bình tăng sinh AOB
Tính cấp thiết của đề tài
Việt Nam, với danh hiệu “Rừng vàng - Biển bạc”, sở hữu sự phong phú và đa dạng về tài nguyên thiên nhiên Bờ biển dài hàng ngàn km từ Bắc vào Nam mang lại nguồn tài nguyên biển phong phú, đặc biệt là nguồn lợi thủy hải sản Điều này đã thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp đánh bắt và chế biến thủy hải sản tại các tỉnh ven biển và các thành phố lớn trong nước.
Ngành công nghiệp chế biến thủy sản ở Việt Nam đã có những bước phát triển mạnh mẽ, đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy nền kinh tế và tạo ra nhiều việc làm cho người dân Tuy nhiên, nhiều công ty và nhà máy chế biến thủy sản vẫn chưa đầu tư vào hệ thống xử lý nước thải, dẫn đến việc xả thải lớn ra môi trường, gây ô nhiễm nghiêm trọng, đặc biệt là ô nhiễm nguồn nước.
Nước thải chế biến thủy sản chứa hàm lượng hữu cơ cao, đặc biệt là các chất hữu cơ có chứa nitơ, gây ô nhiễm nguồn nước và ảnh hưởng đến sức khỏe con người Để khắc phục tình trạng này, nhiều biện pháp xử lý đã được áp dụng, trong đó phương pháp sinh học là phổ biến nhất Phương pháp này bổ sung vi sinh vật phân lập từ bên ngoài vào hệ thống xử lý nhằm tăng cường hiệu quả xử lý nước thải Chúng tôi đã chọn đề tài “Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt động của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS” để nghiên cứu khả năng xử lý nitơ từ nước thải chế biến thủy sản, với mục tiêu phát triển chế phẩm sinh học nhằm nâng cao hiệu quả xử lý và loại bỏ hoàn toàn chất thải nitơ trước khi thải ra môi trường.
Tình hình nghiên cứu
Việc phân lập vi khuẩn nitrate hóa trong môi trường nuôi cấy thuần khiết lần đầu tiên được Winogradsky thực hiện thành công vào năm 1890 Thành công này diễn ra trước khi quá trình nitrate hóa được phát hiện là do các sinh vật sống thực hiện, theo nghiên cứu của Schloesing và Muntz vào năm 1877, cùng với những nỗ lực của Frankland và các cộng sự.
(1890) để phân lập những sinh vật ấy bằng những phương pháp vi khuẩn học thường dùng đã gặp thất bại
Năm 1950, Jane Meiklejohn đã cải tiến phương pháp của Winogradsky để phân lập thành công chủng Nitrosomonas europaea từ nuôi cấy thuần khiết Trong nghiên cứu này, bà cũng xác định được môi trường tối ưu với các vi lượng cần thiết, giúp duy trì hoạt tính của các chủng vi khuẩn nitrate hóa qua nhiều lần cấy chuyển mà không làm mất hoạt tính ban đầu.
Vào năm 1960, Watson và nhóm của ông đã khởi đầu một kỷ nguyên mới trong việc phân lập và nuôi cấy vi khuẩn, phát hiện và đặt tên cho hơn 16 chủng vi khuẩn oxy hóa NH3 khác nhau.
Năm 1968, S.Soriano và N.Walker đã thành công trong việc phân lập và tinh sạch Nitrosomonas và Nitrosocystis spp bằng cách sử dụng môi trường agar tinh chế, cùng với phương pháp thu nhận tập đoàn bằng pipet mao quản thủy tinh, được hỗ trợ bởi máy vi thao tác đơn mà Soriano đã mô tả vào năm 1935.
- Trần Liên Hà, Phạm Tuấn Anh, Nguyễn Thị Thanh (2007) đã phân lập được 4 chủng vi khuẩn nitrate hóa ứng dụng vào xử lý nước hồ bị ô nhiễm [1]
- Hoàng Phương Hòa, Trần Văn Nhị, Phạm Việt Cường, Nguyễn Thị Kim Cúc
(2008) đã phân lập được 6 chủng vi khuẩn nitrate hóa từ nước lợ nuôi tôm và ứng dụng xử lý nitơ trong ao nước nuôi tôm [2]
Mục đích nghiên cứu
- Tìm hiểu khả năng tăng sinh phân lập và đánh giá hoạt lực của vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS.
Nhiệm vụ nghiên cứu
- Tìm hiểu khả năng tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn AOB và NOB có nguồn gốc từ nước thải CBTS
- Đánh giá hoạt lực của các chủng vi khuẩn AOB và NOB phân lập được trên môi trường nuôi cấy tương ứng của chúng.
Phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp thu nhận và bảo quản mẫu nước thải
- Phương pháp phân lập vi khuẩn nitrate hóa
- Phương pháp thử nghiệm định tính
- Phương pháp xác định đặc điểm hình thái vi khuẩn phân lập
- Phương pháp định lượng NH4 + - NO2 - và NO3 - trong môi trường nuôi cấy.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm
- Đề tài được thực hiện từ: 21/4 đến 21/7 năm 2012
- Địa điểm lấy mẫu nước thải: “Công ty CP Th ủ y s ả n s ố 4” , 320 Hưng Phú, P.9,
- Đồ án được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ TP.Hồ Chí Minh.
Vật liệu – Hóa chất – Dụng cụ & thiết bị
- Mẫu nước thải được lấy từ: “Công ty CP Th ủ y s ả n s ố 4” , 320 Hưng Phú, P.9, Q.8, TP.HCM
2.2.2.1 Thành phần môi trường phân lập, nuôi cấy:
- Môi trường Winogradsky phân lập Nitrosomonas spp (W1):[3]
- Môi trường phân lập Nitrobacter spp (W2):[3]
- Môi trường tăng trưởng muối khoáng AOB (giàu vi lượng):[6]
Dung dịch khoáng vi lượng 1ml/l
- Dung dịch khoáng vi lượng bổ sung vào môi trường AOB:[6]
- Môi trường muối khoáng NOB (giàu vi lượng):[9]
Gồm có 900ml nước cất 100ml dung dịch gốc 1ml dung dịch vi lượng 2g NaNO2
- Môi trường hữu cơ kiểm tra sự nhiễm vi khuẩn dị dưỡng hay nấm:[6]
2.2.2.2 Các loại hóa chất sử dụng trong thí nghiệm:
- Thuốc thử dùng định tính: Griess A & Griess B, Nessler, Diphenylamine.[3]
- Thuốc nhuộm gram: Tím Gentian Violet, dung dịch Lugol, cồn 96 o , Fuchsin, dầu soi kính [8]
- Thuốc nhuộm tiên mao: dung dịch A, dung dịch B [22]
- Các hóa chất dùng định lượng NH4 +, NO2 - và NO3 - [4, 7]
Cốc thủy tinh: 100ml, 250ml, 1000ml
Bình tam giác: 100ml, 250ml, 500ml, 1000ml
Pipet các loại: 1ml, 2ml, 5ml, 10ml, 20ml, 25ml
Bóp cao su Đũa thủy tinh Ống nghiệm
Giá đỡ ống nghiệm Đĩa petri: đĩa thủy tinh và đĩa nhựa
Kính hiển vi quang học
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
- Tăng sinh, phân lập các chủng vi khuẩn AOB và NOB từ nguồn nước thải chế biến thủy sản
Sau khi tăng sinh, các chủng AOB sẽ được định tính và định lượng để kiểm tra khả năng chuyển hóa cơ chất của quần thể vi sinh vật trong môi trường Tiếp theo, môi trường sẽ được thay mới để tiếp tục quá trình tăng sinh.
Các chủng NOB đã được phân lập và tiến hành định danh sơ bộ dựa trên hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, nhuộm tiên mao và kiểm tra khả năng di động của chúng.
- Từ các chủng NOB đã phân lập được tiến hành các thử nghiệm khảo sát khả năng chuyển hóa cơ chất của chúng trên môi trường lỏng W2
Chọn lựa các chủng NOB có khả năng chuyển hóa cơ chất mạnh nhất là bước quan trọng để tiến hành khảo sát trong môi trường chứa nhiều thành phần khoáng vi lượng NOB.
2.3.2 Ph ươ ng pháp thu nh ậ n và v ậ n chuy ể n m ẫ u n ướ c th ả i:
Do thời gian thực hiện đề tài hạn chế và điều kiện lấy mẫu khó khăn, sinh viên chỉ tập trung vào việc phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa từ mẫu nước thải chế biến thủy sản được thu thập tại "Công ty CP Thủy sản số 4".
Mẫu nước thải được lấy từ bể tập trung của Công ty CP Thủy sản số 4, cho vào can nhựa 2L đã rửa sạch, không đầy quá (còn khoảng 5 – 10cm không khí phía trên) Mẫu được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 1 giờ bằng xe máy và tiến hành phân lập trong vòng 24 giờ.
2.3.3 Ph ươ ng pháp phân l ậ p:[3]
Phân lập là quá trình tách riêng vi sinh vật từ mẫu hoặc quần thể ban đầu nhằm thu nhận giống thuần khiết Giống vi sinh vật thuần khiết chỉ chứa các tế bào phát sinh từ một tế bào ban đầu.
- Cách th ự c hi ệ n: ắ Phõn l ậ p l ầ n th ứ I trờn c ả 2 mụi tr ườ ng W1 và W2: Mẫu nước thải chế biến thủy
Để phân lập mẫu nước thải, ta thực hiện pha loãng bằng cách cho 1ml mẫu vào ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý vô trùng, tạo ra nồng độ 10^-1 Tiếp tục, từ nồng độ 10^-1, hút 1ml vào ống nghiệm khác với 9ml nước muối sinh lý, tạo nồng độ 10^-2, và lặp lại quy trình này để có nồng độ 10^-3 và 10^-4 Chọn hai nồng độ 10^-2 và 10^-4, sử dụng pipet vô trùng để hút 1ml mẫu vào 4 bình tam giác 100ml đã chứa 30ml môi trường W1 và 4 bình khác với 30ml môi trường W2 Như vậy, ta có 4 bình mẫu ở nồng độ 10^-2, 4 bình mẫu ở nồng độ 10^-4 và 2 bình đối chứng tương ứng với hai môi trường phân lập W1 và W2 Cuối cùng, lắc 10 bình mẫu trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
Mẫu nước thải chế biến thủy sản được pha loãng bằng cách lấy 1ml mẫu cho vào 9ml nước muối sinh lý vô trùng, tạo nồng độ 10^-1 Tiếp tục hút 1ml từ nồng độ 10^-1 cho vào 9ml nước muối sinh lý khác để có nồng độ 10^-2, và lặp lại quy trình để đạt nồng độ 10^-3 và 10^-4 Chọn các nồng độ 10^-2 và 10^-4 để phân lập mẫu, sử dụng pipet vô trùng để chuyển 1ml mẫu vào 4 bình tam giác 100ml chứa 30ml môi trường W1 Toàn bộ bình được bọc kín bằng bao nilon đen, chỉ để hở phần miệng, nhằm tạo điều kiện tối ưu cho quá trình ủ mẫu trong 2-3 tuần ở nhiệt độ 28 ± 2°C Tương tự, trong phần phân lập lần III trên môi trường AOB, mẫu nước thải cũng được pha loãng theo quy trình giống như trên, và 1ml mẫu được cho vào 10 bình tam giác 100ml chứa 30ml môi trường AOB, với các nồng độ 10^-0, 10^-1, 10^-2 và 10^-3 được chọn để phân lập.
Chúng tôi đã chuẩn bị 2 bình mẫu 10-2, 2 bình mẫu 10-3 và 1 bình ĐC, sau đó bọc kín toàn bộ bình tam giác bằng nilon đen, chỉ để hở phần miệng bình Điều này giúp tối ưu hóa quá trình ủ mẫu Cuối cùng, chúng tôi lắc 11 bình mẫu trên máy lắc với tốc độ 210 vòng/phút, ở nhiệt độ phòng (28 ± 2 °C), trong khoảng thời gian 2-3 tuần.
2.3.4 Ph ươ ng pháp đị nh tính môi tr ườ ng nuôi c ấ y:[3]
Phương pháp định tính môi trường nuôi cấy được sử dụng để kiểm tra nhanh sự hiện diện của vi sinh vật cần phân lập Bằng cách áp dụng các loại thuốc thử phù hợp với từng mục đích phân lập, chúng ta có thể xác định hiệu quả của môi trường nuôi cấy trong nghiên cứu vi sinh.
Sau 2 đến 3 tuần ủ và lắc mẫu trên máy lắc: ta thấy môi trường trong các bình mẫu thí nghiệm chuyển sang đục (có sinh khối vi sinh vật phát triển) hơn so với môi trường trong bình ĐC (không cấy mẫu nước thải vào) thì ta tiến hành lấy mẫu để thực hiện các phản ứng định tính và kiểm tra các thành phần trong canh trường nuôi cấy của chúng ta như sau:
Để thực hiện phản ứng định tính amoni (NH4+), sử dụng pipet vô trùng để lấy một giọt canh trường từ bình nuôi cấy và cho lên lam kính sạch Lặp lại quy trình này cho mẫu đối chứng âm và dương Sau đó, nhỏ một giọt thuốc thử Nessler lên giọt canh trường Nếu giọt canh trường xuất hiện màu vàng kèm theo kết tủa nâu, thì kết quả là dương tính (+) Ngược lại, nếu giọt canh trường không chuyển màu, thì kết quả là âm tính (-) với thuốc thử Nessler.
Phản ứng định tính nitrite (NO2-) được thực hiện bằng cách sử dụng pipet vô trùng để lấy một giọt canh trường từ bình nuôi cấy và cho lên lam kính sạch, tương tự cho mẫu ĐC âm và mẫu ĐC dương Sau đó, nhỏ lần lượt từng giọt thuốc thử Griess A và Griess B lên giọt canh trường nuôi cấy Nếu giọt canh trường xuất hiện màu hồng, đó là phản ứng dương tính (+); ngược lại, nếu giọt canh trường không chuyển màu, tức là phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Griess A và Griess B.
Phản ứng định tính nitrate (NO3-) được thực hiện bằng cách sử dụng pipet vô trùng để lấy một giọt canh trường từ bình mẫu nuôi cấy và cho lên lam kính sạch Quy trình này cũng được thực hiện cho mẫu đối chứng âm và đối chứng dương Sau đó, nhỏ một giọt thuốc thử Diphenylamine lên giọt canh trường nuôi cấy Nếu giọt canh trường xuất hiện màu xanh dương, đó là phản ứng dương tính (+), trong khi giọt canh trường không chuyển màu cho thấy phản ứng âm tính (-) với thuốc thử Diphenylamine.
B ả ng 2.1: C ườ ng độ màu c ủ a NH 4 + - NO 2 - & NO 3 - v ớ i thu ố c th ử t ươ ng ứ ng trong ph ả n ứ ng đị nh tính
Phản ứng định tính của amoni (NH4 +) với thuốc thử
Màu vàng sậm -NH4 + trung bình
Màu nâu - rất nhiều NH4 +
Phản ứng định tính của nitrite (NO2 -) với thuốc thử
Màu hồng rất sậm - rất nhiều
Phản ứng định tính của nitrate (NO3 -) với thuốc thử
Màu xanh dương nhạt - ít
Màu xanh dương đậm vừa - NO3 - trung bình
Màu xanh dương thẫm - rất nhiều NO3 -
2.3.5 Ph ươ ng pháp xác đị nh đặ c đ i ể m hình thái vi khu ẩ n phân l ậ p:
Việc xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn phân lập là bước quan trọng để định danh sơ bộ và hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo Các đặc điểm hình thái này được xác định thông qua những phương pháp phổ biến.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrite hóa của AOB từ nước thải nhà máy chế biến thủy sản (CBTS)
- Nước thải “Công ty CP thủy sản số 4” được pha loãng theo các nồng độ 10 -2 và 10 -
4, tăng sinh trong môi trường W1 trên máy lắc 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 2 o C)
3.1.1.1 Kết quả thử nghiệm định tính:
Sau 2-3 tuần lắc mẫu, môi trường tăng sinh trở nên đục do sự phát triển mạnh mẽ của sinh khối vi sinh vật, vượt trội hơn so với bình đối chứng chỉ chứa môi trường không cấy mẫu nước thải Để đánh giá sơ bộ, các bình tăng sinh đã được thử nghiệm định tính để xác định sự hiện diện của AOB và NOB, với các phép thử dựa trên màu hồng đặc trưng của NO2 khi phản ứng với thuốc thử Griess và màu xanh dương của NO3 khi sử dụng Diphenylamine.
Khi H2SO4 đậm đặc và NH4+ phản ứng với thuốc thử Nessler, màu vàng nâu xuất hiện với mức độ đậm nhạt tương ứng với nồng độ các chất cần kiểm tra Mức độ này được phân thành bốn loại: âm tính (-), dương tính yếu (+), dương tính trung bình (++) và dương tính mạnh (+++), như đã trình bày trong phần phương pháp và phụ lục A.
B ả ng 3.1: Th ử nghi ệ m đị nh tính m ẫ u t ă ng sinh AOB trong môi tr ườ ng W1 t ừ n ướ c th ả i
STT Tên bình Độ đục Định tính NH 4 + Định tính NO 2 - ĐC Đố i ch ứ ng - + + + -
Kết quả định tính cho thấy sự giảm nồng độ NH4+ và sự xuất hiện của NO2- ở tất cả các bình nuôi cấy Khi hệ số pha loãng thấp (10-2), nồng độ NO2- tăng cao (+++), điều này chứng minh rằng nước thải của “Công ty CP thủy sản số 4” chứa AOB.
Sau khi tăng sinh vi khuẩn AOB, chúng tôi đã phân lập chủng thuần khiết bằng phương pháp cấy ria trên môi trường W1 agar Mặc dù lý thuyết cho rằng vi khuẩn AOB có thời gian thế hệ từ 8-36 giờ và tăng trưởng rất chậm, nhưng các chủng phân lập lại phát triển nhanh chóng, với hình thái được trình bày trong bảng 3.2 (xem thêm phụ lục B).
B ả ng 3.2: Đặ c đ i ể m hình thái c ủ a 4 ch ủ ng vi khu ẩ n phân l ậ p đượ c trên W1
Tên chủng Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào Gram
Chủng 1 Màu vàng đậm – hơi bóng – lồi
Chủng 2 Màu vàng đậm – nhăn – không bóng – lồi
Cầu khuẩn – nhỏ li ti -
Chủng 3 Màu cam nhạt đục sữa – tròn – bóng – lồi
Chủng 4 Màu trắng đục – bóng – lồi
Sau khi lựa chọn 4 chủng vi khuẩn thuần khiết từ môi trường thạch, chúng tôi đã cấy chuyển chúng sang môi trường W1 lỏng để tăng sinh và kiểm tra hoạt tính Quá trình nuôi cấy được thực hiện trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 ± 2 °C) Sau 24 giờ, khi môi trường nuôi cấy chuyển từ trong sang đục do sự phát triển của vi sinh vật, hoạt tính nitrite hóa được kiểm tra bằng thử nghiệm định tính Kết quả cho thấy cả 4 chủng vi khuẩn phân lập đều không có hoạt tính.
3.1.1.3 Kết quả khảo sát khả năng mọc của 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa trên môi trường agar hữu cơ:
Do kết quả định tính cho thấy 4 chủng vi khuẩn nitrite hóa phân lập không có hoạt tính, chúng tôi nghi ngờ rằng chúng không phải là vi khuẩn nitrite hóa mà là các chủng vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành cấy chuyển 4 chủng vi khuẩn nghi ngờ này sang môi trường hữu cơ agar để khảo sát khả năng mọc của chúng.
Tất cả 4 chủng W1 phân lập đều phát triển tốt trên môi trường agar dinh dưỡng hữu cơ sau 48 giờ ở nhiệt độ phòng (28 ± 2 °C), cho thấy chúng là vi khuẩn dị dưỡng hóa năng hữu cơ, không phải vi khuẩn nitrite hóa, nên đã bị loại bỏ Kết quả nghiên cứu cho thấy việc phân lập các AOB gặp khó khăn do tốc độ tăng trưởng chậm, dẫn đến khó khăn trong việc thuần hóa chủng Agar tinh khiết hoặc thạch silica gel khó đạt được trong điều kiện nghiên cứu của chúng tôi, do đó, chúng tôi đã thay đổi cách tiếp cận Theo lý thuyết, để sản xuất chế phẩm sinh học xử lý ô nhiễm, cần phân lập vi sinh từ nguồn ô nhiễm, thuần hóa và nghiên cứu hoạt tính Tuy nhiên, với AOB là vi khuẩn dinh dưỡng hóa năng vô cơ, việc này gặp nhiều khó khăn Hơn nữa, ứng dụng chúng trong xử lý nước thải chủ yếu dựa vào hoạt tính quần thể hơn là hoạt tính cá thể, vì vậy chúng tôi đã chuyển mục tiêu từ “phân lập” sang “tăng sinh” vi khuẩn AOB để có đủ khối lượng cho các thí nghiệm xử lý nước thải sau này.
3.1.2 T ă ng sinh phân l ậ p AOB l ầ n II:
Để đảm bảo thành công trong việc tăng sinh AOB, cần tuân thủ nghiêm ngặt các yêu cầu về oxy hòa tan (2.0 – 3.0 mgO2/L), pH (7.2 – 8.0), và tránh ánh sáng Kết quả khảo sát cho thấy ở vận tốc lắc 150 vòng/phút, oxy hòa tan đạt 1.9 mg/L, trong khi ở 210 vòng/phút, DO đạt 3.75 mg/L, do đó, lựa chọn vận tốc lắc 210 vòng/phút là hợp lý Sau hơn 2 tuần lắc mẫu ở nhiệt độ 28°C, thử nghiệm định tính cho kết quả âm tính ở toàn bộ mẫu tăng sinh Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng việc bổ sung khoáng vi lượng thích hợp là cần thiết để phân lập AOB và duy trì hoạt tính nitrite hóa, từ đó, tăng sinh lần 3 được tiến hành.
3.1.3 T ă ng sinh phân l ậ p AOB l ầ n III:
Mẫu nước thải được thu thập từ Công ty CP Thủy sản số 4 và được đưa về phòng thí nghiệm để tiến hành tăng sinh ngay trên môi trường AOB mà không cần pha loãng Ngoài ra, mẫu cũng được pha loãng theo dãy thập phân đến 10^-3 và tăng sinh trong môi trường AOB theo phương pháp của Verhagen và Laanbroek (1991) với nồng độ N-.
Nồng độ NH4 + trong môi trường W1 được duy trì ở mức 583 mg/L, trong khi mẫu đối chứng là môi trường không có giống từ nước thải Các điều kiện thí nghiệm được đảm bảo với tốc độ lắc 210 vòng/phút, nhiệt độ phòng 28 ± 2 oC, pH 7.8, và sử dụng bao nilon đen để che kín bình, nhằm tránh ánh sáng.
3.1.3.1 Kết quả thử nghiệm định tính:
- Sau 18 ngày tăng sinh, thử nghiệm định tính mẫu tăng sinh trên môi trường AOB cho kết quả được trình bày trong bảng 3.3 như sau:
B ả ng 3.3: Hàm l ượ ng NH 4 + - NO 2 - & NO 3 - qua “Th ử nghi ệ m đị nh tính” 10 bình m ẫ u nuôi c ấ y AOB
Bình mẫu Hệ số pha loãng Độ đục Định tính các dạng ion chứa nitơ trong môi trường nuôi cấy AOB
NH 4 + (còn dư) NO 2 - (sinh ra) NO 3 - (sinh ra)
Bình 10 -3 (2) 1000 + + + + - - ắ Tất cả 10 bỡnh mẫu tăng sinh trờn mụi trường AOB đó cú hoạt tớnh nitrite húa thể hiện qua độ đục môi trường tăng, lượng nitrite tăng so với nước thải ban đầu (âm tính nitrite, âm tính nitrate) Độ pha loãng càng nhỏ thì hoạt tính thể hiện càng mạnh qua sự nhạt màu với thuốc thử Nessler, sự tăng sậm màu với thuốc thử Griess Pha loãng 1000 lần nước thải rồi mới cấy vào bình tăng sinh làm mật độ quần thể vi sinh vật AOB quá thấp dẫn đến không phát hiện được hoạt động bằng phép thử định tính ắ Vỡ thời gian lắc mẫu dài (hơn 2 tuần) nờn vi sinh vật NOB (nitrate húa) cú trong nước thải đã chuyển hóa một phần nitrite thành nitrate bắt màu xanh dương với thuốc thử Diphenylamine (Bảng 3.3 và Phụ lục F) ắ Một số ngoại lệ là bỡnh 10 o (4), 10 -1 (1), 10 -2 (1) cú hệ số pha loóng 0, 10 và 100 lần nhưng cũng không thể hiện hoạt động hoặc yếu qua phép thử định tính (rất ít NO2 - và NO3 - xuất hiện sau thời gian nuôi cấy), điều này chứng tỏ khi môi trường tăng sinh như nhau, nguồn vi sinh vật như nhau nhưng các yếu tố kiểm soát khi tăng sinh không bảo đảm (do ngẫu nhiên) có thể dẫn đến thất bại trong tăng sinh AOB
3.1.3.2 Kết quả định lượng hàm lượng NH 4 + - NO 2 - & NO 3 - có trong 10 bình nuôi cấy AOB
Để xác định khả năng chuyển hóa cơ chất của quần thể vi khuẩn nitrate hóa trong 10 mẫu phân lập AOB, chúng tôi đã tiến hành lấy mẫu và định lượng hàm lượng ba chỉ tiêu NH4+, NO2- và NO3- có trong mỗi bình mẫu Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
B ả ng 3.4: Hàm l ượ ng NH 4 + - NO 2 - & NO 3 - trong 10 bình m ẫ u và hi ệ u qu ả chuy ể n hóa c ơ ch ấ t
Bình mẫu Nồng độ (mg/l) Hiệu quả xử lý N – Amoni (%) a
Bình 10 -3 (2) 279.8 0 0 49.5 0 aHiệu quả xử lý NH4 + (%) (N-amoniĐC N-amoniTN)/N-amoniĐC*100 bHiệu quả nitrate hóa (%) (N-nitriteTN N-nitrateTN)/N-amoniĐC*100
Hình 3.1: N ồ ng độ các d ạ ng nit ơ NH 4 + - NO 2 - & NO 3 - trong 11 bình t ă ng sinh AOB
Hình 3.2 trình bày hiệu quả xử lý N-Amoni và hiệu quả nitrate hóa của các quần thể vi sinh vật trong 10 bình tăng sinh AOB Kết quả định lượng không mâu thuẫn với kết quả định tính, cho phép chúng tôi tính toán và rút ra kết luận về hiệu quả chuyển hóa cơ chất của các quần thể vi sinh vật.
Bìn h Đ C Bìn h 10o (1 ) Bìn h 10o (2 ) Bìn h 10o (3 ) Bìn h 10o (4 ) Bìn h 10 ‐ 1( 1) Bìn h 10 ‐ 1 (2 ) Bìn h 10 ‐ 2 (1 ) Bìn h 10 ‐ 2 (2 ) Bìn h 10 ‐ 3 (1 ) Bìn h 10 ‐ 3 (2 ) mg/L
Nồng độ các dạng nitơ trong các bình tăng sinh VSV từ nước thải CBTS
Bìn h Đ C Bìn h 10o (1 ) Bìn h 10o (2 ) Bìn h 10o (3 ) Bìn h 10o (4 ) Bìn h 10 ‐ 1( 1) Bìn h 10 ‐ 1 (2 ) Bìn h 10 ‐ 2 (1 ) Bìn h 10 ‐ 2 (2 ) Bìn h 10 ‐ 3 (1 ) Bìn h 10 ‐ 3 (2 )
Hiệu quả nitrate hóa của quần thể VSV từ nước thải CBTS
Hiệu quả xử lý N-ammonium cho thấy quá trình nitrate hóa ở các bình 10 o (1), 10 o (2), 10 o (3), 10 -1 (2) và 10 -2 (2) tương ứng với nước thải không pha loãng, pha loãng 10 và 100 lần, với tỉ lệ cấy giống nhau vào môi trường là 1/30 Trong điều kiện tối ưu, nồng độ N-Amoni gần như đã giảm hầu hết sau 18 ngày nuôi cấy.
Nồng độ chất ô nhiễm trong mẫu nước đã giảm từ 583 mg/L xuống khoảng 10 mg/L, trong khi nồng độ nitrite tăng rõ rệt từ 0 lên 186.9 mg/L, với một phần nhỏ chuyển hóa thành nitrate nhưng không vượt quá 23 mg/L Đối với các mẫu pha loãng 10^-2 (1), 10^-3 (1) và 10^-3 (2), nồng độ N-amoni còn lại không dưới 254 mg/L, trong khi nitrite và nitrate chưa được hình thành Hiệu quả xử lý nước thải đã được ghi nhận rõ rệt.
Kết quả tăng sinh phân lập và khảo sát hoạt lực nitrate hóa của các chủng NOB có nguồn gốc từ nhà máy chế biến thủy sản (CBTS)
Trong nghiên cứu này, bên cạnh việc tăng sinh phân lập AOB, vi khuẩn nitrate hóa NOB cũng đã được phân lập thành công lần đầu tiên trên môi trường W2 theo mô tả trong giáo trình của Egorov Để thực hiện, nước thải được pha loãng 100 lần và 10.000 lần, sau đó được cấy vào môi trường W2 và lắc trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút ở nhiệt độ phòng (28 ± 2 °C).
Sau hai tuần tăng sinh, chúng tôi tiến hành thử nghiệm định tính nhưng phát hiện hóa chất NaNO2 (ion nitrite trong môi trường W2) bị nhiễm nitrate, dẫn đến kết quả không tin cậy Thay vào đó, chúng tôi thực hiện phân tích định lượng nitrite và nitrate để đánh giá khả năng chuyển hóa cơ chất của các quần thể vi sinh vật trong nước thải Đầu tiên, chúng tôi phân lập các chủng vi khuẩn thuần khiết từ bốn bình nuôi cấy, sau đó kiểm tra khả năng chuyển hóa của những chủng vi khuẩn này.
Sau khi kiểm tra 4 bình nuôi cấy, trong đó có 2 bình 10-2 và 2 bình 10-4, chúng tôi phát hiện dịch nuôi cấy dương tính với thuốc thử Diphenylamine và hàm lượng NO2- giảm với thuốc thử Griess A & Griess B Tiếp theo, chúng tôi tiến hành thu thập sinh khối từ các bình nuôi cấy và cấy trên môi trường thạch W2 agar để phân lập các chủng vi khuẩn nitrate hóa Qua quá trình chọn lựa dựa trên đặc điểm hình thái khuẩn lạc, chúng tôi đã thuần khiết được 6 chủng vi khuẩn nghi ngờ là các chủng vi khuẩn nitrate hóa với các đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào rõ ràng.
(Bảng 3.6 và Hình 3.3; xem thêm phụ lục I, J)
B ả ng 3.6: T ổ ng k ế t các ch ủ ng vi khu ẩ n nitrate hóa phân l ậ p đượ c trên môi tr ườ ng W2
Tên chủng Hình thái khuẩn lạc
Gram Hình thái tế bào
Mẫu 1 Màu trắng đục sữa – bóng – lồi
Mẫu MV1 Màu vàng – tròn - lồi – bóng – ướt
Hình 3.3: Các m ẫ u vi khu ẩ n phân l ậ p trên th ạ ch W2 a) M ẫ u 1, b) M ẫ u 2, c) M ẫ u 3, d)
3.2.1.3 Khảo sát khả năng chuyển hóa của 6 mẫu vi khuẩn phân lập được trên môi trường lỏng W2:
Sáu mẫu vi khuẩn nitrate hóa đã được phân lập và nuôi cấy trong môi trường lỏng W2 Khả năng nitrate hóa của các mẫu này đã được khảo sát qua việc định lượng NO2- sau 2, 4 và 6 ngày.
NO3 - với kết qủa trình bày trên hình 3.4 và 3.5:
Hàm lượng N-nitrite trong môi trường W2 ban đầu là 180 mg/L, nhưng sau 2 ngày nuôi cấy, nồng độ này giảm nhanh xuống còn khoảng 60-80 mg/L cho các chủng 1, 2, 3, 5, 7, và 100 mg/L cho chủng MV1; sau đó, nồng độ N-nitrite không còn giảm nữa mà duy trì ổn định.
Hình 3.4: Bi ế n thiên N-nitrite trong môi tr ườ ng W2 khi c ấ y vi khu ẩ n phân l ậ p t ừ n ướ c th ả i CBTS
Hình 3.5: N ồ ng độ N-nitrate (mg/L) sinh ra trong môi tr ườ ng W2 khi c ấ y các ch ủ ng phân l ậ p
Trong môi trường W2, nồng độ N-nitrate trung bình là khoảng 14.5 mg/L, gây ra phản ứng dương tính với thuốc thử Diphenylamine ngay từ thời điểm ban đầu Sau khi trừ đi nồng độ N-nitrate ban đầu, nồng độ N-nitrate sinh ra được thể hiện trong hình 3.5.
Dựa vào nồng độ chuyển hóa N-nitrite và N-nitrate, hiệu quả chuyển hóa sau 6 ngày được trình bày trong bảng 3.7 Từ nước thải CBTS, đã phân lập được 6 mẫu, trong đó cho thấy hiệu quả chuyển hóa đáng kể.
Biến thiên N-nitrite trong môi trường W2 khi cấy vi khuẩn phân lập từ nước thải CBTS
Chủng 1 Chủng 2 Chủng 3 Chủng 5 Chủng 7 Chủng MV1
Nồng độ N-nitrate sinh ra trong môi trường
Chủng 1Chủng 2Chủng 3Chủng 5Chủng 7Chủng MV1 theo các nghiên cứu trước đó có 3 dạng, dạng tự dưỡng (autotrophic), dạng dị dưỡng (heterotrophic) và dạng hỗn hợp (mixotrophic) (Spieck E và Lipski A, 2011), tuy nhiên thời gian thế hệ còn dài hơn AOB, có thể kéo dài đến 60 giờ Vì vậy, việc thu được vi khuẩn này trên bề mặt thạch là có thể nhưng không tránh khỏi tạp nhiễm Mặc dù có kết quả quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào như trình bày phần trên nhưng kết luận đó là các chủng NOB là quá vội vã Trên thực tế không thể nhìn thấy các vi khuẩn lạc riêng rẽ của AOB và NOB bằng mắt thường Các NOB như Nitrospira chỉ có thể tách khỏi vi khuẩn tạp nhiễm bằng phương pháp ly tâm phân đoạn theo Percoll (Percoll gradient centrifugation) kèm theo pha loãng nhiều lần (Speck E và Bock E., 2005) [19]
B ả ng 3.7: Hi ệ u qu ả chuy ể n hóa nitrite và nitrate hóa sau 6 ngày t ă ng sinh
Hiệu quả chuyển hóa nitrite (%)
Hiệu quả nitrate hóa (%) ĐC 0 0
3.2.1.4 Khảo sát khả năng chuyển hóa của các quần thể NOB trong thí nghiệm tăng sinh trên môi trường lỏng NOB (1g NaNO 2 /l):
Các quần thể vi khuẩn tiếp tục được tăng sinh trong môi trường chứa nitrite như nguồn năng lượng, nhằm duy trì hoạt tính của NOB Môi trường NOB được phát triển dựa trên công thức của Bock (1983) (Spieck E và Lipski A, 2011) Kết quả cho thấy các quần thể trong Mẫu 2, 3 và MV1 có hiệu quả nitrate hóa cao hơn so với các mẫu còn lại khi được đưa vào môi trường NOB Hình 3.6 minh họa tốc độ chuyển hóa này.
Hình 3.6: Bi ể u đồ th ể hi ệ n kh ả n ă ng chuy ể n hóa N – Nitrite c ủ a 3 m ẫ u trong su ố t th ờ i gian kh ả o sát
So với thí nghiệm tăng sinh trên môi trường W2, tốc độ chuyển hóa lần này chậm hơn, với N-nitrite giảm đến 8 ngày sau đó ít biến đổi Biên độ N-nitrite giảm từ gần 200 mg/L xuống khoảng 100 mg/L, đạt hiệu quả biến đổi cao nhất xấp xỉ 50% (Hình 3.6).
Nồng độ nitrate tạo thành rất thấp, chỉ đạt tối đa 10 mg/L sau 12 ngày, thấp hơn so với môi trường W2 với 14.5 mg/L sau 6 ngày Hiệu quả nitrate hóa chỉ khoảng 5% sau 12 ngày Sự khác biệt này có thể do việc chuyển từ môi trường W2 sang môi trường NOB hoặc do không kiểm soát được nồng độ cấy giống do tạp nhiễm.
Hình 3.7: Bi ế n đổ i n ồ ng độ N – Nitrate t ạ o thành theo th ờ i gian kh ả o sát các m ẫ u phân l ậ p
0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày12 ngày
Biến đổi N-nitrite theo thời gian, mg/L
0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày
Biến đổi N-nitrate theo thời gian, mg/L
Trong nghiên cứu về chuyển hóa nitrite và nitrate, hiệu quả xử lý của NOB chỉ đạt khoảng 50%, thấp hơn nhiều so với AOB gần 100% Điều này cho thấy không nên cố gắng phân lập AOB và NOB để tạo chế phẩm sinh học cho xử lý nước thải giàu nitơ, mà thay vào đó cần tăng sinh chúng và loại bỏ vi sinh vật tạp nhiễm Để đạt được mục tiêu này, cần tuân thủ các điều kiện tăng trưởng như nguồn năng lượng, carbon, khoáng vi lượng, oxy hòa tan và pH NOB có thời gian thế hệ dài hơn AOB, lên đến 60 giờ, do đó cần tăng sinh khối NOB nhiều hơn để cải thiện hiệu quả chuyển hóa nitrite Bên cạnh đó, việc tìm ra tỷ lệ thích hợp giữa cơ chất và sinh khối cũng rất quan trọng Tuy nhiên, các phương pháp hiện tại để đo sinh khối vi khuẩn như đếm khuẩn lạc hay MPN đều gặp khó khăn trong việc áp dụng do dễ bị tạp nhiễm hoặc yêu cầu thời gian nuôi cấy dài, trong khi các phương pháp PCR và FISH lại vượt quá khả năng của phòng thí nghiệm Phương pháp microcolony cần thiết bị kính hiển vi và là một hướng đi tiềm năng cho nghiên cứu tiếp theo.
Hiệu quả chuyển hóa nitrite và nitrate hóa, %
Hiệu quả chuyển hóa nitrite, % Chủng 2
Hiệu quả chuyển hóa nitrite, % Chủng 3
Hiệu quả chuyển hóa nitrite, % MV1
Hiệu quả nitrate hóa, % Chủng 2
Hiệu quả nitrate hóa của chủng 3 và MV1 huỳnh quang cho thấy tiềm năng trong việc tối ưu hóa quá trình chuyển hóa Dựa trên kết quả thí nghiệm, chúng tôi khuyến nghị các nghiên cứu tiếp theo nên tập trung vào vận tốc chuyển hóa và sự gia tăng chất khô trong sinh khối.