằng thioacetamid
Thioacetamid (TAA) là một tác nhân sinh ung thư thường được sử dụng để gây xơ hóa gan trên động vật thực nghiệm Trong cơ thể, TAA được chuyển hóa bởi CYP450 thành chất chuyển hóa độc tính, dẫn đến hình thành các khối u trong gan khi sử dụng liều thấp kéo dài Ngược lại, liều cao TAA gây hoại tử tế bào gan và xơ hóa Tổn thương điển hình do TAA gây ra chủ yếu xảy ra quanh tĩnh mạch cửa Tuy nhiên, một hạn chế của mô hình TAA là thời gian phát triển xơ hóa kéo dài từ 12-20 tuần Ngoài ra, ung thư đường mật và ung thư biểu mô tế bào gan cũng đã được ghi nhận trên chuột thí nghiệm sau thời gian dài tiếp xúc với TAA.
1.2.1.3 Gây xơ gan bằng dimethylnitrosamin và diethylnitrosamin
Dimethylnitrosamin (DMN) và diethylnitrosamin (DEN) là hai hợp chất gây ung thư thường được sử dụng để tạo ra xơ hóa gan ở động vật thí nghiệm Cơ chế gây xơ hóa gan của DMN và DEN tương tự như CCl4, nhưng khác biệt ở chỗ xơ hóa gan do DEN và DMN gây ra có thể duy trì và phát triển trong nhiều tuần hoặc tháng sau khi ngừng tiếp xúc với các tác nhân này Ung thư có thể phát triển sau một thời gian tiếp xúc với DEN, dù tiếp tục sử dụng hay đã ngừng Vì vậy, mô hình này không phải là lựa chọn hàng đầu cho nghiên cứu xơ hóa đơn thuần, nhưng có thể hữu ích trong việc nghiên cứu mối quan hệ giữa xơ hóa gan và ung thư biểu mô tế bào gan.
1.2.2 Gây xơ gan bằng phương pháp thắ t ố ng d ẫ n m ậ t
Mô hình gây xơ hóa gan và xơ gan thông qua phương pháp thắt ống dẫn mật lần đầu tiên được thực hiện trên chuột cống trắng vào năm 1996 và sau đó áp dụng cho chuột nhắt trắng vào năm 1999 Chuột cống trắng được chọn do thiếu túi mật, làm cho chúng trở thành đối tượng lý tưởng cho mô hình này Khi thắt ống dẫn mật, các biến cố như tắc nghẽn ống mật, viêm, tăng tiết cytokine và ứ mật xảy ra, dẫn đến sự tăng sinh tế bào biểu mô đường mật và tiểu quản mật, kèm theo viêm và xơ hóa ở khoảng cửa Ngoài tế bào hình sao, các nguyên bào sợi ở khoảng cửa cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây xơ hóa trong mô hình này.
Mô hình thắt ống dẫn mật dẫn đến xơ hóa sau vài tuần, với rối loạn huyết động và cổ trướng xuất hiện trong khoảng 6-8 tuần Nguyên nhân tử vong trong giai đoạn đầu thường liên quan đến rò rỉ mật hoặc vỡ u nang ống mật Mặc dù tỷ lệ tử vong cao (>20% và thường xảy ra sau tuần thứ 4) là hạn chế lớn nhất của mô hình này, nhưng nó vẫn có thể được áp dụng cho các nghiên cứu ngắn hạn về xơ gan do ứ mật.
Viên nang cứng CTHepaB
1.3.1 Cơ sở xây d ự ng c ủ a ch ế ph ẩ m thu ố c nghiên c ứ u CTHepaB
- Là bài thuốc kinh nghiệm của PGS Đậu Xuân Cảnh đã đúc rút trong quá trình làm lâm sàng , có hiệu quả nhất định trên bệnh nhân
- Thành phần bài thuốc CTHepaB gồm 8 vị ( 2 ngày/thang) :
Cà gai leo 30g Cỏ sữa lá nhỏ 20g Chi tử 10g Đại hoàng 5g Đinh lăng 10g Đông trùng hạ thảo 5g Linh chi 10g Hà thủ ô 10g
- Dựa vào lý luận của y học cổ truyền, các triệu chứng biểu hiện của bệnh [3]
Dựa vào các tính năng của các vị thuốc, bài thuốc điều trị triệu chứng bệnh xơ gan bao gồm 8 vị thuốc có tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi thấp thoái hoàng, bổ khí ích tinh, và tư dưỡng can thận.
+ Quân: Cà gai leo : tác dụng thanh nhiệt giải độc, lợi thủy thấp
Cỏ sữa nhỏ lá và chi tử có tác dụng thanh nhiệt, giải độc cho gan, đồng thời giúp lợi thấp và giảm triệu chứng vàng da Các thành phần như đinh lăng, đông trùng hạ thảo, linh chi và hà thủ ô bổ sung khí huyết, ích tinh, nuôi dưỡng gan thận, nâng cao chính khí và đẩy lùi thấp nhiệt độc.
+ Sứ : Đại hoàng, lương huyết hoạt huyết, dẫn thấp nhiệt qua đường đại tiện
Các vị thuốc có tác dụng bảo vệ tế bào gan và ức chế hoạt động của virus đã được chứng minh qua thành phần hóa học của chúng Những vị thuốc này không chỉ giúp gan hoạt động hiệu quả hơn mà còn hỗ trợ tăng cường sức đề kháng cho cơ thể.
Nghiên cứu thực nghiệm và lâm sàng đã chỉ ra rằng các vị thuốc như Cà gai leo, Đông trùng hạ thảo, Nấm linh chi và Đại hoàng có tác dụng ức chế sự nhân lên và tiêu diệt một phần virus viêm gan B (HBV), đồng thời ức chế sự phát triển của xơ gan.
Các vị thuốc trong CTHepaB đều tuân thủ tiêu chuẩn dược điển Việt Nam V Bài thuốc được sấy ở nhiệt độ 60 độ C trong 2 giờ, sau đó được cô cao, loại tạp và phun sấy để tạo ra bột cao khô, cuối cùng được đóng thành viên nang cứng.
Viên nang cứng CTHepaB được phát triển và kiểm định theo tiêu chuẩn của Bộ Y Tế và hướng dẫn ICH, phù hợp với điều kiện khí hậu nóng ẩm (vùng IVb), từ đó xác định độ ổn định và hạn sử dụng của sản phẩm.
Viên nang cứng CTHepaB đã thử độc tính cấp và bán trường diễn (3 tháng) trên chuột và cho kết quả an toàn, không gây ảnh hưởng chung của chuột
Hình 1.4 Dạng thô của các vị thuốc trong bài thuốc CTHepaB
1.3.3 Tác d ụ ng các v ị trong bài thu ố c
- Tên khác: Cà gai dây, cà vạnh, cà quýnh, cà lù, gai cườm
- Tên khoa học: Solanum hainanense Hance Solanaceae
- Bộ phận dùng: Rễ, cành lá, thu hái quanh năm, phơi hay sấy khô Có khi dùng cả tươi
- Thành phần hóa học: Rễ cây có chứa tinh bột và nhiều chất hóa học khác nhau, đặc biệt là glycoancaloid
Tác dụng dược lý của sản phẩm bao gồm việc bảo vệ tế bào gan, hỗ trợ điều trị bệnh viêm gan virus và ngăn chặn sự phát triển của xơ gan, do đó rất hữu ích trong việc điều trị các bệnh lý liên quan đến gan mật.
- Tính vị quy kinh: Vị hơi the, đắng, có tính ấm
- Tác dụng tiêu độc, trừ ho, tán phong thấp, giảm đau, cầm máu [17]
- Tên khoa học: Euphorbia thymifolia, thuộc họ thầu dầu (Euphorbiaceae), Tên khác: vú sữa đất hay thiên căn thảo
Bộ phận sử dụng của cây là toàn bộ cây có sữa, với lá nhỏ, được thu hái quanh năm nhưng tốt nhất vào mùa hè và thu Sau khi thu hái, cần rửa sạch và có thể dùng tươi hoặc phơi khô để làm thuốc.
Cây cỏ sữa chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng, bao gồm hoạt chất cosmoslin có trong thân và lá, cùng với taraxerol, tirucallol và myrixylalcohol có trong rễ Ngoài ra, cây còn có các flavonoid và hợp chất phenol được xác định là những thành phần chính.
Tác dụng dược lý của các hợp chất này bao gồm khả năng kháng khuẩn và kháng nấm, giúp chống dị ứng và viêm nhiễm Ngoài ra, chúng còn có tác dụng ức chế miễn dịch, ức chế sự phát triển của khối u và chống virus Các hợp chất này cũng mang lại hiệu quả an thần, giảm đau và bảo vệ gan.
- Tính vị quy kinh: Cỏ sữa lá nhỏ có vị ngọt đắng nhạt, hơi chua, tính lạnh
- Tác dụng: thông huyết, tiêu viêm, tiêu độc, lợi tiểu, kháng khuẩn, thông sữa [17]
- Tên khoa học: Gardeniae jasminoidis Ellis, thuộc họ cà phê
(Rubiaceae) Tên khác: Dành Dành, Sơn chi, Sơn chi tử
- Bộ phận dùng: Quả chín dành dành
Phơi khô: Có tác dụng thanh nhiệt, giải độc Sao vàng: Có tác dụng hạ hỏa, cầm máu
- Tính vị quy kinh: Vị đắng tính hàn Quy tâm, phế, tam tiêu
- Thành phần hóa học: Gardenoside, Geniposide, Genipin, Crocin, Cocetin D-mannitol, Sitostreol
Thuốc có tác dụng tả hỏa, trừ phiền, thanh nhiệt, lợi thấp, lương huyết và giải độc Nó chủ trị các triệu chứng như nhiệt, bệnh tâm phiền, sốt cao, bứt rứt, thấp nhiệt vàng da, tiểu ít, đỏ, cùng với các tình trạng nhiệt lâm, huyết lâm, huyết nhiệt xuất huyết, ung thũng sang độc Ngoài ra, thuốc còn có thể được sử dụng để đắp ngoài trị chấn thương phần mềm.
- Tên khoa học: Rheum palmatum
Baill Họ Rau Răm (Polygonaceae)
- Bộ phận dùng: Thân, rễ (Radix et
- Thành phần hóa học: Emodin và
Nước sắc Đại hoàng có tác dụng lợi tiểu, bảo vệ gan và giảm cholesterol máu ở thỏ bị gây cao cholesterol và khi cho uống thuốc.
- Tính vị quy kinh: vị đắng, tính hàn, qui kinh Tỳ, Vị, Đại tràng, Can, Tâm
- Tác dụng: nhuận tràng; hạ hỏa và giải độc; hoạt huyết hóa ứ, lợi thủy, thanh nhiệt hóa thấp [7] Đinh lăng
- Tên khoa học: Polyscias fruticosa (L.) Harms
- Tên khác: Cây gỏi cá
- Bộ phận dùng: Rễ, thân, cành, lá (Radix,
- Tính vị quy kinh: Rễ Đinh lăng có vị ngọt, tính bình; lá vị nhạt, hơi đắng, tính bình
Rễ đinh lăng lá nhỏ chứa thành phần hóa học chính là saponin triterpenic, cùng với 20 loại acid amin, vitamin nhóm B và các nguyên tố vi lượng Đặc biệt, trong số các acid amin này, có những loại mà cơ thể con người không thể tự tổng hợp được.
Dịch chiết đinh lăng lá nhỏ có tác dụng dược lý tương tự như sâm Triều Tiên, nhưng ít độc hơn so với nhân sâm Triều Tiên và sâm Liên Xô Eleutherococus.
- Tác dụng : có tác dụng bổ năm tạng, giải độc, bổ huyết, tăng sữa, tiêu thực, tiêu sưng viêm Đinh lăng là thuốc tăng lực [17] Đông trùng hạ thảo
- Tên khoa học: Cordyceps militaris
- Tính vị quy kinh: Vị ngọt, tính bình Vào hai kinh Phế Thận
- Tác dụng: Bổ thận tráng dương, ích tinh khí, tư dưỡng phế âm, hóa đàm, chỉ huyết, bổ hư tổn
- Thành phần hóa học: Cordycepin, Adenosin
Cordyceps militaris có thể được canh tác nhân tạo và cho sản lượng cordycepin cao hơn Hàm lượng hoạt chất sinh học trong C militaris tương đương với C sinensis, loài nổi tiếng với nhiều thành phần hoạt tính sinh học quý giá Những hoạt chất này có tác dụng chống ung thư, chống huyết khối và chống viêm xơ.
- Kiêng kỵ : Người ho khạc ra máu do phế thực nhiệt hay người có biểu chứng không dùng [7]
- Tên khoa học: Ganoderma lucidum, thuộc họ nấm lim (Ganodermataceae)
- Tên khác: Tiên thảo, Nấm trường thọ,
- Bộ phận dùng: Hay dùng linh chi đỏ
- Tính vị quy kinh: Hồng chi có vị đắng, tính bình, không độc
- Thành phần hóa học: 7 Acid amin, protein, lipid, saponin, sterol và một số chất khác
Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về xơ gan – viêm gan virus B
Nghiên cứu của Li CX và cộng sự (1998) cho thấy viên Hán Đan Can Lạc, bao gồm các thành phần như Đan Sâm, Bạch Thược, Hoàng Kỳ, Phòng Kỷ và Ngân Hạnh Diệp, có tác dụng tích cực trên mô hình chuột bị xơ gan do CCl4 Thuốc đã làm thay đổi hình thái gan, giảm hơn 50% sự tích tụ collagen và tăng đáng kể lượng hydroxyproline trong nước tiểu Kết luận cho thấy Hán Đan Can Lạc hiệu quả trong việc bảo vệ gan chống xơ hóa nhờ vào đặc tính chống oxy hóa và khả năng điều chế chuyển hóa collagen.
Shimizu I và cộng sự (2000) đã chứng minh rõ ràng tác dụng phòng ngừa và điều trị của Tiểu Sài Hồ đối với bệnh xơ gan thực nghiệm, cũng như tác dụng ức chế của nó đối với việc kích hoạt các tế bào hình sao Trong số các thành phần hoạt động của Tiểu Sài Hồ, baicalin, baicalein và saikosaponin-a có khả năng ức chế sự tăng sinh tế bào Cần lưu ý rằng baicalin và baicalein là flavonoid có cấu trúc hóa học rất giống với silybinin, cho thấy các hoạt động chống xơ hóa Điều này có thể cung cấp thông tin có giá trị về việc tìm kiếm các tác nhân chống u xơ mới [57]
Nghiên cứu của Gong HY và cộng sự trên 25 bệnh nhân viêm gan B mãn tính cho thấy tác dụng tích cực của Đông Trùng Hạ Thảo (cordyceps sinensis) sau 3 tháng điều trị, với tỷ lệ CD4 và tỷ lệ CD4/CD8 tăng đáng kể Đồng thời, nồng độ acid hyaluronic và procollagen III, hai chỉ số tăng trong xơ gan, đã giảm đáng kể so với nhóm đối chứng.
Zhang Q (2003) đã quan sát các đặc điểm của xơ gan theo hội chứng Trung
Nghiên cứu trên 223 trường hợp xơ gan đã chỉ ra ba loại hội chứng chính: (1) Thấp Nhiệt, Huyết Ứ, Can Tỳ Khí Hư; (2) Khí Âm Lưỡng Hư với Khí Hư và Thấp nghiêm trọng kèm Nhiệt, Huyết Ứ; (3) Khí Âm Lưỡng Hư với Âm Hư nghiêm trọng, Thấp hoặc Nhiệt Uất Thấp Nhiệt được xem là cơ sở bệnh lý cho xơ gan sau viêm gan virus, trong khi mức độ rối loạn chức năng gan và tổn thương gan có thể là nguyên nhân dẫn đến Can Thận Âm Hư.
Q.Zhang và cộng sự (2006) đã tìm công thức phân biệt các mô hình hội chứng Trung Y ở 900 bệnh nhân xơ gan sau viêm gan virus Nghiên cứu cho thấy các chứng có thể được phân thành hai loại: một là các yếu tố liên quan đến đặc điểm chung, phản ánh bệnh lý cơ bản của xơ gan là Khí Hư và Huyết Ứ, hai là các yếu tố để phân biệt riêng 5 loại hội chứng (Can Thận Hư, Thấp Nhiệt Tích Tụ, Nhiệt Huyết Ứ Tích Tụ, Can Khí Uất Tỳ Hư và Tỳ Thận Khí Hư) Các chứng đa dạng cho thấy sự phức tạp và đa hình của việc xây dựng hội chứng [55]
Nghiên cứu của Cheng ML và cộng sự (2006) về "Viên nang Đan Thược Hóa Xơ trong điều trị xơ gan mất bù do viêm gan B" trên 30 bệnh nhân cho thấy thuốc có khả năng ức chế sự nhân lên của virus, dẫn đến giảm nhanh chóng nồng độ virus viêm gan B (HBV-DNA) trong huyết thanh đến mức không thể phát hiện Kết quả này giúp cải thiện đáng kể chức năng gan ở bệnh nhân xơ gan mất bù, tuy nhiên, hiệu quả lâu dài vẫn chưa được xác định rõ.
Han J và cộng sự (2009) đã chia 80 bệnh nhân xơ gan sau viêm gan B thành
Nghiên cứu phân chia bệnh nhân thành hai nhóm tải lượng virus cao và thấp theo xét nghiệm HBV-DNA, sau đó chia thành bốn nhóm điều trị khác nhau Nhóm A được điều trị bằng châm cứu và thuốc sắc Trung Dược kết hợp với viên Heptodin; nhóm B sử dụng viên Glucurolactone kết hợp với viên Heptodin; nhóm C chỉ điều trị bằng châm cứu và thuốc sắc Trung Dược; và nhóm D chỉ uống viên Glucurolactone Kết quả cho thấy, sau một tháng điều trị bằng châm cứu kết hợp với Trung Dược và thuốc tây, các triệu chứng lâm sàng của bệnh nhân xơ gan còn bù được cải thiện đáng kể hơn so với liệu pháp tây y đơn giản.
Nghiên cứu của Zhao XK và cộng sự (2014) đã chỉ ra rằng viên nang Đan Thược Hóa Xơ có tác động tích cực đến biểu hiện protein tạo hình xương-7 (BMP-7) và chất đối kháng Gremlin trong gan của chuột bị xơ hóa do CCl4 Kết quả cho thấy cơ chế điều trị của thuốc đối với bệnh xơ gan ở chuột có thể liên quan đến việc điều chỉnh sự ức chế sản xuất Gremlin và tăng cường sản xuất BMP-7.
Nghiên cứu của Chen H, Yang BW và các cộng sự (2016) đã chỉ ra tác dụng phòng ngừa và điều trị của viên nang Phù Chính Hóa Ứ, chiết suất từ các thành phần như Đan Sâm, Đông Trùng Hạ Thảo, Đào Nhân, Giảo Cổ Lam, Phấn Hoa Thông, và Ngũ Vị Tử, đối với bệnh xơ gan và biểu hiện yếu tố tăng trưởng mô liên kết ở chuột Trong thí nghiệm với 40 con chuột bị gây xơ gan bằng CCl4 và rượu, thuốc đã cho thấy hiệu quả tích cực trong việc phòng ngừa và điều trị bệnh xơ gan, đồng thời ức chế biểu hiện yếu tố tăng trưởng mô liên kết trong mô gan, có thể là một trong những cơ chế phân tử góp phần vào tác động này.
Nghiên cứu của Xiaoning Wang và các cộng sự (2015) tập trung vào sự thay đổi sinh học trong nước tiểu của bệnh nhân xơ gan sau viêm gan B, đặc biệt trong bối cảnh hội chứng Trung Y: Can Thận Âm Kết quả nghiên cứu này mang lại cái nhìn sâu sắc về mối liên hệ giữa các yếu tố sinh học và tình trạng bệnh lý, góp phần nâng cao hiểu biết về cơ chế bệnh sinh của xơ gan.
Hư và Thấp Nhiệt Nội Uẩn là một nhóm bằng chứng sinh học đáng tin cậy cho sự khác biệt hội chứng Trung Y ở bệnh nhân xơ gan sau viêm gan B Sự thay đổi các chất trong nước tiểu cho thấy tiềm năng sử dụng các dấu ấn sinh học trong việc phân loại hội chứng Trung Y.
Nghiên cứu của Ping Yi Hung và Chun-Lin Lee (2017) cho thấy Đông Trùng Hạ Thảo loài Cordyceps militaris có hiệu quả chống xơ gan cao hơn khi được nuôi cấy trong môi trường nước biển sâu Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thí nghiệm trên chuột bị xơ gan do TAA, và kết quả cho thấy những con chuột được sử dụng Cordyceps militaris có chỉ số hủy hoại tế bào gan giảm và hình ảnh vi thể gan ít dải sợi xơ hơn so với nhóm không được dùng Đặc biệt, nhóm chuột được nuôi bằng nước biển sâu thể hiện sự ức chế xơ gan rõ rệt, với mức giảm có ý nghĩa thống kê về TGF-β, chất kích hoạt tế bào hình sao thành nguyên bào sợi.
Trịnh Thị Xuân Hoà; Nguyễn Văn Mùi và cộng sự (2004) nghiên cứu trên
240 bệnh nhân viêm gan mạn tính virus B, được chia làm 2 nhóm, nhóm 1: gồm
Nghiên cứu đã tiến hành trên 90 bệnh nhân điều trị bằng Haina và 90 bệnh nhân nhóm chứng, cùng với 30 bệnh nhân điều trị Dihacharin và 30 bệnh nhân nhóm chứng Kết quả cho thấy, sau quá trình điều trị, các thuốc Haina và Dihacharin có tác dụng rõ rệt trong việc thay đổi các Marker của virus viêm gan B.
Nghiên cứu của Nguyễn Thượng Dong và cộng sự (2005) tập trung vào tác dụng bảo vệ gan và ức chế xơ gan của thuốc Cugama, được bào chế từ hỗn hợp Silymarin chiết xuất từ quả cúc gai di thực và cao tinh chế từ mã đề Nghiên cứu được thực hiện trên mô hình viêm gan mạn tính.
Cugama có khả năng ức chế sự hình thành và tích tụ collagen, giúp duy trì cấu trúc gan khỏe mạnh Hình ảnh gan chuột cho thấy hầu hết các tế bào gan đều bình thường, không có sự gia tăng mô liên kết xơ như ở các mẫu bệnh lý.
CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chất liệu nghiên cứu
Viên nang cứng CTHepaB được bào chế từ bài thuốc của Phó giáo sư Đậu Xuân Cảnh, với các thành phần dược liệu khô đạt tiêu chuẩn cơ sở.
Viên nang cứng CTHepaB 400mg được bào chế và sản xuất bởi Viện Đào Tạo Dược – Học Viện Quân Y, đạt tiêu chuẩn cơ sở và được sử dụng qua đường uống.
Thành phần bài thuốc gốc ( liều 2 ngày/ thang) có:
Cà gai leo (Solanum hainanense Hance Solanaceae) 30g
Cỏ sữa lá nhỏ (Euphorbia thymifolia Euphorbiaceae) 20g
Chi tử (Gardeniae jasminoidis Ellis Rubiaceae) 10g Đại hoàng (Fallopia multiflora (Thunb.) Polygonaceae) 5g Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) 10g Đông trùng hạ thảo ( Cordyceps militaris ) 5g
Linh chi đỏ ( Ganoderma lucidum Ganodermataceae) 10g
Hà thủ ô 10g (Fallopia multiflora (Thunb.) Haraldson) 10g
Hình 2.1 Viên nang cứng CTHepaB dùng để thử trên chuột cống trắng
Liều dùng hàng ngày cho một người là 4g, tương đương với 50g dược liệu khô, được tính theo 15g cà gai leo, 10g cỏ sữa lá nhỏ, 5g chi tử, 2,5g đại hoàng, 5g đinh lăng, 2,5g đông trùng hạ thảo, 5g linh chi đỏ và 5g hà thủ ô Đối với người có trọng lượng 50kg, liều dùng dự kiến là 0,08g/kg/ngày Khi quy đổi sang chuột cống với hệ số quy đổi 0,7, liều tương đương sẽ là 0,56g/kg/ngày.
2.1.2 Thu ốc đố i ch ứ ng
Silymarin, hay còn gọi là Legalon, là sản phẩm của hãng Madaus (Pháp) với thành phần chính là cao khô từ quả cây Silybum marianum Viên nang Silymarin 140mg được hòa tan trong nước cất để sử dụng.
Hình 2.2 Thuốc đối chứng Silymarin, biệt dược Legalon
2.1.3 Thu ốc gây mô hình xơ gan trêm chuộ t c ố ng tr ắ ng
Dung dịch cacbon tetraclorua CCl4 gây hoại tử tế bào gan tại trung tâm tiểu thùy, kích hoạt các phản ứng làm lành vết thương để phục hồi tế bào gan Tuy nhiên, nếu tổn thương gan tiếp tục, quá trình tái sinh không đủ để phục hồi, dẫn đến việc tế bào gan bị thay thế bởi chất nền ngoại bào, chủ yếu là collagen, gây ra xơ hóa.
Mô hình gây xơ gan bằng carbon tetraclorid có nhiều điểm tương đồng với quá trình hình thành và phát triển xơ gan do tiếp xúc với các tác nhân độc hại ở người.
2.1.4 Phương tiệ n – Hóa ch ấ t nghiên c ứ u khác
- Máy xét nghiệm sinh hoá tự động Chemix 180 hãng Sysmex
- Máy xét nghiệm huyết học tự động XE2100, hãng Sysmex
- Cân phân tích 10-4, model CP224S (Sartorius - Đức)
Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ bao gồm kim cong đầu tù cho chuột uống thuốc, được nhập khẩu từ Nhật Bản, cùng với các dụng cụ thí nghiệm khác như lam kính và giấy lọc Whatmann.
Hình 2.3 Máy xét nghiệm huyết học và sinh hóa
- Hóa chất làm xét nghiệm và gây xơ gan trên động vật thực nghiệm:
Đối tượng nghiên cứu
+ DD acid sulfosalic ngậm 3% nước
68 con chuột cống trắng chủng Wistar, cả 2 giống
Hình 2.4 Chuột cống trắng chủng Wistar 2.2.2 Tiêu chu ẩ n ch ọ n m ẫ u
2.1.2.1 Triển khai mô hình gây xơ gan trên chuột cống trắng
Chuột cống trắng trưởng thành cân nặng 180 - 200g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, 18 con chia thành 2 lô mỗi lô 9 con
2.1.2.2 Nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan của viên nang CTHepaB trên mô hình động vật thực nghiệm
Chuột cống trắng trưởng thành cân nặng 180 - 200g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, 50 con chia thành 5 lô mỗi lô 10 con
2.2.3 Độ ng v ậ t s ử d ụ ng trong nghiên c ứ u
Động vật được cung cấp bởi Ban chăn nuôi động vật thí nghiệm – Học viện Quân Y, được nuôi trong phòng thí nghiệm trong một tuần trước khi tiến hành nghiên cứu Chúng được cho ăn bằng thức ăn chuẩn và có nước sạch uống tự do, đảm bảo đáp ứng các tiêu chuẩn nghiên cứu Hàng ngày, quá trình và kết quả thí nghiệm được theo dõi và ghi chép cẩn thận.
- Điều kiện thử trong môi trường vi khí hậu , nhiệt độ 25 0 C độ ẩm 80%
Địa điểm nghiên cứu
Học viện Y Dược học cổ truyền Việt Nam
Bộ môn Dược lý - Học viện Quân y
Thời gian nghiên cứu
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu thực nghiệm trên động vật (chuột cống trắng), phân nhóm ngẫu nhiên có đối chứng
2.5.2.1 Triển khai mô hình gây xơ gan trên chuột cống trắng Để triển khai mô hình, chúng tôi thực hiện tóm tắt qua 2 bước:
Bước 1: Gây tổn thương huỷ hoại tế bào gan dẫn đến xơ gan bằng dung dịch CCl4
Bước 2: Đánh giá hiệu quả của mô hình gây xơ gan tại các thời điểm nhất định qua một số chỉ số xét nghiệm
2.5.2.2 Đánh giá tác dụng điều trị xơ gan của viên nang cứng CTHepaB trên thực nghiệm Để đánh giá, chúng tôi thực hiện tóm tắt qua các bước:
Bước 1: Gây tổn thương huỷ hoại tế bào gan dẫn đến xơ gan bằng dung dịch CCl4
Bước 2: Cho chuột đã bị xơ gan uống CTHepaB, thuốc đối chứng
Bước 3: Đánh giá tác dụng điều trị mô hình gây xơ gan sau khi chuột uống
CTHepaB, thuốc đối chứng qua một số chỉ số xét nghiệm
2.5.3.1 Triển khai mô hình gây xơ gan trên chuột cống trắng
Mô hình gây xơ gan thường được thực hiện trên chuột cống trắng, sử dụng hóa chất CCl4 hoặc rượu kết hợp với chế độ ăn nhiều mỡ Các nghiên cứu này thường kéo dài trên 10 tuần để đánh giá tác động của các tác nhân gây xơ.
Tác giả Li C và cộng sự đã phát triển phương pháp gây xơ gan bằng hóa chất, rượu và chế độ ăn, rút ngắn thời gian xuống còn 8 tuần Dựa trên phương pháp này, nhóm nghiên cứu đã cải tiến bằng cách bổ sung ion sắt vào thức ăn cho chuột và áp dụng chế độ ăn với dầu mỡ đã chiên rán 8 giờ, từ đó triển khai mô hình gây xơ gan trên chuột cống trắng.
Chuột cống trắng 18 con, chia ngẫu nhiên thành 2 lô:
- Lô 1(lô chứng): không gây xơ gan Các chuột không gây xơ, hàng ngày nuôi bằng thức ăn, nước uống thông thường
- Lô 2 (lô mô hình): gây xơ gan
Mô hình gây xơ gan được thực hiện như sau:
Biểu đồ 2.1 Mô hình gây xơ gan trên chuột cống trắng Bước 1: Cả 9 con chuột đều được gây xơ gan bằng cách:
- Tiêm dưới da CCl4 liều lần đầu là 5,0ml/kg chuột
- Sau đó, mỗi tuần tiêm 2 lần với liều 1,2ml/kg chuột, liên tục trong suốt thời gian nghiên cứu
- Song song với tiêm CCl4 cho chuột:
+ Ăn bằng thức ăn tổng hợp, có thêm 20% mỡ được chiên rán 8 giờ và 0,05% cholesterol và sắt oxalat
+ Uống nước: cứ 1 ngày cho uống nước thường, lại 1 ngày cho uống nước có pha thêm 30% ethanol
Bước 2: Đánh giá hiệu quả của mô hình gây xơ gan được thực hiện tại ba thời điểm: 6 tuần, 8 tuần và 10 tuần, với mỗi thời điểm sử dụng 3 con Việc đánh giá này nhằm theo dõi sự tiến triển của mô hình gây xơ gan từ thời điểm bắt đầu, thông qua các chỉ số cụ thể.
- Quan sát thể trạng chung của chuột
- Lấy máu để đo hoạt độ enzym AST và ALT
- Giết chuột lấy gan để quan sát mô bệnh học của gan (đại thể và vi thể)
Hình 2.6 Cân gan chu ộ t 2.5.3.2 Nghiên cứu tác dụng điều trị xơ gan của viên nang CTHepaB trên mô hình động vật thực nghiệm
Theo phương pháp nghiên cứu của Li C và cộng sự, 2003 [26], có sửa đổi Chuột cống trắng 50 con chia thành 5 lô mỗi lô 10 con
- Lô 1 (chứng sinh học): không gây xơ + uống nước cất
- Lô 2 (chứng gây xơ): gây xơ + uống nước cất
- Lô 3 ( trị 1): gây xơ + uống CTHepaB liều 0,56 g/kg/ngày
- Lô 4 ( trị 2): gây xơ + uống CTHepaB liều 1,12 g/kg/ngày (gấp đôi liều 1)
- Lô 5 (Tham chiếu): gây xơ + uống Silymarin 70 mg/kg/ngày
Biểu đồ 2.2 Mô hình đánh giá tác dụng điều trị xơ gan của viên nang CTHepaB trên mô hình động vật thực nghiệm
Bước 1 : Các chuột được gây xơ như mục tiêu 1, cụ thể như sau:
Cả 4 lô, từ lô 2 đến lô 5 (50 con chuột) đều được gây xơ gan bằng cách:
- Tiêm dưới da CCl4 liều lần đầu là 5,0ml/kg chuột
- Sau đó, mỗi tuần tiêm 2 lần với liều 1,2ml/kg chuột, liên tục trong suốt thời gian nghiên cứu
- Song song với tiêm CCl4 cho chuột:
+ Ăn bằng thức ăn tổng hợp, có thêm 20% mỡ được chiên rán 8h và 0,05% cholesterol và sắt oxalat
+ Uống nước: cứ 1 ngày cho uống nước thường, lại 1 ngày cho uống nước có pha thêm 30% ethanol
Lô 1 không gây xơ gan , vẫn cho ăn uống bình thường
Bước 2 : Cho chuột đã bị xơ gan uống CTHepaB, thuốc đối chứng
Sau khi tiêm CCl 4 được 8 tuần cho chuột, bắt đầu cho chuột uống:
- Từ lô 1 đến lô 2 (20 con chuột) đều được uống nước cất
- Từ lô 3 (10 con chuột) đều được uống CTHepaB liều 0,56g/kg/ngày
- Từ lô 4 (10 con chuột) đều được uống CTHepaB liều 1,12g/kg/ngày
- Từ lô 5 (10 con chuột) đều được uống Silymarin 70 mg/kg/ngày
Cách uống: Bột cao khô CTHepaB và Silymarin pha cùng nước uống hàng ngày
Thời gian uống: các thuốc trên uống liên tục trong thời gian 8 tuần
Chuột được cho uống thuốc trong 2 tuần cuối của quá trình tiêm CCl4, và tiếp tục sử dụng thuốc trong 6 tuần sau khi kết thúc 10 tuần tiêm CCl4.
Bước 3: Đánh giá tác dụng điều trị mô hình gây xơ gan sau khi chuột uống
CTHepaB, thuốc đối chứng qua một số chỉ số xét nghiệm :
Sau 8 tuần kể từ khi uống thuốc CTHepaB và thuốc tham chiếu Silymarin tiến hành đánh giá các chỉ số sau giữa các lô nghiên cứu về:
- Lấy máu: đo hoạt độ enzym AST, ALT, albumin huyết tương, thời gian prothrombin để đánh giá mức độ tổn thương tế bào gan
- Lấy gan: cân trọng lượng, định lượng hàm lượng hydroxyproline và quan sát mô bệnh học (đại thể, vi thể)
Hình 2.7 Phân tích l ấ y gan, lách th ận quan sát đạ i th ể và làm mô b ệ nh h ọ c 2.5.3.3 Một số kỹ thuật thực hiện trên thực nghiệm
Kỹ thuật cho chuột uống cưỡng bức
- Cố định chuột bằng một tay
Sử dụng bơm tiêm có kim đầu tù, tay còn lại đưa vào miệng chuột và bơm nước cất hoặc thuốc nghiên cứu trực tiếp vào dạ dày chuột theo liều lượng đã được xác định.
Hình 2.8 Chu ộ t u ố ng thu ố c b ằng kim đầ u tù
Kỹ thuật lấy máu và huyết tương làm xét nghiệm
Máu toàn phần bao gồm huyết tương và tế bào máu Để thu được huyết tương, cần phải loại bỏ tế bào máu thông qua phương pháp ly tâm.
- Thu máu hốc mắt chuột: Kỹ thuật lấy tại hốc mắt chuột theo Janet Hoff [40] + Cố định chuột bằng một tay Sát trùng vùng xung quanh mắt chuột
+ Dùng micro pipet đâm vào mạch vành gần hốc mắt chuột, thu nhận máu bằng ống eppendoff
Hình 2.9 Lấy máu hốc mắt chuột làm xét nghiệm
Ly tâm máu toàn phần 2500 rpm/phút trong 10 phút, sau đó ly tâm 4000 rpm/phút trong 5 phút, thu dịch nổi là huyết tương
Kỹ thuật định lượng hydroxyprolin
Theo nghiên cứu của Santh Rani Thaacur và cộng sự (2006), việc đánh giá lượng collagen trong gan được thực hiện thông qua việc đo nồng độ hydroxyprolin, một chất được giải phóng từ collagen Phương pháp này sử dụng chỉ thị màu và đo quang ở bước sóng 520 nm; kết quả đo quang cao hơn cho thấy gan xơ hơn Từ kết quả đo quang so với chất chuẩn, nồng độ hydroxyprolin trong gan chuột nghiên cứu được suy ra.
Hình 2.10 Máy đo quang Biochrom
Sau khi chuột được điều trị bằng thuốc trong 2 ngày, gan của chúng được phẫu thuật và quan sát hình ảnh đại thể Mỗi chuột có 500 mg gan từ thùy phải được lấy ra, sau đó nghiền đồng thể trong 10ml acid sulfosalicylic 3% hòa tan trong nước.
- Dịch đồng thể được lọc qua giấy lọc Whatmann số 2
- Lấy 2ml dịch lọc (hoặc chất chuẩn) cho vào ống nghiệm, thêm 2ml acid ninhydrin, đun cách thủy trong 1 giờ
- Thêm 4ml toluene vào hỗn hợp phản ứng và khuấy đều trong 2 phút
- Phân lớp toluene được tách riêng ra và được làm ấm ở nhiệt độ phòng
- Cường độ của chất màu đỏ được đo ở 520nm So sánh với đồ thị chuẩn, từ đó suy ra nồng độ hydroxyprolin gan
Kỹ thuật làm tiêu bản mô học
Để thực hiện mô bệnh học, cần cố định cấu trúc mô và nhuộm màu nhằm quan sát và so sánh sự biến đổi cấu trúc vi thể của gan chuột trong từng lô.
Mẫu gan chuột được cố định trong dung dịch formalin đệm trung tính 10% trong 24 giờ, sau đó được đúc khối paraffin và cắt lát dày 5 micromet để làm tiêu bản nhuộm HE và nhuộm Masson.
Nhuộm HE (Hematoxylin - Eosin) là phương pháp nhuộm hai màu liên tiếp, giúp xác định cấu trúc tổng quan của tế bào và mô Phương pháp này nhuộm nhân tế bào theo nguyên tắc tăng dần và bào tương theo nguyên tắc giảm dần Mặc dù các phiến đồ nhuộm HE có thể bảo quản lâu dài, nhưng chất lượng không bằng nhuộm Papanicolaou Sau khi nhuộm, nhân tế bào sẽ có màu xanh đến xanh đen, bào tương có màu hồng đến đỏ, hồng cầu màu hồng đậm, và sợi tạo keo màu hồng nhạt.
- Nhuộm Masson là phương pháp nhuộm rất thích hợp cho việc phát hiện thành phần của mô liên kết và được xếp vào nhóm “nhuộm 3 màu” Thuật ngữ
"Nhuộm 3 màu" là thuật ngữ chỉ các kỹ thuật phát hiện thành phần cơ, sợi tạo keo, sợi tơ huyết và hồng cầu một cách chọn lọc Sau khi nhuộm, nhân tế bào sẽ có màu xanh da trời-đen, trong khi bào tương, sợi cơ và hồng cầu sẽ hiển thị màu đỏ, và sợi tạo keo sẽ có màu xanh da trời.
- Soi tiêu bản trên kính hiển vi đánh giá các thay đổi mô bệnh học của gan chuột ở các lô nghiên cứu.
Chỉ tiêu nghiên cứu
2.6.1 Tri ển khai mô hình gây xơ gan trên chuộ t c ố ng tr ắ ng
- Quan sát thể trạng chung của chuột
- Lấy máu để đo hoạt độ enzym AST và ALT
- Giết chuột lấy gan để quan sát mô bệnh học của gan (đại thể và vi thể)
2.6.2 Nghiên c ứ u tác d ụng điề u tr ị xơ gan củ a viên nang CTHepaB trên mô hình độ ng v ậ t th ự c nghi ệ m
+ Cân và ghi nhận trọng lượng
+ Quan sát đại thể: về màu sắc, tình trạng bề mặt, tổn thương
+ Nhuộm HE và nhuộm Masson, để đánh giá mức độ tổn thương và xơ gan qua hình ảnh mô bệnh học gan chuột vi thể
+ Định lượng hàm lượng Hydroxyprolin
Xử lý số liệu
Dữ liệu đã được phân tích bằng các phương pháp thống kê y sinh học, sử dụng ANOVA và kiểm tra hậu kiểm Turkey, với phần mềm SPSS 16.0 Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (X ± SD) Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
Sai số và cách khống chế sai số
Để giảm thiểu sai số trong nghiên cứu, nghiên cứu này áp dụng một số quy định như cho chuột nhịn ăn trước 12 giờ và đảm bảo trọng lượng của chuột đồng đều.
Đạo đức nghiên cứu
- Thuốc cũng đã được thực hiện xác định độc tính cấp, độc tính bán trường diễn
- Nghiên cứu được Hội đồng khoa học của Học viện Y dược học cổ truyền Việt Nam thông qua
- Các số liệu thu thập trong nghiên cứu là hoàn toàn trung thực, có độ tin cậy và chính xác cao.