Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng thí nghiệm bộ môn Ngoại Sản thuộc Khoa Thú y, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực vật của Khoa Công nghệ Sinh học, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam, cùng với các nông hộ tại huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội.
Đối tượng nghiên cứu
Bò sữa được nuôi tại các nông hộ thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội 3.2.2 Cao khô dược liệu Bồ công anh
Thân lá cây Bồ Công Anh (Lactuca indica L.) sau khi thu mua sẽ được sơ chế qua quy trình rửa sạch dưới vòi nước (2-3 lần) và sau đó sấy hoặc phơi khô ở nhiệt độ 40°C Mẫu khô sẽ được nghiền thành bột mịn với kích thước nhỏ hơn 0,5mm Cuối cùng, bột lá được đóng gói trong túi nilong và bảo quản trong bình hút ẩm để giữ được chất lượng.
Bột dược liệu Bồ Công Anh được chiết xuất bằng phương pháp ngâm chiết ở nhiệt độ phòng với tỷ lệ 5g bột dược liệu trên 50ml dung môi, lắc đảo 2 lần mỗi ngày Sau 72 giờ, dịch chiết được lọc qua vải màn và giấy lọc Whatman No.1, sau đó cô quay hút chân không để loại bỏ hoàn toàn dung môi Khi khối lượng bình cô quay không thay đổi, tiến hành cân để tính hiệu suất tách chiết Cao cô toàn phần được bảo quản trong tủ mát 4°C để thử hoạt tính và khả năng ức chế vi khuẩn.
Vi khuẩn Staphylococcus spp và Streptococcus spp đã được phân lập từ dịch viêm tử cung của bò, với nguồn mẫu được cung cấp từ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Sinh học Thú y thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam (LAS – NN54; ISO 17025:2005).
- Nano bạc có nồng độ gốc 100 ppm, 90% các hạt nano bạc có kích thước
20 - 25 nm do bộ môn Sinh học khoa Công nghệ Sinh học cung cấp
3.2.5 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất thí nghiệm
Trong quá trình thí nghiệm, các thiết bị cần thiết bao gồm tủ sấy, lò vi sóng, tủ ấm nuôi vi khuẩn, tủ nuôi vi khuẩn lỏng lắc, cân phân tích, nồi hấp khử trùng autoclave, box cấy vô trùng, máy đo pH, máy ly tâm, máy đo quang phổ và máy cô quay chân không Những thiết bị này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo quy trình thí nghiệm diễn ra hiệu quả và chính xác.
Để tiến hành thí nghiệm một cách hiệu quả, một số dụng cụ cần thiết bao gồm bình ống nghiệm, pipet man, đĩa petri, ống nghiệm, eppendorf, đèn cồn, cốc thủy tinh, giá ống nghiệm, bình định mức và ống nghiệm Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và an toàn cho quá trình nghiên cứu.
Các dung môi chiết: axit acetic 5%, ethanol 35%, ethanol 70%, ethanol 96%, nước cất, aceton nitril 50%, aceton nitril 100%
Dung môi pha chất tan: Dimethyl sulphoxit (DMSO)
Các hóa chất định tính một số thành phần hóa học trong dịch chiết
+ Môi trường Luria–Bertani (LB) dạng lỏng, được hấp tiệt trùng trong các bình tam giác
+ Môi trường LB rắn, được hấp tiệt trùng để nguội tới 40 0 - 50 0 C, đổ vào đĩa petri có đường kính 10 cm, với độ dày là 4 ± 0,2 mm.
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát bệnh viêm tử cung trên đàn bò sữa ở một số địa phương thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội
- Phân lập và giám định thành phần vi khuẩn trong dịch tử cung của bò sữa
- Đánh giá hiệu suất và định tính các nhóm chất trong cao khô dịch chiết Bồ Công Anh sử dụng các dung môi tách chiết khác nhau
Nghiên cứu đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn in vitro của cao dịch chiết từ các dung môi khác nhau, tập trung vào vi khuẩn được phân lập từ dịch viêm tử cung bò Kết quả cho thấy hiệu quả khác nhau của các dung môi trong việc ức chế sự phát triển của vi khuẩn, mở ra hướng nghiên cứu mới trong điều trị viêm tử cung ở bò.
- Đánh giá khả năng ức chế vi khuẩn Streptococcus spp và Staphylococcus spp của Nano bạc
- Đánh giá tác dụng ức chế vi khuẩn in vitro khi phối hợp nano bạc và cao dịch chiết Bồ Công Anh
Khảo sát tỷ lệ bò mắc bệnh viêm tử cung được thực hiện tại 03 xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội, nhằm kiểm tra tỷ lệ bò sữa bị viêm tử cung.
Lấy mẫu dịch viêm tử cung bò được thực hiện trên đàn bò sữa tại các nông hộ ở ba xã thuộc huyện Ba Vì, thành phố Hà Nội Các mẫu sữa sau đó được chuyển về phòng thí nghiệm của Học viện Nông nghiệp Việt Nam để phân tích.
Xác định vi khuẩn gây bệnh viêm tử cung ở bò được thực hiện thông qua phương pháp phân lập vi khuẩn, theo nghiên cứu của Nguyễn Như Thanh và Nguyễn Bá Hiên (2001) Quá trình này bao gồm việc nuôi cấy các mẫu dịch cần chẩn đoán vào môi trường thông thường và môi trường đặc biệt để phân tích các đặc tính nuôi cấy cũng như đặc tính sinh vật hóa học của từng loại vi khuẩn Đối chứng trong nghiên cứu là các mẫu dịch tử cung từ những con bò khỏe mạnh trong cùng đàn.
Để pha dịch chiết nồng độ 100mg/ml, bạn cần lấy 1g cao cô toàn phần và hòa tan với 10ml Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sử dụng đũa thủy tinh khuấy đều cho đến khi dung dịch hoàn toàn hòa tan, bạn sẽ thu được dung dịch với nồng độ 100mg/ml.
Nuôi cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus và Streptococcus spp được thực hiện bằng cách cấy vạch trên môi trường LB đặc trong đĩa petri, ủ ở 37°C trong 24 giờ để chọn khuẩn lạc đơn điển hình Sau đó, khuẩn lạc đơn được chuyển vào bình tam giác chứa môi trường LB lỏng, ủ ở 37°C với tốc độ lắc 200 vòng/phút trong 12-14 giờ Để đạt tiêu chuẩn, mật độ vi khuẩn thu được phải đạt 10^8 tế bào/ml.
Để xác định mật độ vi khuẩn sau khi nuôi cấy trong môi trường LB lỏng, phương pháp đo mật độ quang tại λ= 600nm được sử dụng Đồng thời, tác dụng diệt khuẩn của các dịch chiết được kiểm tra thông qua phương pháp kháng sinh đồ khuếch tán trên đĩa thạch Kirby-Bauer.
Các thao tác được thực hiện trong tủ cấy vô trùng Khi mật độ vi khuẩn đạt
Để tiến hành thí nghiệm, đầu tiên chuẩn bị 10^8 tế bào/ml vi khuẩn và lắc đều bình chứa Sử dụng pipetman hút 100µl vi khuẩn nhỏ vào giữa đĩa thạch, sau đó dùng que thủy tinh tráng đều cho đến khi mặt thạch khô Sau 15 phút, tiến hành đục lỗ trên mặt thạch với đường kính 6mm, cách nhau khoảng 30mm Đối với mỗi lỗ thạch, nhỏ 100µl dịch chiết và đặt đĩa vào tủ ấm ở 37°C trong 24 giờ Kết quả được đọc bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn và tính số bình quân.
Phương pháp pha loãng nồng độ cao bao gồm việc chuẩn bị 10 ống nghiệm sạch và vô trùng, mỗi ống chứa 5 ml DMSO và được đánh số từ 1 đến 10 Ống nghiệm 1 sẽ được thêm 5 ml dung dịch cao lỏng với nồng độ 100 mg/ml, sau đó trộn đều Tiếp theo, hút 5 ml từ ống nghiệm 1 chuyển sang ống nghiệm 2 và trộn đều Quá trình này tiếp tục bằng cách chuyển 5 ml từ ống nghiệm 2 sang ống nghiệm 3 và trộn đều, cho đến ống nghiệm thứ 10, nơi bạn sẽ trộn đều và bỏ đi 5 ml.
Phương pháp định tính xác định một số nhóm hợp chất có trong dịch chiết thực vật Định tính saponin trong thực vật
Tính tạo bọt là đặc trưng nổi bật của saponin, và hiện tượng này được sử dụng để định tính sự hiện diện của saponin trong dịch chiết.
Để quan sát hiện tượng tạo bọt, cho 5 g dịch chiết từ mẫu thực vật vào ống nghiệm lớn, thêm 5 ml nước và lắc mạnh trong 5 phút Sau đó, để yên và theo dõi hiện tượng tạo bọt Nếu bọt vẫn bền vững sau 15 phút, có thể sơ bộ kết luận rằng thực vật đó chứa saponin.
Để kiểm tra phản ứng với kiềm, nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc và hơ khô Sau đó, đặt giấy lên miệng lọ amoniac đặc đã mở nắp, bạn sẽ thấy màu vàng của vết dịch chiết trở nên rõ ràng hơn Nhỏ thêm một giọt khác để làm chứng.
- Phản ứng với FeCl3: Cho vào ống nghiệm nhỏ 1ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl3 5% Sẽ xuất hiện tủa xanh đen
- Tác dụng với dung dịch FeCl3 5%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl3 5% sẽ thấy kết tủa xanh đen
- Tác dụng với dung dịch gelatin 1%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 5 giọt dung dịch gelatin 1% sẽ xuất hiện tủa bông trắng
3.3.3 Định tính alkaloid bằng thuốc thử chung
- Tác dụng với thuốc thử Mayer (100ml nước cất, 1.36g HgCl2, 5g KI): Lấy một phần dịch chiết cho vào ống nghiệm 1ml Nhỏ vào từng ống nghiệm 2 -
3 giọt thuốc thử Mayer, nếu có alkaloid sẽ cho tủa màu từ trắng đến vàng
Thuốc thử Bouchardat, bao gồm 100ml nước, 2.5g I2 và 5g KI, được sử dụng để kiểm tra sự hiện diện của alkaloid trong dịch chiết Để thực hiện, lấy 1ml dịch chiết cho vào ống nghiệm và nhỏ vào đó 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat Nếu có alkaloid, sẽ xuất hiện tủa màu nâu đến đỏ nâu.
Thêm vào dịch chiết vài giọt H 2 SO 4 đậm đặc Nếu có carotenoid, dung dịch có màu xanh dương
Để kiểm tra sự hiện diện của Polyphenol, cho vào mỗi ống nghiệm 1 mẫu cao khô từ dịch chiết khác nhau, thêm 2ml nước cất và hòa tan đều Tiếp theo, nhỏ vào mỗi ống 1ml dung dịch FeCl3 2% và lắc đều Nếu dung dịch chuyển sang màu xanh đen, điều này chứng tỏ có sự hiện diện của Polyphenol.
Cho một ít cao khô từ mỗi loại dịch chiết vào từng ống nghiệm, sau đó thêm 2 ml nước cất và lắc đều để hòa tan Nhỏ 2 - 3 giọt thuốc thử Fehling vào mỗi ống; sự xuất hiện của kết tủa đỏ gạch sẽ xác nhận sự hiện diện của đường khử.
Tác dụng với chì acetat 10%: lấy 2ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10% sẽ xuất hiện tủa bông
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn invitro của nano bạc
* Nguyên lý: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên các đĩa thạch Meuller-hinton có nồng độ nano bạc khác nhau
Mật độ vi khuẩn đem cấy trộn là 10 8 tế bào/ml
Nồng độ dung dịch nano đem cấy trộn là 100 ppm (nồng độ gốc)
Pha loãng nano theo dãy pha loãng đã nêu, sử dụng nước đề ion để pha loãng nano, và bổ sung 10 µl dịch khuẩn vào mỗi ống Sau đó, tiến hành đo các dịch khuẩn trong các nồng độ nano sau 2 giờ, 4 giờ và 8 giờ.
Sử dụng 1 ống làm đối chứng không bổ sung nano
Thí nghiệm được thực hiện bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch, theo nghiên cứu của Carvahol và cộng sự (2011) Sau 2h, 4h và 8h, 100µl nano bạc được pha loãng ở các nồng độ khác nhau đã được bổ sung vào dịch khuẩn cấy trên đĩa thạch để quan sát khả năng ức chế vi khuẩn.
Nuôi tủ ấm 30 0 /24 giờ, lấy ra đọc kết quả: Xác định nồng độ nano pha loãng thấp nhất còn có khả năng ức chế vi khuẩn.
Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn in vitro của dịch chiết thực vật khi phối trộn với nano bạc
Phối trộn dịch chiết thực vật với nano bạc bằng cách hút 5ml dịch chiết ở các nồng độ pha loãng khác nhau vào ống nghiệm, sau đó thêm 5ml nano bạc ở nồng độ ức chế tối thiểu vào từng ống nghiệm và lắc đều để đảm bảo sự hòa trộn đồng nhất.
Hỗn hợp dịch chiết thực vật và nano bạc được nhỏ lên các lỗ thạch trong đĩa môi trường đã được kháng khuẩn và nuôi ủ ở điều kiện 37°C trong 24 giờ Sau thời gian này, đường kính vòng vô khuẩn được đo để đánh giá khả năng kháng khuẩn của hỗn hợp Phương pháp xử lý số liệu sẽ được áp dụng để phân tích kết quả.
Các thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên và được lặp lại 3 lần Số liệu thu được xử lý thống kê sinh học bằng phần mềm Excel 2007.
