CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…
Chất liệu nghiên cứu
Chất liệu nghiên cứu là bài thuốc “Thông mạch Vintong”, thành phần gồm các vị thuốc:
Bảng 2.1 Thành phần “Thông mạch Vintong”
Tên vị thuốc Đinh lăng
Thủy điệt Đông trùng hạ thảo
Tất cả các vị thuốc trong bài thuốc đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V Thuốc được chiết xuất bằng nước thông qua máy sắc thuốc tự động tại Khoa Dược Bệnh viện Tuệ Tĩnh, với dịch chiết đạt tỷ lệ 1:1, tức 100ml dịch chiết tương đương 100g dược liệu.
Thuốc được chiết xuất theo tỷ lệ 1:1 và cô đặc phù hợp để sử dụng cho chuột Liều dùng thuốc tính theo gam dược liệu với tổng lượng 108g, được áp dụng cho người với liều 1 thang mỗi ngày Tính toán liều dùng cho người là 108g chia cho 50kg trong 24 giờ, tương đương 2,16g/kg/24h Từ đó, có thể quy đổi liều dùng cho chuột nhắt.
Đối tượng nghiên cứu
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g do Ban chăn nuôi - Học viện Quân Y cung cấp.
2.2.2 Độc tính bán trường diễn
Chuột cống trắng chủng Wistar, trọng lượng 180 ± 20 g do Ban chăn nuôi – Học viện Quân Y cung cấp.
2.2.3 Mô hình đột quỵ não
Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g do Ban chăn nuôi – Học viện Quân Y cung cấp.
Tất cả động vật thực nghiệm được nuôi dưỡng trong phòng thí nghiệm ít nhất một tuần trước khi tiến hành thí nghiệm, được cung cấp thức ăn theo tiêu chuẩn cho động vật nghiên cứu và nước (đun sôi để nguội) để uống tự do.
Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành trong thời gian từ tháng 6/2020 đến tháng10/2020 tại Học viện Quân Y.
Phương pháp nghiên cứu
A study was conducted to assess the acute toxicity and determine the LD50 of "Vintong pine" in white mice through oral administration, following the guidelines established by the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD).
Mẫu nghiên cứu là 60 chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 10 con và được uống dịch chiết “Thông mạch Vintong” với liều tăng dần.
Dịch chiết “Thông mạch Vintong”
Uống dịch chiết “Thông mạch Vintong” liều tăng dần trong cùng một thể tích
Liều thấp nhất gây chết 100% chuột
Liều cao nhất không có chuộ t chết
- Theo dõi tình trạng chung, biểu hiện nhiễm độc trong 72 giờ và 7 uống thuốc chuột chết (nếu có)
Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu độc tính cấp
- Số chuột chết/có biểu hiện bất thường trong suốt 7 ngày và tỷ lệ chết trong vòng
72 giờ sau khi uống thuốc.
- Các chỉ số liên quan đến tình trạng chung của chuột: ăn, ngủ, vận động, bài tiết…
- Các chỉ số liên quan đến dấu hiệu nhiễm độc: nôn, co giật, kích động, bài tiết…
2.4.1.5 Công cụ sử dụng trong nghiên cứu
- Cân điện tử của Nhật, độ chính xác 0,001 gam.
- Kim đầu tù cho chuột uống thuốc.
- Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml.
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” có tỷ lệ cô đặc 4,5:1, với 100ml tương đương 450g dược liệu, tạo ra dung dịch đậm đặc nhất cho chuột nhắt trắng Dung dịch này được pha loãng đến các nồng độ phù hợp để nghiên cứu độc tính cấp và xác định.
LD50 của bài thuốc “Thông mạch Vintong” trên thực nghiệm.
Chuẩn bị chuột nghiên cứu
Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm.
Chuột được chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con.
Sau 12 giờ nhịn ăn, chuột được uống thuốc cưỡng bức, thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù.
Cho chuột uống thuốc với liều lượng 0,25ml/10g thể trọng/lần, tối đa 3 lần trong 24 giờ và cách nhau ít nhất 3 giờ Mục tiêu là xác định liều cao nhất không gây chết chuột và liều thấp nhất gây chết 100% số chuột, cùng với các liều trung gian.
2.4.1.7 Phương pháp đánh giá kết quả
Theo dõi tình trạng sức khỏe tổng quát của chuột là rất quan trọng, đặc biệt khi có dấu hiệu nhiễm độc như nôn mửa, co giật, kích động và bài tiết bất thường Bên cạnh đó, cần ghi nhận số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi sử dụng thuốc để đánh giá tác động của chất độc.
Tất cả chuột chết sẽ được mổ để đánh giá tổn thương đại thể và xác định nguyên nhân gây độc Quá trình này giúp xây dựng đồ thị tuyến tính nhằm phân tích các yếu tố liên quan đến sự chết của chuột.
Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống dịch chiết “Thông mạch Vintong”.
2.4.2 Độc tính bán trường diễn
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn của OECD về thuốc có nguồn gốc dược liệu [38].
2.4.2.2 Chọn mẫu và cỡ mẫu
Chọn 30 chuột cống trắng chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con Chuột được cho uống nước cất và hoặc dịch chiết “Thông mạch Vintong” với liều 15,12g/kg/24hvà 45,36g/kg/24h (theo phân lô).
2.4.3 Quy trình nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Dịch chiết “Thông mạch Vintong”
Lô 2: uống liều 15,12g dược liệu /kg/ngày × 1 lần (sáng) ×
Lô 3: uống liều 45,36g dược liệu /kg/ngày × 1 lần (sáng) ×
- Mức độ hủy hoại tế bào thận
Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu độc tính bán trường diễn
Các chỉ tiêu nghiên cứu được đánh giá ở thời điểm ngày D0; D45 và D90 sau uống Thông mạch Vintong với liều khác nhau Bao gồm:
- Tình trạng chung, thể trọng của chuột.
- Chức năng gan, thận, chức phận tạo máu.
- Mức độ hủy hoại tế bào gan.
- Mô bệnh học gan, lách, thận.
2.4.3.2 Công cụ sử dụng trong nghiên cứu
Bộ kit định lượng enzym và chất chuyển hoá trong máu của hãng Erba bao gồm các chỉ số ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần và creatinin Sản phẩm này được thực hiện trên máy sinh hóa bán tự động Erba đến từ Ấn Độ, mang lại độ chính xác cao trong việc xét nghiệm và phân tích kết quả.
- Các dung dịch xét nghiệm máu của hãng Horiba ABX, định lượng trên máy Horiba ABX Micros của Pháp.
- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
Chuột được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con.
- Lô chứng: uống nước cất 1ml/kg/ngày.
- Lô trị 1: uống viên hoàn “Thông mạch Vintong” liều 15,12g dược liệu/kg/ngày.
- Lô trị 2:uống viên hoàn “Thông mạch Vintong” liều 45,36g dược liệu/kg/ngày (gấp 3 lần lô trị 1).
Chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử trong 90 ngày liên tục, mỗi ngày một lần vào buổi sáng.
2.4.3.4 Phương pháp đánh giá kết quả
Đánh giá chức năng tạo máu có thể được thực hiện qua các chỉ số như số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu Những yếu tố này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tình trạng sức khỏe và khả năng tạo máu của cơ thể.
- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng chất chuyển hoá trong máu: billlirubin toàn phần, albumin, cholesterol [62].
- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST [62].
- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh
- Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau 45 ngày uống thuốc và sau 90 ngày uống thuốc.
Sau 90 ngày điều trị, toàn bộ chuột được phẫu thuật để quan sát các cơ quan một cách tổng quát Đồng thời, tiến hành kiểm tra ngẫu nhiên cấu trúc vi thể của gan và thận ở 30% số chuột trong mỗi lô.
2.4.4 Mô hình đột quỵ não
Nghiên cứu đã thực hiện gây nhồi máu não tại động mạch não của chuột nhắt trắng thông qua phản ứng quang hóa, sử dụng tia laser theo phương pháp của Hiroshi Sugimori và cộng sự (2004).
2.4.4.2 Chọn mẫu và cỡ mẫu
Nghiên cứu sử dụng 32 con chuột nhắt trắng, chia thành 4 lô, mỗi lô gồm 8 con Trong đó, 24 con được phẫu thuật để gây nhồi máu não, trong khi 8 con còn lại được phẫu thuật nhưng không gây nhồi máu não Tất cả chuột được cho uống nước cất hoặc thuốc nghiên cứu với các liều lượng khác nhau.
32 chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh, chia ngẫu nhiên 4 lô
24 chuột gây nhồi máu não 8 chuột không gây nhồi máu não
Sau 28 ngày dùng thuốc, đánh giá mô bệnh học tân tạo mạch
Sơ đồ 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng tăng tân tạo mạch máu của “Thông mạch Vintong” trên chuột nhắt trắng đột quỵ não
2.4.4.4 Chỉ tiêu theo dõi Đánh giá mô bệnh học tân tạo mạch máu (CD31, VEGF/CD31)
2.4.4.5 Công cụ sử dụng trong nghiên cứu
- Kính hiển vi phẫu thuật;
- Máy cắt bệnh phẩm lạnh
- Cân phân tích, độ chính xác 10 -4 g (Sartorius).
- Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ, kim cho chuột uống, chỉ phẫu thuật 6.0 và các dụng cụ thí nghiệm khác.
- Hồng bengal (Rose bengal dye) của Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan).
- Các hóa chất nhuộm HE.
Phẫu thuật gây đột quỵ nhồi máu não trên chuột
Chuột nhắt trắng được gây mê bằng Nembutal với liều 40mg/kg thể trọng Tiến hành bộc lộ động mạch cảnh chung bên phải qua một đường rạch ở vùng cổ và đặt chỉ chờ tại động mạch này Sau đó, thực hiện đường rạch giữa tai phải và mắt phải để bộc lộ vùng xương sọ và cơ thái dương bên phải Cơ thái dương được tách ra khỏi xương thái dương và đẩy xuống dưới bằng bông tẩm nước muối cho đến khi động mạch não giữa được bộc lộ.
Tiến hành chiếu tia laser vào động mạch não giữa bên phải đã được bộc lộ, đồng thời tiêm chất nhạy cảm ánh sáng hồng bengal (20mg/kg) qua tĩnh mạch đuôi trong 90 giây Sau 4 phút chiếu laser, dịch vị trí chiếu được chuyển đến điểm khác trên động mạch não giữa bên phải và tiếp tục chiếu lần 2 trong 4 phút Cuối cùng, thắt động mạch cảnh chung bên phải, đưa cơ thái dương phải về vị trí ban đầu và khâu da vùng mổ lại.
Chuột được điều trị bằng cách cho uống thuốc hoặc nước cất hàng ngày thông qua kim cong đầu tù, bắt đầu từ một ngày sau khi gây đột quỵ và kéo dài liên tục trong 28 ngày.
Vị trí gây nhồi máu não bao gồm hình ảnh minh họa mô hình nhồi máu, trong đó hệ thống mạch máu não được nhìn từ dưới lên để xác định vị trí gây nhồi máu Động mạch não giữa được quan sát qua sọ chuột, cho thấy sự bộc lộ của nó Khi chiếu tia laser vào động mạch não giữa qua hộp sọ, sự tắc mạch sẽ tạo ra một vùng trắng không có mạch máu xung quanh điểm chiếu Cuối cùng, hình ảnh nhồi máu não tại động mạch não giữa được ghi nhận rõ ràng.
Phẫu thuật không gây đột quỵ nhồi máu não trên chuột(sham surgery)
Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được trình bày dưới dạng Mean ± SD và được so sánh thống kê bằng test T-student thông qua phần mềm SPSS 16.0 Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Độc tính cấp của dịch chiết “Thông mạch Vintong”
Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1 Độc tính cấp đường uống của dịch chiết “Thông mạch Vintong” trên chuột nhắt trắng.
Chuột nhắt trắng được uống dịch chiết “Thông mạch Vintong” với các mức liều khác nhau từ liều thấp nhất là 120 g/kg thể trọng đến liều cao nhất là
Nghiên cứu đã sử dụng liều tối đa 270 g/kg thể trọng cho chuột, với 0,2 mL/10g/lần x 3 lần/ngày, cách nhau ít nhất 3 tiếng Kết quả cho thấy không có chuột nào chết và không xuất hiện triệu chứng bất thường trong 72 giờ sau khi uống thuốc và trong suốt 7 ngày theo dõi Do đó, không xác định được LD50 của dịch chiết “Thông mạch Vintong” qua đường uống trên chuột nhắt trắng, và liều cao nhất 270 g/kg thể trọng không gây độc tính cấp.
Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn 39 1 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày 39
3.2.1 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày. a Tình trạng chung
Chuột cống trắng được theo dõi hàng ngày về tình trạng sức khỏe tổng quát, bao gồm hoạt động, chế độ ăn uống, và tình trạng lông, da, niêm mạc, cũng như chất tiết Kết quả cho thấy cả nhóm chuột chứng và nhóm sử dụng dịch chiết “Thông mạch Vintong” đều hoạt động bình thường, với lông mượt, da niêm mạc khỏe mạnh, chế độ ăn uống ổn định và phân thành khuôn Sự thay đổi thể trọng của chuột cũng được ghi nhận trong quá trình theo dõi.
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” đối với thể trọng chuột (n = 10, x ± SD).
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
- Tại thời điểm ban đầu, thể trọng chuột ở các lô là tương đương ( p > 0,05).
So sánh giữa các thời điểm cho thấy thể trọng chuột trong cả ba lô nghiên cứu đều tăng, với sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) Tuy nhiên, các lô được cho uống “Thông mạch Vintong” không có sự khác biệt so với lô chứng sinh lý (p > 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” không ảnh hưởng đến sự phát triển thể trọng của chuột, bất kể mức liều và thời gian sử dụng được nghiên cứu.
3.2.2 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” đối với một số chỉ tiêu huyết học của chuột.
Kết quả được trình bày ở các bảng 3.3, 3.4 và 3.5.
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột (n = 10, x ± SD).
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b) Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
Hàm lƣợng huyết sắc tố trong máu chuột (g/dL)
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b) Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
So sánh các lô trong cùng một thời điểm cho thấy rằng số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” không gây ra sự thay đổi nào về số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột, theo các mức liều và thời gian sử dụng được nghiên cứu.
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột (n = 10, x ± SD).
Sau 45 ngày (b) Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
Khi so sánh các lô mẫu trong cùng một thời điểm, cả hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột đều không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, và không ghi nhận sự thay đổi nào đối với các chỉ tiêu hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột.
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột (n = 10, x ± SD).
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b) Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b) Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
So sánh các lô cùng thời điểm cho thấy số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các liều lượng và thời gian sử dụng khác nhau, và không ghi nhận sự thay đổi nào đối với số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột.
3.2.3 Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan khi dùng dịch chiết “Thông mạch Vintong” dài ngày.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.6.
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” đối với hoạt độ AST và ALT (n = 10, x ± SD).
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b)
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b)
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, hoạt độ các enzym AST
- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, hoạt độ các enzymAST và ALT trong máu của chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, và kết quả cho thấy không làm thay đổi hoạt độ của các enzym AST và ALT một cách có ý nghĩa thống kê Điều này chứng tỏ rằng dịch chiết “Thông mạch Vintong” không gây hủy hoại tế bào gan trên chuột nghiên cứu.
3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng lên chức năng gan khi dùng dịch chiết “Thông mạch Vintong” dài ngày.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và bảng 3.8.
Bảng 3.7 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần trong máu (n = 10, x ± SD)
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b)
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
Trước thí nghiệm (a) Sau 45 ngày (b) Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, các chỉ số albumin và
- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, và kết quả cho thấy nó không ảnh hưởng đến các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần trong máu của chuột thí nghiệm.
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên cholesterol toàn phần trong máu (n = 10, x ± SD)
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, các chỉ số Cholesterol toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, các chỉ số Cholesterol toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” không ảnh hưởng đến chỉ số Cholesterol toàn phần trong máu của chuột nghiên cứu, bất kể mức liều và thời gian sử dụng.
3.2.5 Đánh giá ảnh hưởng lên chức năng thận khi dùng dịch chiết
“Thông mạch Vintong”dài ngày.
Kết quả được trình bày ở bảng 3.9.
Bảng 3.9 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên hàm lượng creatinin máu chuột (n = 10, x ± SD)
Sau 90 ngày (c) p trong cùng lô
- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, hàm lượng creatinin máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, hàm lượng creatinin máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05).
Dịch chiết “Thông mạch Vintong” được nghiên cứu với các liều lượng và thời gian sử dụng khác nhau không ảnh hưởng đến hàm lượng creatinin trong máu của chuột thí nghiệm.
3.2.6 Kết quả mô bệnh học tạng của chuột thí nghiệm
Quan sát đại thể bằng mắt thường và dưới kính lúp với độ phóng đại 25 lần cho thấy màu sắc và hình thái của gan, lách và thận ở hai lô sử dụng dịch chiết Thông mạch Vintong không có sự khác biệt so với chứng Ảnh 3 minh họa hình ảnh đại thể của gan, lách và thận ở chuột lô trị 2 (chuột 24, lô trị 2).
Hình ảnh đại thể các tạng gan, lách, thận của chuột ở lô trị 1 và lô trị 2, được cho uống siro “Thông mạch Vintong”, cho thấy màu nâu đỏ thẫm đồng đều, bề mặt nhẵn, không có u cục hay xuất huyết, và có độ đàn hồi khi ấn xuống Những đặc điểm này không khác biệt so với hình ảnh của các tạng gan, lách, thận ở lô chứng.
Đánh giá tác dụng tân tạo mạch máu não sau đột quỵ của dịch chiết “Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm
“Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm.
Trên tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch CD31, protein này thường hiện diện trên tế bào nội mô và cho phép đánh giá mức độ tân tạo mạch Hình ảnh nhuộm CD31, với dấu ấn màu đỏ, được thể hiện trong ảnh 13 Ảnh 13 minh họa hình ảnh hóa mô miễn dịch huỳnh quang với độ phóng đại x 100, nhằm đánh giá tân tạo mạch máu não sau đột quỵ.
Các lô chứng phẫu thuật (a), chứng nhồi máu (b), trị 1 (c) và trị 2 (d) được sắp xếp thành các dải lớn, đều Tuy nhiên, mật độ của chúng thưa hơn so với các lô khác.
Trong lô chứng nhồi máu, hình ảnh mô miễn dịch nhuộm CD31 cho thấy các dải mảnh và ngắn hơn, nhưng có mật độ dày hơn so với lô chứng phẫu thuật.
Hình ảnh hóa mô miễn dịch nhuộm CD31 ở lô trị 1 và lô trị 2 cho thấy các dải mảnh, ngắn tương tự như lô chứng nhồi máu, nhưng có mật độ dày hơn Đặc biệt, lô dùng liều cao có xu hướng mật độ dày hơn so với lô dùng liều thấp.
Mật độ vi mạch được phân tích bằng phần mềm Image J Kết quả được trình bày ở bảng 3.10.
Bảng 3.10 Mật độ vi mạch ở các lô chuột nghiên cứu (n = 08, x ± SD)
- So với lô chứng phẫu thuật, mật độ vi mạch ở lô chứng nhồi máu cao hơn nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
- So với lô chứng nhồi máu, mật độ vi mạch ở các lô trị 1 và lô trị 2 đều cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,01).
So sánh giữa hai lô trị 1 và trị 2 cho thấy mật độ vi mạch ở lô trị 2, sử dụng thông mạch vintong liều cao, có xu hướng tăng so với lô trị 1, sử dụng thông mạch vintong liều thấp; tuy nhiên, sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê Hình ảnh hóa mô miễn dịch huỳnh quang nhãn kép cho thấy sự đánh giá tân tạo mạch máu não sau đột quỵ với sự nhuộm CD31 (màu xanh) và VEGF (màu đỏ) ở độ phóng đại x400.
– lô chứng phẫu thuật, b-lô chứng nhồi máu, c-lô trị 1, d-lô trị 2)
- Ở lô chứng phẫu thuật (Ảnh a), hình ảnh VEGF có mật độ thưa.
- Ở lô chứng nhồi máu (Ảnh b), hình ảnh VEGF có mật độ dầy hơn so với ở lô chứng phẫu thuật.
Hình ảnh VEGF ở lô trị 1 và lô trị 2 cho thấy mật độ dày hơn so với lô chứng nhồi máu Đặc biệt, lô sử dụng liều cao có xu hướng mật độ dày hơn so với lô dùng liều thấp.
BÀN LUẬN
Bàn luận về độc tính cấp của bài thuốc “Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm
Theo Tổ chức Y tế thế giới, tất cả các thuốc từ dược liệu, ngoại trừ những bài thuốc cổ phương chiết xuất theo phương pháp truyền thống, cần phải được đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên động vật thực nghiệm trước khi tiến hành thử nghiệm trên người.
“Thông mạch Vintong” là bài thuốc nghiệm phương, do đó là đối tượng cần được đánh giá về độc tính cấp và bán trường diễn [61].
4.1.1 Về độc tính cấp của bài thuốc “Thông mạch Vintong" Độc tính cấp là những tác dụng không mong muốn xảy ra sau khi dùng một chất trong vòng 24 giờ [60] Động vật (thường dùng chuột) được dùng thuốc trong 24 giờ và được quan sát trong 1 tuần để xác định các triệu chứng độc (nếu có) [60], [61] Chuột nghiên cứu được lựa chọn bao gồm cả chuột đực và chuột cái, kết quả nghiên cứu vì thế bao hàm cho cả 2 giống Đường đưa thuốc sử dụng là đường uống, theo đúng như đường dự kiến sử dụng trên người Khi sử dụng đường uống, để bảo đảm cho chuột dùng được một lượng thuốc lớn với độ chính xác cao, việc đưa thuốc cưỡng bức vào dạ dày chuột qua kim cong đầu tù chuyên dụng được thực hiện Thao tác này có thể gây tổn hại đường thực quản dạ dày gây xuất huyết hoặc thủng dạ dày, hoặc có thể đưa nhầm thuốc vào đường hô hấp gây sặc thuốc, suy hô hấp làm chuột chết. Ngoài ra thao tác bắt chuột nếu thực hiện không tốt sẽ gây tổn thương chuột, thậm chí có thể làm chết chuột Chính vì vậy thao tác này được tiến hành bởi một kỹ thuật viên có kinh nghiệm, bảo đảm việc đưa thuốc vào dạ dày ruột với một lượng chính xác mà không gây tổn thương cho chuột [11].
Việc theo dõi tình trạng sức khỏe của chuột và số lượng chuột chết ở mỗi lô yêu cầu sự can thiệp của các nghiên cứu viên có kinh nghiệm và việc giám sát liên tục để phát hiện kịp thời các dấu hiệu nhiễm độc Chúng tôi tổ chức công việc theo dõi theo ca, với ít nhất hai nghiên cứu viên có kinh nghiệm trong mỗi ca, đảm bảo sự liên tục trong quá trình giám sát Chuẩn bị sẵn sàng cho việc phẫu tích chuột chết là rất quan trọng để nhanh chóng xác định nguyên nhân tử vong, có thể do độc tính của thuốc gây ra các triệu chứng như co giật, suy hô hấp, suy gan, suy thận, hoặc rối loạn điện giải do tiêu chảy, tắc ruột, và chảy máu trong Nghiên cứu này tập trung vào độc tính cấp của bài thuốc.
“Thông mạch Vintong”, không có chuột nào bị chết nên không có bất kỳ các nguyên nhân nào kể trên.
Nghiên cứu độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng cho thấy bài thuốc “Thông mạch Vintong” có thể uống liều tối đa 270g dược liệu/kg thể trọng mà không gây chết hoặc biểu hiện bất thường nào Liều 270g/kg gấp 10,4 lần liều dự kiến hiệu quả là 25,92g/kg/24h Dù uống liều cao, chuột vẫn khỏe mạnh, lông mượt, mắt trong, ăn uống và hoạt động bình thường.
Bài thuốc “Thông mạch Vintong” cho thấy tính an toàn cao khi chưa xác định được LD50 theo đường uống trên chuột nhắt trắng, ngay cả với liều cao gấp 10,4 lần mức liều dự kiến có hiệu quả Việc không phát hiện các biểu hiện bất thường của tình trạng độc tính khi sử dụng liều cao cho thấy khoảng an toàn điều trị của thuốc rất rộng.
4.1.2 Về độc tính bán trường diễn của bài thuốc “Thông mạch Vintong”
Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được thực hiện thông qua việc cho động vật thí nghiệm uống thuốc thử hàng ngày trong một khoảng thời gian xác định Thời gian sử dụng thuốc thử này phụ thuộc vào liệu trình điều trị lâm sàng.
[7] Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới [61] và quy định của Bộ y tế Việt Nam [7], thời gian nghiên cứu bán trường diễn trên động vật thường gấp
Nghiên cứu bán trường diễn về bài thuốc “Thông mạch Vintong” được thực hiện trong 3 tháng (90 ngày) nhằm đảm bảo đánh giá tính an toàn khi sử dụng hàng ngày trên người trong hơn 30 ngày Độc tính bán trường diễn được tiến hành trên chuột cống trắng, với mỗi lô gồm 10 chuột, chia thành 3 lô: lô chứng sinh lý, lô dùng thuốc với liều điều trị tương đương (gấp 7 lần liều ở người theo thể trọng), và lô dùng liều gấp 3 lần liều điều trị Thiết kế này đảm bảo độ tin cậy của nghiên cứu và tuân thủ quy định của Bộ Y tế về đánh giá tính an toàn của thuốc.
Các chỉ tiêu đánh giá độc tính bán trường diễn bao gồm tình trạng chung, thay đổi thể trọng, chỉ số huyết học, chỉ số sinh hoá chức năng gan và thận, cùng với đặc điểm giải phẫu bệnh của gan, lách và thận Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng sau 90 ngày đã cho thấy những kết quả quan trọng.
* Tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng
Tình trạng chung và cân nặng của động vật thực nghiệm là những chỉ số quan trọng cần theo dõi trước và trong quá trình sử dụng thuốc Trong suốt nghiên cứu, chuột ở cả ba lô đều duy trì hoạt động bình thường, với lông mượt, da niêm mạc khỏe mạnh, chế độ ăn uống ổn định và phân thành khuôn Sự phát triển cân nặng của chuột cũng diễn ra bình thường.
Bài thuốc “Thông mạch Vintong” có tác động đáng kể đến chức năng tạo máu, được đánh giá thông qua các chỉ số huyết học như số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu Ngoài ra, việc kiểm tra hình ảnh đại thể và vi thể của lách - cơ quan quan trọng trong việc phản ánh chức năng tạo máu và sự sống của các tế bào máu - cũng được thực hiện để cung cấp cái nhìn toàn diện về ảnh hưởng của bài thuốc này.
Nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa trong các chỉ số huyết học khi xét nghiệm máu sau khi uống bài thuốc “Thông mạch Vintong” ở 45 và 90 ngày so với lô chứng và trước khi dùng thuốc (p > 0,05) Hình ảnh vi thể và đại thể của lách chuột vẫn trong trạng thái bình thường.
Kết quả nghiên cứu cho thấy bài thuốc “Thông mạch Vintong” ở cả hai mức liều không làm ảnh hưởng tiêu cực đến chức năng tạo máu và sự sống còn của hồng cầu ở chuột sau 90 ngày sử dụng.
* Ảnh hưởng của bài thuốc “Thông mạch Vintong” đến gan
Gan là tạng lớn nhất trong cơ thể, đảm nhận nhiều chức năng quan trọng như ngoại tiết, nội tiết, và là kho dự trữ chất dinh dưỡng Đồng thời, gan cũng là trung tâm chuyển hóa thiết yếu và có vai trò sinh mạng Do đó, việc nghiên cứu tác động của thuốc đối với gan là rất cần thiết để đánh giá độc tính của các loại thuốc.
Khi thuốc được đưa vào cơ thể, nó có thể gây độc cho gan, dẫn đến tổn thương tế bào gan và làm tăng hoạt độ của các enzym gan trong huyết thanh, đặc biệt là ALT và AST ALT chủ yếu tập trung ở bào tương tế bào gan, trong khi AST chủ yếu nằm trong ty thể Khi tế bào gan bị tổn thương, hoạt độ của cả hai enzym này đều tăng, nhưng mức độ tăng của ALT thường cao hơn và xuất hiện sớm hơn so với AST Trong nghiên cứu, hoạt độ ALT và AST trong máu chuột uống bài thuốc Thông mạch Vintong không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng, cho thấy thuốc không gây tổn thương tế bào gan Kết quả mô bệnh học cũng xác nhận rằng cấu trúc tế bào gan ở cả hai lô uống thuốc đều bình thường, không có dấu hiệu tổn thương vi thể.
Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của hemoglobin, chủ yếu được hình thành ở gan, lách và tuỷ xương Nghiên cứu này đánh giá chỉ số bilirubin toàn phần trong máu để xác định độc tính của thuốc đối với gan, như hủy hoại tế bào gan, tắc mật và suy giảm chức năng liên hợp của gan, tất cả đều dẫn đến tăng bilirubin Ngoài ra, chỉ số này cũng giúp đánh giá ảnh hưởng của thuốc đến đời sống hồng cầu, vì độc tính có thể gây tan máu và tăng bilirubin Kết quả cho thấy chỉ số bilirubin trong máu ở mức bình thường, cho thấy chế phẩm không gây độc với gan và không ảnh hưởng đến đời sống hồng cầu.