1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr

54 27 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Quy Trình Chẩn Đoán Bệnh Viêm Gan Siêu Vi B Bằng Phương Pháp Real-Time Pcr
Tác giả Võ Thị Hải Yến
Trường học Trường Đại Học Kỹ Thuật Công Nghệ Tp. Hcm
Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học
Thể loại Khóa Luận Tốt Nghiệp
Năm xuất bản 2011
Thành phố Tp. Hồ Chí Minh
Định dạng
Số trang 54
Dung lượng 2,24 MB

Cấu trúc

  • CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU (9)
    • 1.1. Đại cương về bệnh viêm gan siêu vi B (9)
      • 1.1.1. Định nghĩa bệnh viêm gan siêu vi B (9)
      • 1.1.2. Lịch sử bệnh viêm gan siêu vi B (9)
    • 1.2. Đặc điểm sinh học của Hepatitis B Virus (10)
      • 1.2.1. Kích thước và cấu trúc của virus hoàn chỉnh (10)
      • 1.2.2. Cấu trúc bộ gen của HBV (0)
      • 1.2.3. Sự tái bản DNA (12)
      • 1.2.4. Các thành phần kháng nguyên (12)
      • 1.2.5. Cách thức tồn tại và khả năng gây bệnh (13)
    • 1.3. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới và Việt Nam (15)
      • 1.3.1. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trên thế giới (15)
      • 1.3.2. Tình hình bệnh viêm gan siêu vi B trong nước (16)
    • 1.4. Đường lây của HBV, triệu chứng lâm sàng, biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV (17)
      • 1.4.1. Đường lây của HBV (17)
      • 1.4.2. Triệu chứng lâm sàng (19)
      • 1.4.3. Biện pháp phòng ngừa và điều trị HBV (19)
    • 1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi B (21)
      • 1.5.1. Phương pháp huyết thanh học (phát hiện kháng thể) và hóa miễn dịch (phát hiện kháng nguyên) (21)
      • 1.5.2. Phương pháp sinh học phân tử (22)
  • CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP (40)
    • 2.1. Vật liệu thiết bị (40)
      • 2.1.1. Vật liệu sinh học (40)
      • 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ (40)
      • 2.1.3. Hóa chất (43)
    • 2.2. Phương pháp tiến hành (44)
      • 2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu (44)
      • 2.2.2. Phương pháp tách chiết (45)
      • 2.2.3. Phản ứng Real-time PCR (46)
  • CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN (48)
  • KẾT LUẬN (51)
  • TÀI LIỆU THAM KHẢO (52)

Nội dung

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu thiết bị

Mẫu thử nghiệm: mẫu huyết thanh

Máy Real-time PCR và hệ thống máy tính, phần mềm hỗ trợ

Hình 2.1 Máy ly tâm thu huyết thanh

Vật liệu tiêu hao: găng tay, khẩu trang, đầu tip có phin lọc, eppendorf

Hình 2.6 Máy ly tâm eppendorf 0.2ml

2.1.3 Hóa chất v Hóa chất cho tách chiết DNA:

- Dung dịch (1): Trizol gồm phenol 38%, guanidine thiocyanat 0.8M, glycerol 5%, pH 8.0

- Dung dịch (3): Isopropanol tuyệt đối có chứa chất trợ tủa

- Dung dịch (5): dung dịch TE 1X (Tris 0.1M - EDTA 0.001M) v Hóa chất trong Real-time PCR:

A Real-time PCR reaction mix of 25 µl consists of several key components: a 1X buffer solution, 200 µM dNTPs, 0.625 units of Taq DNA polymerase, 1.5 mM MgCl2, sterile distilled water, primers, and a probe.

- Mẫu chứng âm (nước cất), chứng dương (chứa virus HBV)

- Standard HBV (dùng xây dựng đường chuẩn)

+ Tube PCR mix chứa standard 10 2 copies + Tube PCR mix chứa standard 10 4 copies + Tube PCR mix chứa standard 10 6 copies

Phương pháp tiến hành

Hình 2.7 Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR

2.2.1 Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu

- Lấy máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất

- Máu chỉ giữ ở 4 - 8 o C trong tối đa 4 giờ, sau đó phải tách huyết thanh

- Lấy 3ml máu bệnh nhân cho vào ống nghiệm thu máu chuyên dụng

- Ly tâm ống nghiệm chứa máu 3000 vòng/phút trong 15 phút

- Thu khoảng 0.5ml huyết thanh chuyển vào tube 1.5ml vô trùng

- Giữ tube huyết thanh ở -20 o C cho đến khi tiến hành xét nghiệm

2.2.2 Phương pháp tách chiết v Nguyên tắc

Việc tách chiết DNA bao gồm các bước cơ bản sau: (1) phá màng tế bào,

Để thu nhận DNA tinh khiết, cần loại bỏ các thành phần tạp nhiễm, đặc biệt là protein Quá trình tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử nucleic acid và protein trong hai pha không hòa tan, bao gồm phenol, chloroform và nước.

Trong quy trình tách chiết, các hóa chất chính bao gồm phenol và guanidine thiocyanat có trong dung dịch Trizol, giúp biến tính protein và giải phóng DNA, RNA và protein từ tế bào Chloroform, thường được sử dụng cùng phenol, hỗ trợ loại bỏ hoàn toàn dấu vết phenol và cũng biến tính protein, nhưng với hiệu quả yếu hơn Sau khi ly tâm, mẫu sẽ phân tách thành hai lớp: lớp dưới chứa phenol và lớp trên là nước chứa DNA, trong khi protein biến tính nằm ở bề mặt giữa hai lớp và sẽ bị loại bỏ DNA trong lớp dịch nổi được thu nhận thông qua quá trình tủa với Isopropanol có chất trợ tủa, là polymer mạng lưới giúp bắt giữ DNA mà không ức chế phản ứng PCR Cuối cùng, tủa DNA sẽ được rửa bằng Ethanol 70% và bảo quản trong TE 1X.

Cho 200µl mẫu huyết thanh vào một ống eppendorf có sẵn 900µl dung dịch (1), vortex trong 30 giây và để yên trong 10 phút Tiếp theo, thêm 200µl dung dịch (2) và trộn đều Cuối cùng, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút để phá vỡ màng tế bào.

- Thu 600àl dịch nổi cú chứa DNA vào một eppendorf sạch khỏc cú sẵn 600àl dung dịch (3) Trộn đều, để yờn 10 phỳt Ly tõm

13000 vòng/phút trong 10 phút Đây là bước loại protein

- Loại bỏ dịch nổi (protein), thu cặn màu hồng (DNA) Cho từ từ 900àl dung dịch (4) vào Ly tõm 13000 vũng/phỳt trong 5 phỳt Với mục đích tủa DNA

- Loại bỏ hết dịch nổi, thu cặn Để khô ở 60 o C, 10 phút Cho vào 50àl dung dịch (5) Cuối cựng là bước tinh sạch, bảo quản

2.2.3 Phản ứng Real-time PCR

- Cho 5àl chứng +, chứng - hoặc dịch DNA tỏch chiết vào tube Real-time PCR mix

- Trước và sau khi đặt phản ứng PCR phải ly tâm tube để tất cả dung dịch nằm dưới đáy tube

- Đặt vào máy Real-time PCR cùng với một bộ standard

Để cài đặt chương trình định dạng vị trí các mẫu trong block nhiệt của máy Real-time PCR, bạn cần thiết lập chu kỳ như sau: 1 chu kỳ ở 95°C trong 5 giây và 40 chu kỳ với 95°C trong 15 giây, 60°C trong 1 phút (lưu ý chọn đọc kết quả tại bước này) Cuối cùng, hãy chọn chức năng chờ cho đến khi "Heat lid" đạt 105°C trước khi bắt đầu chương trình luân nhiệt.

Hình 2.8 Chu trình nhiệt của Real-time PCR

Ngày đăng: 11/07/2021, 17:45

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
[1] Hồ Huỳnh Thùy Dương. (2002). Sinh học phân tử (khái niệm-phương pháp-ứng dụng). NXB giáo dục Khác
[2] Nguyễn Hữu Chí. Chủng ngừa viêm gan siêu vi B. NXB TPHCM Khác
[3] Lê Thị Hòa. (2010). Xây dựng quy trình phát hiện đồng thời Chlamydia Trachomatis và Nisseria gonorhoeae bằng kỹ thuật Real-time PCR. Đồ án tốt nghiệp đại học Khác
[4] Tạ Hùng Vương, Nguyễn Trần Khánh. (2010). Xác định tỷ lệ HBV Genotyping ở bệnh nhân nhiễm HBV mạn tính tại Việt Nam. Báo cáo thực tập tốt nghiệp Khác
[5] Lưu Phương Nam. (2011). Quy trình định lượng HBV bằng phương pháp Real-time PCR. Báo cáo thực tập tốt nghiệp Khác
[6] Phan Quốc Việt, Hồ Thị Thanh Thủy. (2008). Ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán bệnh nhiễm ở người. Tài liệu tập huấn của Công ty Cổ phần Thương mại Sản xuất và Dịch vụ Việt Á Khác
[7] Phạm Hùng Vân. (2009). PCR và Real-time PCR Các vấn đề cơ bản và áp dụng thường gặp. NXB Y học chi nhánh TP.HCM Khác
[8] Lê Thúy Quyên. (1999). PCR-phát hiện và định lượng HBV-DNA. Luận án thạc sĩ khoa học Khác
[9] Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, and Peter Walter. (2008). Molecular Biology of the cell. NXB:Taylor & Francis Khác
[10] Welzel TM, Miley WJ, Parks TL, Goedert JJ, Whitby D, Ortiz- Conde BA. (2006 Sep). Real-time PCR assay for detection and quantification of hepatitis B virus genotypes A to G Khác
[11] Monjardino J, Velosa J, Thomas HC, de Moura MC. (1991 Jul). Serum HBV DNA detected by PCR in dot blot negative HBV chronic carriers with active liver disease Khác
[12] Dr. Yamina Lazizi * , Jacques Pillot. (March 1993). Delayed clearance of HBV-DNA detected by PCR in the absence of viral replication Khác
[14] Gregory J. Tsongalis, PhD. (2006). Branched DNA Technology in Molecular Diagnostics.Tài liệu Internet Khác

HÌNH ẢNH LIÊN QUAN

Hình 1.1. Virus viêm gan siêu v iB trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử [23] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.1. Virus viêm gan siêu v iB trong máu của một bệnh nhân nhìn dưới kính hiển vi điện tử [23] (Trang 9)
Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B [24] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.2. Cấu trúc viêm gan B [24] (Trang 10)
Hình 1.3. Cấu tạo bộ gene HBV [18] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.3. Cấu tạo bộ gene HBV [18] (Trang 11)
Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.4. Sự xâm nhiễm và sao chép HBV [27] (Trang 14)
Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới [25] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.5. Sự phân bố HBsAg trên thế giới [25] (Trang 17)
Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA [14] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.6. Nguyên lý phát hiện HBV bằng phương pháp bDNA [14] (Trang 23)
Hình 1.7. Nguyên lý PCR [9] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.7. Nguyên lý PCR [9] (Trang 25)
Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.8. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Beacon probe trong Real-time PCR (Trang 30)
Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR [7] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.9. Tóm tắt cơ chế hoạt động của probe đôi trong Real-time PCR [7] (Trang 32)
Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real- Real-time PCR [7] - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.10. Tóm tắt cơ chế hoạt động của Taqman probe trong Real- Real-time PCR [7] (Trang 34)
Hình 1.11. Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 1.11. Biểu đồ biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sáng kích thích vào mỗi chu (Trang 39)
Hình 2.1. Máy ly tâm thu huyết thanh - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.1. Máy ly tâm thu huyết thanh (Trang 40)
Hình 2.2. Máy Stratagene Mx3000P - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.2. Máy Stratagene Mx3000P (Trang 40)
Hình 2.4. Máy vortex - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.4. Máy vortex (Trang 41)
Hình 2.3. Máy ly tâm - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.3. Máy ly tâm (Trang 41)
Hình 2.6. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.6. Máy ly tâm eppendorf 0.2ml (Trang 42)
Hình 2.5. Máy ủ nhiệt khô - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.5. Máy ủ nhiệt khô (Trang 42)
Hình 2.7. Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.7. Quy trình phát hiện HBV bằng phương pháp Real-time PCR (Trang 44)
Hình 2.8. Chu trình nhiệt của Real-time PCR - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 2.8. Chu trình nhiệt của Real-time PCR (Trang 47)
Hình 3.1. Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 3.1. Đường biểu diễn khuếch đại mẫu thử nghiệm (Trang 49)
Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn - Quy trình chẩn đoán bệnh viêm gan siêu vi b bằng phương pháp real time pcr
Hình 3.2. Biểu đồ đường chuẩn (Trang 50)

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN