(Luận văn thạc sĩ) điều tra và nghiên cứu bệnh nấm hại lá ngô tại huyện văn yên, tỉnh yên bái vụ đông xuân năm 2016 2017

Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

Địa điểm nghiên cứu

Phòng thí nghiệm chi cục BVTV Tỉnh Yên Bái

Phòng nghiên cứu Trung tâm ứng dụng khoa học công nghệ - Sở khoa học công nghệ tỉnh Yên Bái.

Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 9 năm 2016 đến tháng 9 năm 2017.

Vật liệu nghiên cứu

- Giống ngô: DK6919, HN68, LVN885

- Nguồn nấm lây bệnh: Các bệnh nấm hại chủ yếu trên lá ngô tại Văn Yên, Yên Bái

- Các loại thuốc Anvil 5SC (Hexaconazole), Daconil 75WP (Chlorothalonil), Tepro Super 300EC (Tebuconazole + Propiconazole)

- Môi trường nuôi cấy WA, PGA

- Các hóa chất trong phòng thí nghiệm: cồn, axit acetic (CH3COOH), natrihydroxit (NaOH),…

Trong phòng thí nghiệm, các dụng cụ thiết yếu bao gồm tủ định ôn, tủ sấy, buồng cấy vô trùng, kính hiển vi, lam kính, lamen, đĩa petri, đũa thủy tinh, ống đong, que cấy và dao Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các thí nghiệm và nghiên cứu khoa học một cách chính xác và hiệu quả.

Nội dung nghiên cứu

- Điều tra các bệnh hại do nấm gây ra trên lá ngô tại huyện Văn Yên, Tỉnh Yên Bái

Xác định và chẩn đoán tác nhân gây bệnh từ các mẫu bệnh thu được trong quá trình điều tra là rất quan trọng, bao gồm việc thực hiện các phương pháp trực tiếp và phân lập trên môi trường nhân tạo.

- Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của một số nấm bệnh phân lập được trên ngô

- Ảnh hưởng của một số thuốc hóa học trên môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của một số nấm bệnh phân lập được trên ngô

Lây nhiễm nhân tạo có thể được thực hiện qua phương pháp phun bào tử hoặc lây nhiễm trực tiếp sợi nấm, gây ra các bệnh đốm lá lớn, đốm lá nhỏ và gỉ sắt trên các giống cây như DK6919, HN68 và LVN885.

Phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Phương pháp điều tra bệnh theo quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phương pháp điều tra phát hiện dịch hại cây ngô QCVN 01-167:2014/BNNPTNT ban hành năm 2014

3.5.1.1 Bệnh trên lá (đốm lá lớn, đốm lá nhỏ, gỉ sắt)

Số mẫu điều tra của 1 điểm: Điều tra 10 lá ngẫu nhiên/điểm

Mỗi điểm chọn 10 lá ngẫu nhiên (lá non, lá bánh tẻ, lá già), đếm số lá bị bệnh và phân cấp lá bị bệnh theo thang 9 cấp:

Cấp 1: < 1% diện tích lá bị bệnh;

Cấp 3: từ 1 – 5% diện tích lá bị bệnh;

Cấp 5: > 5 – 25% diện tích lá bị bệnh;

Cấp 7: > 25 – 50% diện tích lá bị bệnh;

Cấp 9: > 50% diện tích lá bị bệnh

3.5.1.2 Bệnh trên thân (Bệnh khô vằn ngô):

Số mẫu điều tra của 1 điểm: Điều tra 30 cây/ điểm, phân cấp bệnh theo thang

Cấp 1: < 1/4 diện tích bẹ lá bị hại

Cấp 3: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại

Cấp 5: > 1/4 đến 1/2 diện tích bẹ lá bị hại, cộng lá thứ 3, thứ 4 bị bệnh nhẹ Cấp 7: > 1/2 đến 3/4 diện tích bẹ lá bị hại và lá phía trên bị hại

Cấp 9: Vết bệnh leo tới đỉnh cây, các lá nhiễm nặng, một số cây chết Các chỉ tiêu cần theo dõi

- Tỷ lệ, chỉ số bệnh (%)

Tỷ lệ bệnh (%) = Tổng số lá bị bệnh x 100 Tổng số lá điều tra

N x n Trong đó: N1 là số cây bị bệnh ở cấp 1;

N3 là số cây bị bệnh ở cấp 3;

Nn là số cây bị bệnh ở cấp n;

N: là tổng số cây điều tra; n: là cấp bệnh cao nhất trong thang phân cấp (cấp 9)

3.5.2 Phương pháp điều chế môi trường phân lập nấm

1 Khử trùng dụng cụ thuỷ tinh (đĩa petri, ống nghiệm, bình tam giác, lọ nắp nhựa chuyên dụng ): có thể khử trùng bằng hoá chất hoặc sấy ở nhiệt độ cao Sấy ở nhiệt độ cao thông dụng hơn

 Dụng cụ thuỷ tinh rửa sạch bằng xà phòng, rửa lại bằng nước vòi

 Phơi khô trên giá, đóng gói bằng giấy bạc bọc thực phẩm

 Cho vào tủ sấy, sấy ở 150 0 C trong 3 giờ

2 Rót môi trường ra đĩa petri: Thao tác cần được thực hiện trong tủ cấy để đảm bảo vô trùng

 Môi trường cần được để nguội khoảng 55-60 0 C

 Rót môi trường dầy khoảng 5 mm (20ml môi trường/đĩa petri 9cm)

 Để bề mặt môi trường khô (khoảng 20 phút) trước khi đậy nắp đĩa

3 Các loại môi trường dùng trong phân lập và nuôi cấy nấm

Môi trường WA (Water agar) được chuẩn bị bằng cách đun 15g agar trong 800 ml nước để làm tan thạch Sau đó, bổ sung thêm nước cho đủ 1000 ml Tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút, rồi để nguội đến khoảng 55-60°C trước khi rót ra đĩa.

 Rót môi trường WA đã khử trùng vào đĩa petri

Môi trường PGA (Potato Glucose Agar)

Khoai tây: 200g Glucose: 20 g Agar: 20 g Nước: 1000 ml

Khoai tây được rửa sạch và cắt lát, sau đó đun trong nước trong 1 giờ Tiến hành lọc qua vải lọc, thêm agar vào dịch lọc và đun cho agar tan hoàn toàn Bổ sung nước cất để đạt tổng thể tích 1000 ml Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút, sau đó để nguội ở nhiệt độ 55-60°C trước khi rót ra đĩa petri.

Môi trường PGA chứa nhiều carbohydrate, do đó, để hạn chế sự phát triển của nấm và tăng cường sinh bào tử, cần giảm lượng khoai tây và đường từ 50% đến 75%.

3.5.3 Phương pháp thu thập mẫu

Đối với các mẫu nấm gây bệnh trên lá như gỉ sắt Puccinia maydis, đốm lá lớn E.turcicum và đốm lá nhỏ Bipolaris maydis, cần cho các mẫu lá bị bệnh vào hộp mẫu, bảo quản trong tủ mát và tiến hành phân lập trong vòng 48 giờ.

3.5.4 Phương pháp kiểm tra nấm từ vết bệnh

3.5.4.1 Kiểm tra trực tiếp vết bệnh (thích hợp cho các mô mỏng như lá cây)

 Chuẩn bị một lam sạch

Để cắt vết bệnh, cần chia thành các mảnh nhỏ kích thước khoảng 1-2 cm Mẫu bệnh có thể được quan sát ngay sau khi thu thập ngoài đồng hoặc để ẩm trong hộp petri từ hôm trước.

 Đặt tiêu bản lên lam sao cho phần vết bệnh hướng lên trên

 Điều chỉnh kính để có ánh sáng tối đa và quan sát ở độ phóng đại thấp (vật kính: x4, x10, x40)

Chú ý: Không nên cắt quá nhỏ mẫu bệnh và cần quan sát nhanh vì dưới cường độ ánh sáng mạnh, mẫu sẽ nhanh bị khô

3.5.4.2 Kiểm tra nấm bệnh bằng cố định lam

Chuẩn bị cho quá trình nghiên cứu nấm bao gồm các dụng cụ như lam, la men, que khêu nấm, dao mổ, nước cất vô trùng và mẫu bệnh Mẫu bệnh, cụ thể là mẫu lá, có thể được sử dụng ngay lập tức sau khi thu thập hoặc được bảo quản trong điều kiện ẩm để đảm bảo chất lượng.

 Nhỏ một giọt nước cất lên lam

Sử dụng que khêu nấm hoặc dao mổ, nhẹ nhàng chạm đầu nhọn vào vết bệnh và nhúng vào giọt nước trên lam, sau đó khuấy nhẹ Tiếp theo, đậy la men lên giọt nước một cách cẩn thận để tránh tạo bọt khí Cuối cùng, dùng giấy thấm để hút nước thừa xung quanh la men.

 Quan sát ở độ phóng đại từ thấp đến cao (vật kính: x10, x20, x40)

3.5.5 Nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

3.5.5.1 Phương pháp phân lập nấm gây bệnh từ mẫu cây bệnh Theo cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam

 Dao mổ, kéo, panh, que cấy nấm

 đèn cồn, giấy thấy thấm vô trùng, thớt nhựa, đĩa môi trường

 Hoá chất khử trùng: Cồn (ethanol) 70%, NaOCl 1-2%

3 Chọn mẫu bệnh có triệu chứng điển hình, mới

4 Rửa mẫu bệnh sạch đất cát bằng nước vòi (đặc biệt là các mẫu rễ)

5 Cắt chọn mảnh mô bệnh thích hợp

6 Khử trùng bề mặt các mảnh mô trên trong dung dịch khử trùng bề mặt như Ethanol 70%, NaOCl 1-2 % Thời gian khử trùng từ 1-3 phút tùy vật liệu cây

7 Rửa lại bằng nước cất vô trùng

8 Thấm khô mảnh mô bằng giấy thấm vô trùng

9 Cắt tiếp bằng dao mổ vô trùng các mảnh mô trên thành các mảnh nhỏ 1-3 mm (chứa cả phần mô bệnh và mô khoẻ) Dùng panh vô trùng đặt các mảnh nhỏ trên vào môi trường WA

10 Ghi chú cẩn thận bằng bút viết kính: Ngày, cây, bệnh

11 Để mẫu trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng phòng thí nghiệm

12 Theo dõi sự phát triển của sợi nấm mọc ra từ mô bệnh Khi nấm đã phát triển từ mô bệnh ra môi trường, lấy phần đỉnh sợi nấm chuyển sang môi trường thích hợp như PGA

3.5.5.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sự phát triển của nấm

- Sử dụng các nguồn nấm thuần khiết Cấy nấm vào giữa hộp petri (đường kính lỗ đục 5mm) trên các môi trường PGA, WA

Đối với mỗi loài nấm bệnh, thí nghiệm được thực hiện với 2 công thức là môi trường PGA và WA, mỗi công thức được lặp lại 3 lần với 1 hộp petri cho mỗi lần Quá trình theo dõi diễn ra trong vòng 5 ngày.

- Chỉ tiêu theo dõi: Đo đường kính tản nấm (mm)

3.5.5.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thuốc hóa học đến sự phát triển của nấm trong phòng thí nghiệm theo phương pháp của Uesugi Yasuhiko

Môi trường thử thuốc yêu cầu cân thuốc chính xác theo nồng độ cần pha Đầu tiên, cân 1g thuốc Daconil 75WP và pha với 75ml nước cất vô trùng để tạo dung dịch mẹ có nồng độ 10.000 ppm Sau đó, sử dụng xi lanh hoặc pipet để hút 1ml dung dịch mẹ vào bình định mức chứa 100ml dung dịch môi trường PGA lỏng đã được hấp khử trùng, tạo ra dung dịch có nồng độ 100ppm Nếu sử dụng 2ml dung dịch mẹ cho 100ml dung dịch môi trường, nồng độ thuốc sẽ là 200ppm.

- Thí nghiệm đc tiến hành trên 3 loại thuốc Anvil 5SC, Daconil 75WP, Tepro Super 300EC với 4 công thức

+ CT4: Đối chứng (Môi trường PGA không xử lý thuốc)

Mỗi công thức được nhắc lại 3 lần, mỗi lần là một hộp lồng đĩa petri,

- Chỉ tiêu theo dõi: Đường kính tản nấm trung bình sau cấy trong 5 ngày (Đơn vị đo mm)

* Công thức pha chế dung dịch mẹ để thử thuốc trừ nấm trên môi trường nhân tạo PGA

10 6 Trong đú: 1 àai/ml = 1ppm = 10 6 b ml: Nước cất vô trùng + Tính lượng ml dung dịch mẹ cần lấy cho vào môi trường ở nồng độ cần có

X ml = C àai/ml x ml môi trường

M àai/ml Trong đó: C giá trị ko đổi P(g) (WP)

M àai/ml tương đương với a àai/ml

3.5.5.4 Phương pháp lây bệnh nhân tạo

Phương pháp thiết kế thí nghiệm sử dụng khối ngẫu nhiên đầy đủ (RCB) với mỗi công thức được lặp lại 3 lần Mỗi lần lặp lại sẽ có 10 vết bệnh trên lá và 10 cây được lây nhiễm toàn cây.

Các giống ngô chính được trồng tại Yên Bái và các bệnh nấm hại lá chủ yếu trên ngô đã được xác định Phương pháp lây bệnh nhân tạo cho các bệnh nấm hại lá trên ngô được thực hiện bằng cách phun bào tử.

* Chuẩn bị nguồn và ký chủ

Nguồn nấm gây bệnh trên lá ngô được xác định thông qua việc phân lập từ mẫu ngô bị bệnh và nuôi cấy trên môi trường PGA để hình thành bào tử Để đếm số lượng bào tử, sử dụng que cấy nấm để khêu bào tử từ môi trường nuôi cấy, sau đó hòa loãng vào nước cất vô trùng Số lượng bào tử được xác định bằng buồng đếm dưới kính hiển vi, với kết quả đạt từ 10^4 đến 10^5 bào tử/ml, tương đương với 50 bào tử trên một quang trường kính hiển vi.

+ Các giống ngô: HN68, LVN885, DK6919

+ Giai đoạn lây bệnh: ngô ở giai đoạn 7-8 lá thật