Nghiên cứu độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng tân tạo mạch máu não của bài thuốc thông mạch vintong trên động vật thực nghiệm

CHẤT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…

Chất liệu nghiên cứu

Chất liệu nghiên cứu là bài thuốc “Thông mạch Vintong”, thành phần gồm các vị thuốc:

Bảng 2.1 Thành phần “Thông mạch Vintong”

Tên vị thuốc Tên khoa học [8] Hàm lƣợng (g) Đinh lăng Radix Codonopis 10

Hà thủ ô Radix Fallopiae multiflorae 10

Sơn tra Crataegus pinnatifida Bunge 15

Tam thất Radix Panasus notoginseng 02 Địa long Lumbricus 05

Thủy điệt Whimania pigra 05 Đông trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis 01

Xuyên khung Rhizoma Ligustici wallichii 05

Xích thược Radix Paeonice Rubra 15

Chỉ xác Fructus Citri Aurantii 05

Cúc hoa Flos Chrysanthemi Morifolii 10

Tất cả các vị thuốc trong bài thuốc đều đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V Thuốc được chiết xuất bằng nước, sử dụng máy sắc thuốc tự động tại Khoa Dược Bệnh viện Tuệ Tĩnh, với dịch chiết thu được có tỷ lệ 1:1, tức 100ml dịch chiết tương đương 100g dược liệu.

Thuốc được chiết xuất với tỷ lệ 1:1 và được cô đặc phù hợp để cho chuột uống Liều dùng cho người là 108g mỗi ngày, tương đương với 2,16g/kg/24h tính theo trọng lượng cơ thể 50kg Từ đó, có thể quy đổi liều dùng cho chuột nhắt.

Đối tượng nghiên cứu

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, cả 2 giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g do Ban chăn nuôi - Học viện Quân Y cung cấp

2.2.2 Độc tính bán trường diễn

Chuột cống trắng chủng Wistar, trọng lượng 180 ± 20 g do Ban chăn nuôi – Học viện Quân Y cung cấp

2.2.3 Mô hình đột quỵ não

Chuột nhắt trắng chủng Swiss, giống đực, khoẻ mạnh, trọng lượng 18 – 22g do Ban chăn nuôi – Học viện Quân Y cung cấp

Tất cả động vật thực nghiệm được nuôi dưỡng trong phòng thí nghiệm ít nhất một tuần trước khi tiến hành thí nghiệm, được cung cấp thức ăn theo tiêu chuẩn cho động vật nghiên cứu và nước (đun sôi để nguội) uống tự do.

Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trong thời gian từ tháng 6/2020 đến tháng 10/2020 tại Học viện Quân Y.

Phương pháp nghiên cứu

A study was conducted to assess the acute toxicity and determine the LD50 of "Thông mạch Vintong" in white mice through oral administration, following the guidelines set by the Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD).

Mẫu nghiên cứu là 60 chuột nhắt trắng được chia làm 6 lô, mỗi lô 10 con và được uống dịch chiết “Thông mạch Vintong” với liều tăng dần

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu độc tính cấp

- Số chuột chết/có biểu hiện bất thường trong suốt 7 ngày và tỷ lệ chết trong vòng 72 giờ sau khi uống thuốc

- Các chỉ số liên quan đến tình trạng chung của chuột: ăn, ngủ, vận động, bài tiết…

- Các chỉ số liên quan đến dấu hiệu nhiễm độc: nôn, co giật, kích động, bài tiết…

Uống dịch chiết “Thông mạch Vintong” liều tăng dần trong cùng một thể tích

Liều thấp nhất gây chết 100% chuột

Dịch chiết “Thông mạch Vintong”

Liều cao nhất không có chuột chết

- Theo dõi tình trạng chung, biểu hiện nhiễm độc trong 72 giờ và 7 ngày sau khi uống thuốc.

- Phẫu tích đánh giá tất cả chuột chết (nếu có) Tính toán xác định LD 50

2.4.1.5 Công cụ sử dụng trong nghiên cứu

- Cân điện tử của Nhật, độ chính xác 0,001 gam

- Kim đầu tù cho chuột uống thuốc

- Cốc chia vạch, bơm kim tiêm 1ml

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” được cô đặc với tỷ lệ 4,5:1 (100ml tương đương 450g dược liệu), là dung dịch đậm đặc nhất dành cho chuột nhắt trắng uống qua kim chuyên dụng Dung dịch này sau đó được pha loãng đến các nồng độ thích hợp để nghiên cứu độc tính cấp và xác định LD 50 của bài thuốc “Thông mạch Vintong” trong thực nghiệm.

Chuẩn bị chuột nghiên cứu

Trước khi tiến hành thí nghiệm, cho chuột nhịn ăn qua đêm

Chuột được chia thành các lô khác nhau, mỗi lô 10 con

Sau 12 giờ nhịn ăn, chuột được uống thuốc cưỡng bức, thuốc thử được đưa thẳng vào dạ dày chuột bằng kim cong đầu tù

Cho chuột uống thuốc với liều 0,25ml/10g trọng lượng cơ thể mỗi lần, tối đa 3 lần trong 24 giờ và cách nhau ít nhất 3 giờ Mục tiêu là xác định liều cao nhất không gây chết chuột, liều thấp nhất gây chết 100% số chuột và các liều trung gian.

2.4.1.7 Phương pháp đánh giá kết quả

Theo dõi tình trạng sức khỏe của chuột, ghi nhận các triệu chứng nhiễm độc như nôn mửa, co giật, kích động và bài tiết Đặc biệt, chú ý đến số lượng chuột chết trong vòng 72 giờ sau khi tiếp nhận thuốc.

Tất cả chuột chết sẽ được mổ để đánh giá tổn thương đại thể và xác định nguyên nhân gây độc, từ đó xây dựng đồ thị tuyến tính nhằm phân tích kết quả.

Sau đó tiếp tục theo dõi tình trạng của chuột đến hết ngày thứ 7 sau khi uống dịch chiết “Thông mạch Vintong”

2.4.2 Độc tính bán trường diễn

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn trên chuột cống trắng theo đường uống theo hướng dẫn của OECD về thuốc có nguồn gốc dược liệu [38]

2.4.2.2 Chọn mẫu và cỡ mẫu

Chọn 30 chuột cống trắng chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con Chuột được cho uống nước cất và hoặc dịch chiết “Thông mạch Vintong” với liều 15,12g/kg/24hvà 45,36g/kg/24h (theo phân lô)

2.4.3 Quy trình nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Sơ đồ 2.2 Sơ đồ nghiên cứu độc tính bán trường diễn

Các chỉ tiêu nghiên cứu được đánh giá ở thời điểm ngày D 0 ; D 45 và D 90 sau uống Thông mạch Vintong với liều khác nhau Bao gồm:

- Tình trạng chung, thể trọng của chuột

- Chức năng gan, thận, chức phận tạo máu

Dịch chiết “Thông mạch Vintong”

Lô 2: uống liều 15,12g dược liệu /kg/ngày × 1 lần (sáng) ×

Lô 3: uống liều 45,36g dược liệu /kg/ngày × 1 lần (sáng) ×

- Mức độ hủy hoại tế bào

- Mức độ hủy hoại tế bào gan

- Mô bệnh học gan, lách, thận

2.4.3.2 Công cụ sử dụng trong nghiên cứu

Kit định lượng enzym và chất chuyển hóa trong máu bao gồm các chỉ số ALT, AST, bilirubin toàn phần, albumin, cholesterol toàn phần và creatinin, được sản xuất bởi hãng Erba Các chỉ số này được định lượng trên máy sinh hóa bán tự động Erba của Ấn Độ, đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong việc phân tích mẫu máu.

- Các dung dịch xét nghiệm máu của hãng Horiba ABX, định lượng trên máy Horiba ABX Micros của Pháp

- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học

Chuột được chia làm 3 lô, mỗi lô 10 con

- Lô chứng: uống nước cất 1ml/kg/ngày

- Lô trị 1: uống viên hoàn “Thông mạch Vintong” liều 15,12g dược liệu/kg/ngày

- Lô trị 2:uống viên hoàn “Thông mạch Vintong” liều 45,36g dược liệu/kg/ngày (gấp 3 lần lô trị 1)

Chuột được uống nước cất hoặc thuốc thử trong 90 ngày liên tục, mỗi ngày một lần vào buổi sáng

2.4.3.4 Phương pháp đánh giá kết quả

Đánh giá chức năng tạo máu có thể được thực hiện thông qua các chỉ số như số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu Những chỉ số này cung cấp cái nhìn tổng quát về sức khỏe hệ thống tạo máu và giúp phát hiện sớm các vấn đề liên quan đến máu.

- Đánh giá chức năng gan thông qua định lượng chất chuyển hoá trong máu: billlirubin toàn phần, albumin, cholesterol [62]

- Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan thông qua định lượng hoạt độ enzym trong máu: ALT, AST [62]

- Đánh giá chức năng thận thông qua định lượng nồng độ creatinin huyết thanh

- Các thông số theo dõi được kiểm tra vào trước lúc uống thuốc, sau 45 ngày uống thuốc và sau 90 ngày uống thuốc

Sau 90 ngày điều trị bằng thuốc, tất cả các con chuột được tiến hành mổ để quan sát tổng thể các cơ quan Đồng thời, 30% số chuột trong mỗi nhóm được kiểm tra ngẫu nhiên để đánh giá cấu trúc vi thể của gan và thận.

2.4.4 Mô hình đột quỵ não

Nghiên cứu tiến hành gây nhồi máu não tại động mạch não của chuột nhắt trắng thông qua phản ứng quang hóa do tia laser chiếu, theo phương pháp của Hiroshi Sugimori và cộng sự (2004).

Chuột nhắt trắng 32 con, được chia làm 4 lô, mỗi lô 8 con Trong số này có

Trong một nghiên cứu, 24 con chuột đã trải qua phẫu thuật gây nhồi máu não, trong khi 08 con chuột khác được phẫu thuật nhưng không bị nhồi máu não Tất cả các con chuột này được cung cấp nước cất hoặc thuốc nghiên cứu với các mức liều khác nhau.

Sơ đồ 2.3 Sơ đồ nghiên cứu tác dụng tăng tân tạo mạch máu của “Thông mạch Vintong” trên chuột nhắt trắng đột quỵ não

32 chuột nhắt trắng đực khỏe mạnh, chia ngẫu nhiên 4 lô

24 chuột gây nhồi máu não 8 chuột không gây nhồi máu não

Sau 28 ngày dùng thuốc, đánh giá mô bệnh học tân tạo mạch

2.4.4.4 Ch ỉ tiêu theo dõi Đánh giá mô bệnh học tân tạo mạch máu (CD31, VEGF/CD31)

- Kính hiển vi phẫu thuật;

- Máy cắt bệnh phẩm lạnh

- Cân phân tích, độ chính xác 10 -4 g (Sartorius)

- Bộ dụng cụ mổ động vật cỡ nhỏ, kim cho chuột uống, chỉ phẫu thuật 6.0 và các dụng cụ thí nghiệm khác

- Hồng bengal (Rose bengal dye) của Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan)

- Các hóa chất nhuộm HE

Phẫu thuật gây đột quỵ nhồi máu não trên chuột

Chuột nhắt trắng được gây mê bằng Nembutal với liều 40mg/kg thể trọng Sau đó, một đường rạch vùng cổ được thực hiện để bộc lộ động mạch cảnh chung bên phải, kèm theo việc đặt chỉ chờ Tiếp theo, một đường rạch giữa tai phải và mắt phải được thực hiện để lộ vùng xương sọ và cơ thái dương bên phải Cơ thái dương được tách ra khỏi xương thái dương và đẩy xuống dưới bằng bông tẩm nước muối cho đến khi động mạch não giữa được bộc lộ.

Tiến hành chiếu tia laser vào động mạch não giữa bên phải đã được bộc lộ, kết hợp với việc tiêm chất nhạy cảm ánh sáng hồng bengal (20mg/kg) qua tĩnh mạch đuôi trong 90 giây Sau 4 phút chiếu laser, dịch tại vị trí chiếu được chuyển đến một điểm khác trên động mạch não giữa bên phải, gần với điểm chiếu ban đầu, và tiếp tục chiếu lần 2 trong 4 phút Sau khi hoàn tất chiếu lần 2, thắt động mạch cảnh chung bên phải, đưa cơ thái dương phải về vị trí ban đầu và khâu da vùng mổ lại.

Chuột được cho uống thuốc hoặc nước cất hàng ngày qua kim cong đầu tù, bắt đầu từ một ngày sau khi gây đột quỵ và kéo dài trong 28 ngày Hình 2.1 minh họa mô hình gây nhồi máu não, bao gồm: a Hệ thống mạch máu não nhìn từ dưới lên cùng vị trí gây nhồi máu; b Động mạch não giữa được quan sát qua sọ chuột tại vùng bộc lộ; c Chiếu tia laser vào động mạch não giữa qua hộp sọ; d Sau khi chiếu laser, sự tắc mạch tạo ra một vùng trắng không có mạch máu xung quanh điểm chiếu; e Hình ảnh nhồi máu não tại động mạch não giữa.

Phẫu thuật không gây đột quỵ nhồi máu não trên chuột(sham surgery)

Chuột được phẫu thuật theo phương pháp tương tự như phẫu thuật gây nhồi máu, bao gồm việc bộc lộ động mạch não giữa và động mạch cảnh chung, nhưng không tạo ra cục máu đông do không sử dụng tia laser.

Phương pháp xử lý số liệu

Các số liệu được trình bày dưới dạng trung bình ± độ lệch chuẩn (Mean ± SD) Phân tích so sánh thống kê được thực hiện bằng phương pháp T-test, sử dụng phần mềm SPSS phiên bản 16.0 Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Độc tính cấp của dịch chiết “Thông mạch Vintong”

Kết quả nghiên cứu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1 Độc tính cấp đường uống của dịch chiết “Thông mạch Vintong” trên chuột nhắt trắng

Số chuột sống/chết sau 72 giờ

Số chuột sống/chết sau 7 ngày

Chuột nhắt trắng được uống dịch chiết “Thông mạch Vintong” với các mức liều khác nhau từ liều thấp nhất là 120 g/kg thể trọng đến liều cao nhất là

Liều tối đa có thể dùng cho chuột nhắt trắng là 270 g/kg thể trọng, với 0,2 mL/10g/lần, ba lần mỗi ngày, cách nhau ít nhất 3 giờ Sau khi uống liều này, không có chuột nào chết và không xuất hiện triệu chứng bất thường trong 72 giờ và 7 ngày sau đó Do đó, không xác định được LD 50 của dịch chiết “Thông mạch Vintong” qua đường uống, và liều 270 g/kg thể trọng không gây độc tính cấp.

Kết quả nghiên cứu độc tính bán trường diễn 39 1 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày 39

3.2.1 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng của chuột cống trắng khi dùng dài ngày a Tình trạng chung

Chuột cống trắng được theo dõi hàng ngày về hoạt động, ăn uống, tình trạng lông, da, niêm mạc và chất tiết, với kết quả cho thấy cả nhóm chuột chứng và nhóm sử dụng dịch chiết “Thông mạch Vintong” đều hoạt động bình thường Lông chuột mượt mà, da và niêm mạc khỏe mạnh, chế độ ăn uống ổn định và phân được thành khuôn Sự thay đổi thể trọng của chuột cũng được ghi nhận trong quá trình theo dõi.

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” đối với thể trọng chuột (n = 10, ± SD)

Thời điểm XN Lô chứng (1) Lô trị 1 (2) Lô trị 2 (3) p giữa các lô

- Tại thời điểm ban đầu, thể trọng chuột ở các lô là tương đương ( p > 0,05)

So với thời điểm trước, thể trọng chuột trong cả ba lô nghiên cứu đều có sự gia tăng đáng kể, với sự thay đổi này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01.

Sau 45 ngày và 90 ngày sử dụng thuốc “Thông mạch Vintong”, thể trọng của chuột ở các nhóm thử nghiệm không khác biệt so với nhóm chứng sinh lý (p> 0,05).

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau không gây ảnh hưởng đến sự phát triển thể trọng của chuột.

3.2.2 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” đối với một số chỉ tiêu huyết học của chuột

Kết quả được trình bày ở các bảng 3.3, 3.4 và 3.5

Bảng 3.3 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột (n = 10, ± SD)

Thời điểm XN Lô chứng(1) Lô trị 1 (2) Lô trị 2 (3) p giữa các lô

Số lƣợng hồng cầu chuột(x10 12 g/l)

Sau 90 ngày (c) 7,11 ± 1,03 6,75 ± 0,61 6,98 ± 0,69 p trong cùng lô p b,c-a > 0,05;p c-b > 0,05 -

Hàm lƣợng huyết sắc tố trong máu chuột (g/dL) Trước thí nghiệm (a) 12,46 ± 1,21 12,72 ± 0,84 12,66 ± 1,30 p 2-1 > 0,05 p 3-2 > 0,05 p 3-1 > 0,05

Khi so sánh các lô chuột tại cùng một thời điểm, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu (p > 0,05).

Trong từng lô thí nghiệm, sự so sánh cho thấy số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột không có sự thay đổi có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với nhiều liều lượng và thời gian sử dụng khác nhau, nhưng chưa ghi nhận sự thay đổi nào về số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố trong máu chuột.

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột (n = 10, ± SD)

Thể tích trung bình hồng cầu (fl)

- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)

- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) x

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, và kết quả cho thấy không gây ra sự thay đổi nào về hematocrit và thể tích trung bình hồng cầu trong máu chuột.

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột (n = 10, ± SD).

Khi so sánh các lô trong cùng một thời điểm, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột (p > 0,05).

Trong từng lô thí nghiệm, sự so sánh cho thấy số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các liều lượng và thời gian sử dụng khác nhau, và kết quả cho thấy không gây ra sự thay đổi nào về số lượng bạch cầu và tiểu cầu trong máu chuột.

3.2.3 Đánh giá mức độ hủy hoại tế bào gan khi dùng dịch chiết “Thông mạch Vintong” dài ngày

Kết quả được trình bày ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” đối với hoạt độ AST và ALT (n = 10, ± SD)

- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, hoạt độ các enzym AST và ALT trong máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)

- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, hoạt độ các enzym AST và ALT trong máu của chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) x

Nghiên cứu cho thấy dịch chiết “Thông mạch Vintong” không làm thay đổi đáng kể hoạt độ của các enzym AST và ALT, điều này chứng tỏ rằng nó không gây hủy hoại tế bào gan trên chuột thí nghiệm.

3.2.4 Đánh giá ảnh hưởng lên chức năng gan khi dùng dịch chiết “Thông mạch Vintong” dài ngày

Kết quả được trình bày ở bảng 3.7 và bảng 3.8

Bảng 3.7 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần trong máu (n = 10, ± SD)

- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) x

- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, và kết quả cho thấy không có sự thay đổi nào trong các chỉ số albumin và bilirubin toàn phần trong máu chuột thí nghiệm.

Bảng 3.8 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên cholesterol toàn phần trong máu (n = 10, ± SD)

Thời điểm XN Lô chứng(1) Lô trị 1 (2) Lô trị 2 (3) pgiữa các lô

Sau 90 ngày (c) 1,94 ± 0,34 1,95 ± 0,38 1,98 ± 0,42 p trong cùng lô p b,c-a > 0,05; p c-b > 0,05 -

- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, các chỉ số Cholesterol toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)

- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, các chỉ số Cholesterol toàn phần máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) x

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” đã được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, và kết quả cho thấy không có sự thay đổi nào đối với chỉ số Cholesterol toàn phần trong máu của chuột thí nghiệm.

3.2.5 Đánh giá ảnh hưởng lên chức năng thận khi dùng dịch chiết

“Thông mạch Vintong”dài ngày

Kết quả được trình bày ở bảng 3.9

Bảng 3.9 Ảnh hưởng của dịch chiết “Thông mạch Vintong” lên hàm lượng creatinin máu chuột (n = 10, ± SD)

Thời điểm XN Lô chứng (1) Lô trị 1 (2) Lô trị 2 (3) p giữa các lô

- So sánh các lô với nhau trong cùng một thời điểm, hàm lượng creatinin máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05)

- So sánh trong từng lô giữa các thời điểm thí nghiệm, hàm lượng creatinin máu chuột thay đổi không có ý nghĩa thống kê (p> 0,05) x

Dịch chiết “Thông mạch Vintong” được nghiên cứu với các mức liều và thời gian sử dụng khác nhau, không làm thay đổi hàm lượng creatinin trong máu của chuột thí nghiệm.

3.2.6 Kết quả mô bệnh học tạng của chuột thí nghiệm

Đánh giá tác dụng tân tạo mạch máu não sau đột quỵ của dịch chiết “Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm

“Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm

Trên tiêu bản nhuộm hóa mô miễn dịch, CD31 (Cluster of differentiation 31) là protein đặc trưng cho tế bào nội mô, giúp đánh giá mức độ tân tạo mạch Hình ảnh nhuộm CD31 cho thấy dấu ấn này có màu đỏ, như được thể hiện trong ảnh 13.

Trong lô chứng phẫu thuật (Ảnh a), hình ảnh mô miễn dịch nhuộm CD31 cho thấy các dải mạch máu được sắp xếp đều, nhưng mật độ thấp hơn so với các lô khác Ảnh 13 minh họa hình ảnh hóa mô miễn dịch huỳnh quang với độ phóng đại x 100, cho phép đánh giá tân tạo mạch máu não sau đột quỵ.

Trong lô chứng nhồi máu, hình ảnh mô miễn dịch nhuộm CD31 cho thấy sự sắp xếp thành các dải mảnh và ngắn hơn, nhưng có mật độ dày hơn so với lô chứng phẫu thuật.

Hình ảnh hóa mô miễn dịch nhuộm CD31 ở lô trị 1 và lô trị 2 cho thấy các dải mảnh, ngắn tương tự như lô chứng nhồi máu, nhưng với mật độ dày hơn Đặc biệt, lô sử dụng liều cao có xu hướng mật độ dày hơn so với lô dùng liều thấp.

Mật độ vi mạch được phân tích bằng phần mềm Image J Kết quả được trình bày ở bảng 3.10

Bảng 3.10 Mật độ vi mạch ở các lô chuột nghiên cứu (n = 08, ± SD)

Lô nghiên cứu Mật độ vi mạch (%) Giá trị p

- So với lô chứng phẫu thuật, mật độ vi mạch ở lô chứng nhồi máu cao hơn nhưng không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)

- So với lô chứng nhồi máu, mật độ vi mạch ở các lô trị 1 và lô trị 2 đều cao hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,01)

So sánh giữa lô trị 1 và lô trị 2 cho thấy mật độ vi mạch ở lô trị 2, sử dụng thông mạch vintong liều cao, có xu hướng tăng hơn so với lô trị 1, sử dụng thông mạch vintong liều thấp Tuy nhiên, sự khác biệt này chưa đạt ý nghĩa thống kê.

- Ở lô chứng phẫu thuật (Ảnh a), hình ảnh VEGF có mật độ thưa

- Ở lô chứng nhồi máu (Ảnh b), hình ảnh VEGF có mật độ dầy hơn so với ở lô chứng phẫu thuật

Trong nghiên cứu, hình ảnh VEGF ở lô trị 1 và lô trị 2 cho thấy mật độ dày hơn so với lô chứng nhồi máu Đặc biệt, lô dùng liều cao có xu hướng mật độ dày hơn so với lô dùng liều thấp Hình ảnh hóa mô miễn dịch huỳnh quang nhãn kép với độ phóng đại x 400 đã được sử dụng để nhuộm CD31 (màu xanh) và VEGF (màu đỏ), nhằm đánh giá sự tân tạo mạch máu não sau đột quỵ (a – lô chứng phẫu thuật, b – lô chứng nhồi máu, c – lô trị 1, d – lô trị 2).

BÀN LUẬN

Bàn luận về độc tính cấp của bài thuốc “Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm

Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới, tất cả các thuốc có nguồn gốc từ dược liệu, ngoại trừ các bài thuốc cổ phương chiết xuất theo phương pháp truyền thống, cần phải được đánh giá độc tính cấp và bán trường diễn trên động vật thực nghiệm trước khi tiến hành thử nghiệm trên người.

“Thông mạch Vintong” là bài thuốc nghiệm phương, do đó là đối tượng cần được đánh giá về độc tính cấp và bán trường diễn [61]

4.1.1 V ề độ c tính c ấ p c ủ a bài thu ố c “ Thông m ạ ch Vintong" Độc tính cấp là những tác dụng không mong muốn xảy ra sau khi dùng một chất trong vòng 24 giờ [60] Động vật (thường dùng chuột) được dùng thuốc trong 24 giờ và được quan sát trong 1 tuần để xác định các triệu chứng độc (nếu có) [60], [61] Chuột nghiên cứu được lựa chọn bao gồm cả chuột đực và chuột cái, kết quả nghiên cứu vì thế bao hàm cho cả 2 giống Đường đưa thuốc sử dụng là đường uống, theo đúng như đường dự kiến sử dụng trên người Khi sử dụng đường uống, để bảo đảm cho chuột dùng được một lượng thuốc lớn với độ chính xác cao, việc đưa thuốc cưỡng bức vào dạ dày chuột qua kim cong đầu tù chuyên dụng được thực hiện Thao tác này có thể gây tổn hại đường thực quản dạ dày gây xuất huyết hoặc thủng dạ dày, hoặc có thể đưa nhầm thuốc vào đường hô hấp gây sặc thuốc, suy hô hấp làm chuột chết Ngoài ra thao tác bắt chuột nếu thực hiện không tốt sẽ gây tổn thương chuột, thậm chí có thể làm chết chuột Chính vì vậy thao tác này được tiến hành bởi một kỹ thuật viên có kinh nghiệm, bảo đảm việc đưa thuốc vào dạ dày ruột với một lượng chính xác mà không gây tổn thương cho chuột [11]

Việc theo dõi tình trạng chung và số lượng chuột chết trong từng lô yêu cầu các nghiên cứu viên có kinh nghiệm thực hiện liên tục để phát hiện kịp thời các dấu hiệu độc Chúng tôi luôn tổ chức theo ca, mỗi ca có ít nhất hai nghiên cứu viên, đảm bảo việc giám sát diễn ra liên tục Chuẩn bị sẵn sàng cho việc phẫu tích chuột chết giúp đánh giá nhanh nguyên nhân gây tử vong, có thể do độc tính của thuốc, suy hô hấp, tổn thương gan thận, hoặc rối loạn điện giải Tuy nhiên, trong nghiên cứu độc tính cấp của bài thuốc “Thông mạch Vintong”, không có chuột nào bị chết, do đó không có nguyên nhân nào được ghi nhận.

Nghiên cứu độc tính cấp đường uống trên chuột nhắt trắng cho thấy khi cho chuột uống bài thuốc “Thông mạch Vintong” với liều tăng dần từ 120g đến 270g dược liệu/kg thể trọng, không có chuột nào chết và không có biểu hiện bất thường nào Liều 270g/kg thể trọng là liều cao nhất trong 24 giờ, gấp 10,4 lần liều dự kiến 25,92g/kg/24h, nhưng tất cả chuột vẫn khỏe mạnh, lông mượt, mắt trong, ăn uống và hoạt động bình thường.

Bài thuốc “Thông mạch Vintong” chưa xác định được LD50 khi sử dụng qua đường uống trên chuột nhắt trắng, ngay cả khi cho liều cao gấp 10,4 lần mức liều hiệu quả dự kiến Hơn nữa, không có biểu hiện bất thường nào liên quan đến tình trạng độc hại khi sử dụng liều cao, điều này chứng tỏ rằng “Thông mạch Vintong” có tính an toàn cao và khoảng an toàn điều trị rộng.

4.1.2 V ề độ c tính bán trườ ng di ễ n c ủ a bài thu ố c “ Thông m ạ ch Vintong ”

Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được thực hiện bằng cách cho động vật thí nghiệm uống thuốc thử hàng ngày trong một khoảng thời gian nhất định Thời gian sử dụng thuốc thử này thường dựa trên thời gian sử dụng lâm sàng của nó.

[7] Theo hướng dẫn của Tổ chức Y tế thế giới [61] và quy định của Bộ y tế Việt Nam [7], thời gian nghiên cứu bán trường diễn trên động vật thường gấp

Nghiên cứu bán trường diễn của bài thuốc “Thông mạch Vintong” được thực hiện trong 90 ngày nhằm đánh giá tính an toàn khi sử dụng hàng ngày trên người trong hơn 30 ngày Để đảm bảo kết quả nghiên cứu không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố nhiễu, thời gian nghiên cứu trên động vật cần kéo dài gấp 4 lần so với thời gian dự kiến trên người Độc tính bán trường diễn được kiểm tra trên 30 con chuột cống trắng, chia thành 3 lô: một lô chứng sinh lý, một lô dùng liều điều trị dự kiến (gấp 7 lần liều ở người theo thể trọng), và một lô dùng liều gấp 3 lần liều điều trị Thiết kế này đảm bảo độ tin cậy của nghiên cứu và tuân thủ quy định của Bộ Y tế trong việc đánh giá tính an toàn của thuốc.

Các chỉ tiêu đánh giá độc tính bán trường diễn bao gồm tình trạng chung, thay đổi thể trọng, chỉ số huyết học, chỉ số sinh hóa chức năng gan và thận, cùng với đặc điểm giải phẫu bệnh của gan, lách và thận Nghiên cứu độc tính bán trường diễn sau 90 ngày trên chuột cống trắng đã cho thấy những kết quả quan trọng.

* Tình trạng chung và sự thay đổi thể trọng

Tình trạng sức khỏe và cân nặng của động vật thực nghiệm là các chỉ số quan trọng cần theo dõi trước và trong quá trình sử dụng thuốc Trong suốt nghiên cứu, chuột ở cả ba lô đều hoạt động bình thường, có lông mượt, da niêm mạc bình thường, ăn uống ổn định và phân thành khuôn Sự phát triển cân nặng của chuột trong các lô vẫn nằm trong mức bình thường.

*Ảnh hưởng của bài thuốc “Thông mạch Vintong” đến chức năng tạo máu

Các chỉ số trong xét nghiệm tế bào máu ngoại vi là công cụ quan trọng để đánh giá chức năng tạo máu Chúng tôi đã tiến hành đánh giá ảnh hưởng của bài thuốc “Thông mạch Vintong” đến chức năng tạo máu thông qua các chỉ số huyết học như số lượng hồng cầu, thể tích trung bình hồng cầu, hàm lượng hemoglobin, hematocrit, số lượng bạch cầu, công thức bạch cầu và số lượng tiểu cầu Bên cạnh đó, hình ảnh đại thể và vi thể của lách, một cơ quan quan trọng trong việc phản ánh chức năng tạo máu và tuổi thọ của các tế bào máu, cũng được xem xét.

Nghiên cứu cho thấy, xét nghiệm máu về các chỉ số huyết học sau khi uống bài thuốc “Thông mạch Vintong” trong 45 và 90 ngày không có sự khác biệt có ý nghĩa so với lô chứng và trước khi dùng thuốc (p > 0,05) Hình ảnh vi thể và đại thể của lách chuột cũng cho thấy kết quả bình thường.

Bài thuốc “Thông mạch Vintong” đã được thử nghiệm ở hai mức liều khác nhau, cho thấy không gây ảnh hưởng tiêu cực đến chức năng tạo máu và sự sống của hồng cầu ở chuột sau 90 ngày sử dụng.

* Ảnh hưởng của bài thuốc “Thông mạch Vintong” đến gan

Gan là tạng lớn nhất trong cơ thể, đóng vai trò quan trọng trong chức năng ngoại tiết và nội tiết, đồng thời là kho dự trữ nhiều chất và trung tâm chuyển hóa thiết yếu Do đó, việc nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc đến gan là cần thiết để đánh giá độc tính của các loại thuốc.

Khi thuốc được đưa vào cơ thể, nó có thể gây độc cho gan, dẫn đến tổn thương tế bào gan và làm tăng hoạt độ của các enzym gan trong huyết thanh, đặc biệt là ALT và AST ALT chủ yếu có mặt trong bào tương tế bào gan, và khi tế bào gan bị tổn thương, hoạt độ ALT trong máu tăng cao Ngược lại, AST chủ yếu nằm trong ty thể và được giải phóng khi có tổn thương tế bào Cả hai enzym này đều tăng cao khi gan bị tổn thương, nhưng mức tăng của ALT thường cao hơn AST và xảy ra sớm hơn trước khi xuất hiện vàng da Trong nghiên cứu này, hoạt độ ALT và AST ở chuột uống bài thuốc Thông mạch Vintong không có sự khác biệt đáng kể so với nhóm chứng, cho thấy cả hai liều thuốc đều không gây tổn thương tế bào gan Kết quả mô bệnh học cũng xác nhận rằng cấu trúc tế bào gan ở cả hai nhóm uống thuốc vẫn bình thường, không có dấu hiệu tổn thương vi thể.

Bilirubin là sản phẩm thoái hóa của hemoglobin, được hình thành chủ yếu ở gan, lách và tuỷ xương Nghiên cứu này tập trung vào việc đánh giá chỉ số bilirubin toàn phần trong máu để xác định độc tính của thuốc đối với gan, bao gồm khả năng gây hủy hoại tế bào gan, tắc mật và suy giảm chức năng liên hợp Đồng thời, chỉ số này cũng giúp đánh giá tác động của thuốc lên đời sống hồng cầu, vì độc tính có thể dẫn đến tình trạng tan máu và tăng bilirubin Kết quả cho thấy chỉ số bilirubin trong máu ở mức bình thường, cho thấy chế phẩm không gây độc với gan và không ảnh hưởng đến đời sống hồng cầu.

Bàn luận về tác dụng tân tạo mạch máu não sau đột quỵ của bài thuốc “Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm

Sau khi bị nhồi máu não, vùng não tổn thương thiếu máu cần có những đáp ứng từ cơ thể, trong đó tăng tân tạo mạch là một cơ chế quan trọng nhằm cung cấp máu đến vùng tổn thương Nghiên cứu cho thấy sự tăng tân tạo mạch rõ rệt ở lô gây nhồi máu so với lô chứng phẫu thuật, cho thấy đây là một đáp ứng tích cực hỗ trợ hồi phục Dịch chiết “Thông mạch Vintong” khi cho chuột uống đã làm tăng khả năng tân tạo mạch, với kết quả cho thấy sự gia tăng ở các chỉ số CD31 và VEGF CD31 là protein trên tế bào nội mô, phản ánh mật độ vi mạch máu ở não, trong khi VEGF là yếu tố tăng trưởng kích thích hình thành mạch máu Việc tăng biểu hiện VEGF ở chuột uống “Thông mạch Vintong” là bằng chứng quan trọng khẳng định tác dụng của bài thuốc Mặc dù đánh giá VEGF chủ yếu qua hình ảnh nhuộm miễn dịch huỳnh quang kép, việc nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác dụng của “Thông mạch Vintong” trên mô hình nhồi máu não cần được thực hiện trong các nghiên cứu tiếp theo.

Theo y học hiện đại, tác dụng dược lý của bài thuốc được giải thích nhờ vào hiệu quả tái tạo thần kinh và mạch máu não của các dược liệu thành phần Khi kết hợp hợp lý, chúng tạo ra tác dụng hiệp đồng Achyranthes bidentata (Ngưu tất) có khả năng tăng tốc độ tái tạo dây thần kinh ngoại vi và giảm chết tế bào do glutamate ở tế bào thần kinh hải mã Polygonum multiflorum Thunb (Hà thủ ô) được biết đến như một loại thuốc bổ và chống lão hóa phổ biến TSG (2,3,5,4′-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside) là một hợp chất được chiết xuất từ các dược liệu này.

Hà thủ ô là một chất chống oxy hóa hiệu quả, có khả năng ức chế quá trình apoptosis và bảo vệ tế bào thần kinh, được ứng dụng trong điều trị và phòng ngừa bệnh Alzheimer, Parkinson, cũng như tổn thương do thiếu máu cục bộ Tam thất (Notoginsengnosides) đã được chứng minh là có tác dụng tăng cường tổng hợp t-PA và giảm hoạt động PAI-1 trong tế bào nội mô, hỗ trợ điều trị các bệnh lý nhồi máu não và nhồi máu cơ tim Năm 1991, Mihara et al phát hiện giun đất thuộc họ Lumbricidae có khả năng phân giải fibrin và kích hoạt plasminogen Enzyme tiêu sợi huyết từ giun đất giúp làm giảm độ nhớt máu, giảm kết tập tiểu cầu và thúc đẩy quá trình tan huyết khối.

Ginkgo biloba là một loại thuốc cổ truyền đã được sử dụng trong nhiều thế kỷ để điều trị các rối loạn khác nhau Chiết xuất Ginkgo biloba (EGb), cụ thể là EGb761, chứa các flavone glycoside và terpenoide, đã được chứng minh có tác dụng tích cực trong việc điều trị nhồi máu não nhờ vào khả năng chống oxy hóa của nó Nghiên cứu cho thấy EGb761 có khả năng tăng cường các chất chống oxy hóa như glutathione và superoxide dismutase, đồng thời giảm các sản phẩm của quá trình oxy hóa như malondialdehyde và nitric oxide ở mô hình chuột bị tắc mạch não giữa.

Tiêu đề	Nghiên cứu độc tính cấp, bán trường diễn và tác dụng tân tạo mạch máu não của bài thuốc “Thông mạch Vintong” trên động vật thực nghiệm
Tác giả	Nguyễn Thị Bảo An
Người hướng dẫn	TS. Nguyễn Duy Tuân, PGS.TS. Đậu Xuân Cảnh
Trường học	Học viện y dược học cổ truyền Việt Nam
Chuyên ngành	Y học cổ truyền
Thể loại	luận văn thạc sỹ y học
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	86
Dung lượng	1,02 MB