Mục đích nghiên cứu
Tìm ra môi trường tốt nhất để chủng nấm mốc Trichoderma spp thực hiện tối ưu hóa môi trường
Tinh sạch enzyme xylanase đƣợc thu nhận từ nấm mốc Trichoderma spp.
Nhiệm vụ nghiên cứu
Khảo sát các thành phần môi trường cảm ứng cho chủng nấm mốc Trichoderma spp nhằm tối ưu hóa hoạt lực enzyme Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzyme bao gồm tỷ lệ cám mì và bã mía, độ ẩm, nồng độ dinh dưỡng, pH, thời gian nuôi cấy và tỷ lệ giống.
Tách chiết và tinh sạch enzyme bằng sắc ký lọc gel.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp Bradford dùng để xác định hàm lượng protein
Phương pháp Xylose dùng để xác định hoạt tính enzyme xylanase
Phương pháp tủa enzyme bằng các tác nhân khác nhau
Phương pháp tinh sạch enzyme xylanase bằng sắc ký lọc gel.
Kết cấu của Đồ án Tốt nghiệp
Chương 1: Tổng quan tài liệu
Chương 2: Vật liệu và phương pháp
Chương 3: Kết quả và biện luận
Chương 4: Kết luận và kiến nghị
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Nguyên liệu
Hóa chất và thiết bị
Phương pháp nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase từ nấm mốc Trichoderma spp
từ nấm mốc Trichoderma spp
2.3.1 Phương pháp mô tả hình thái Trichoderma
Sử dụng que cấy vô trùng, nhẹ nhàng gạt bào tử nấm từ sợi nấm và chuyển chúng sang đĩa petri chứa môi trường PGA, sau đó cắm đầu que xuống giữa mặt thạch.
- Ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 2 – 3 ngày
- Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc của sợi nấm ở mặt trên và mặt dưới của khuẩn lạc
- Lót giấy thấm ở mặt đáy đĩa petri, đặt vào một miếng lame, gói giấy và đem khử trùng
- Nhỏ 3 giọt môi trường PGA vào lame và chờ đông lại, cấy 1 điểm vào giữa môi trường PGA rồi đậy miếng lamen lên
- Làm ẩm 4 góc giấy bằng nước cất vô trùng
- Sau 2, 3 ngày lấy miếng lame ra khỏi đĩa petri, nhỏ vài giọt cồn thấm bằng giấy sau đó nhỏ tiếp NaOH 10% thấm khô
- Quan sát kính hiển vi với độ phóng đại x40
2.3.2 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu
Cân 1g giống bào tử ống nghiệm chứa 9ml nước cất bổ sung Tween 80
0,1% vortex độ pha loãng 10 -1 tiếp tục pha loãng cho đến 10 -4 cho vào buồng đếm hồng cầu quan sát X40 và đếm bào tử
Công thức tính số bào tử trong 1g cơ chất
- N: số lƣợng bào tử trong 1ml dịch huyền phù
- a: số lƣợng bào tử trong 5 ô lớn (80 ô con)
- 10 3 : số chuyển mm 3 thành ml (1000 mm 3 = 1ml)
- n: độ pha loãng của mẫu
2.3.3 Phương pháp đo đường vành khuyên phân giải
Khi enzyme tác động lên cơ chất trong môi trường thạch, các hợp chất được phân giải thành những thành phần đơn giản hơn Hoạt tính xylanase có thể được định tính và định lượng sơ bộ thông qua vòng phân giải xylan, nhờ vào sự xuất hiện của các hợp chất không phản ứng màu với thuốc thử.
Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Môi trường định tính hoạt tính xylanase của dịch enzyme theo phương pháp cấy điểm: PGA bổ sung xylan
- Đĩa petri hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm, 15 phút
Cách tiến hành Đổ đĩa môi trường định tính hoạt tính xylanase dùng que cấy điểm
Trichoderma vào giữa môi trường cho thuốc thử glugol vào sau khi khảo sát ở 8h
2.3.4 Quy trình khảo sát một số yếu tố
Cấy chuyền (môi trường thạch nghiêng PGA)
Khảo sát sinh tổng hợp enzyme (môi trường bán rắn)
Khảo sát độ ẩm môi trường
Khảo sát tỷ lệ cơ chất
Cất giữ giống (môi trường lúa)
Khảo sát pH Khảo sát thời gian nuôi cấy
Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng
Khảo sát tỷ lệ giống
Viện Sinh học Nhiệt Đới nuôi cấy trong môi trường PGA thạch nghiêng ở nhiệt độ thường trong 36 giờ, sau đó bảo quản bào tử ở nhiệt độ lạnh.
Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Môi trường PGA: khoai tây 200g, agar 20g, glucose 20g, nước cất
1000ml, hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm, 15 phút
- Que cấy mốc, ống nghiệm
Cho môi trường vào 1/3 ống nghiệm và hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C, áp suất 1 atm trong 15 phút Sau đó, lấy ống nghiệm ra và để nghiêng để thạch không dính lên nút bông, chờ cho thạch đông lại.
- Dùng que cấy đã hấp khử trùng cấy ria trên bề mặt thạch
- Giống sau khi cấy nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm
Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Môi trường lúa bổ sung (NH4) 2 SO 4 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 7H 2 O, CaCl 2,
UREA, pepton, hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm, 15 phút
- Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, que cấy vòng tất cả đều đƣợc thanh trùng
Cho 1ml nước cất vào ống nghiệm, sau đó dùng que cấy nhẹ nhàng mài trên bề mặt thạch để tách bào tử, đảm bảo rằng chúng hoàn toàn hòa vào pha nước giống như các dịch huyền phù.
- Sau đó đổ toàn bộ nước chứa bào tử vào trong môi trường nhân giống và trộn kỹ
2.3.5.4 Khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase từ Trichoderma spp
Chuẩn bị môi trường và dụng cụ
- Môi trường khoáng Czapeck: KNO 3 , KH 2 PO 4 , MgSO 4 , FeSO 4 , KCl
- Môi trường bán rắn: 20g cám mì – bã mía bổ sung khoáng Czapeck
- Pipetman, đầu típ, đũa thủy tinh, nước tinh khiết, bình định mức 50ml, tất cả đều đƣợc thanh trùng
- Cho vào môi trường lúa nhân giống 20ml nước tinh khiết, dùng đũa thủy tinh khuấy để bào tử hòa lẫn vào nước
- Dùng pipetman hút 2 ml cho vào môi trường bán rắn
- Sau khi cấy, nuôi ở nhiệt độ phòng ở 48h
- Đo hàm lượng protein: sử dụng thuốc thử Coomassie và đo ở bước sóng 595 nm
- Đo hoạt tính enzyme: sử dụng thuốc thử DNS, cơ chất xylan và đo ở bước sóng 540 nm
Thí nghiệm 1: Khảo sát tỷ lệ cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase ở tỷ lệ cám mì – bã mía
Thí nghiệm 2: Khảo sát độ ẩm môi trường đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase Độ ẩm
Thí nghiệm 3: Khảo sát pH đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase pH 4,5 5 5,5 6 6,5
Thí nghiệm 4: Khảo sát thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase
Thí nghiệm 5: Khảo sát nồng độ dinh dƣỡng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase
Thí nghiệm 6: Khảo sát tỷ lệ giống đến khả năng sinh tổng hợp enzyme xylanase
Bố trí thí nghiệm
Sau khi nhận được kết quả từ khảo sát sinh tổng hợp enzyme xylanase, chúng tôi tiến hành thu chế phẩm enzyme để phục vụ cho các thí nghiệm khảo sát enzyme trong tương lai.
Quá trình này nhằm khảo sát các thông số kỹ thuật ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp enzyme xylanase, cũng như quy trình tách chiết và tinh sạch sơ bộ enzyme.
2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi để tách chiết enzyme xylanase
Mục đích của nghiên cứu này là xác định tỷ lệ dung dịch đệm tối ưu để tách chiết enzyme xylanase, nhằm nâng cao hiệu quả thu nhận dịch chiết enzyme cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của dung môi để tách chiết enzyme
Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, các dung môi (nước cất, đệm Citrate, đệm
Acetate, muối sinh lý NaCl)
Thí nghiệm 2: Khảo sát các tỷ lệ của dung môi tốt nhất để tách chiết thu nhận enzyme
Chuẩn bị: Chế phẩm enzyme, dung môi tốt nhất (kết quả của thí nghiệm 1)
Bổ sung dung môi (tỷ lệ chế phẩm : dung môi là 1:8)
Lọc Đo hàm lƣợng Protein và Hoạt tính enzyme Dịch chiết
2.4.2 Khảo sát các tác nhân tủa enzyme xylanase
Mục đích khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ các tác nhân với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất
Tỷ lệ 1:3 1:4 1:5 1:6 1:7 1:8 1:9 1:10 Chế phẩm enzyme (g) 3 3 3 3 3 3 3 3
Lọc Đo hàm lƣợng protein và Hoạt tính enzyme Dịch chiết
Thí nghiệm 3 Khảo sát tủa bằng cồn 96 o
Chuẩn bị: Dịch chiết protein, cồn 96 o
Để tiến hành tủa protein mà không làm biến tính, cần làm lạnh cồn 96 độ trước khi sử dụng Tỷ lệ giữa thể tích dịch chiết protein và cồn nên được duy trì ở các tỷ lệ 1:1 và 1:2.
1:3, 1:4, 1:5, 1:6 Lắc đều hỗn hợp bảo quản lạnh ở 4 o C trong 1 giờ Sau đó ly tâm
Quá trình quay với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút giúp thu tủa, sau đó tiến hành xác định hoạt tính và hàm lượng Việc lựa chọn tỷ lệ tối ưu cho hoạt tính và hàm lượng là rất quan trọng để đạt được kết quả tốt nhất.
Xác định hoạt tính và hàm luợng
Chọn lấy tỷ lệ, nồng độ tốt nhất
Thí nghiệm 4 Khảo sát tủa bằng muối (NH 4 ) 2 SO 4
Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các nồng độ muối (NH 4 ) 2 SO 4 với dịch chiết để chọn nồng độ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất
Vật liệu: Dịch chiết protein, dung dịch muối (NH 4 ) 2 SO 4 (50%, 55%, 60%,
Để tránh làm biến tính protein, dịch chiết protein thô cần được cho vào ống ly tâm 5ml, đặt trong chậu nhỏ chứa đá lạnh vụn xung quanh Thể tích dịch chiết protein và muối tương ứng với các nồng độ 50%, 55%, 60%, 65%.
70% Khuấy hỗn hợp bảo quản lạnh ở 4 0 C trong 30 phút Sau đó ly tâm
Quá trình quay với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút giúp thu tủa, từ đó xác định hoạt tính và hàm lượng Cần lựa chọn nồng độ phù hợp để đạt được hoạt tính và hàm lượng tối ưu nhất.
Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất
Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng
Thí nghiệm 5 Khảo sát tủa bằng Acetone
Chỉ tiêu khảo sát: Khảo sát các tỷ lệ cồn với dịch chiết để chọn tỷ lệ cho hoạt tính và hàm lƣợng enzyme tốt nhất
Chuẩn bị: Dịch chiết protein, dung dịch Acetone
Để tránh làm biến tính protein, cần làm lạnh Acetone trước khi tiến hành tủa Thể tích dịch chiết protein và Acetone nên được pha trộn theo các tỷ lệ 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 và 1:6.
Lắc đều hỗn hợp ở nhiệt độ 4°C trong 30 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 5 phút để thu tủa Tiến hành xác định hoạt tính và hàm lượng, từ đó chọn tỷ lệ tối ưu cho hoạt tính và hàm lượng tốt nhất.
Chọn lấy nồng độ tốt nhất
Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng
Sau khi khảo sát các tác nhân tủa giữa dịch chiết và từng chất, chúng tôi đã so sánh tỷ lệ và nồng độ để xác định hoạt tính và hàm lượng tối ưu nhất.
2.4.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme xylanase
Mục đích: Khảo sát nhiệt độ và pH cho hoạt tính enzyme tốt nhất
Thí nghiệm 6 Khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme trong dịch chiết
Vật liệu: Dịch tủa enzyme, các dụng cụ - thiết bị để chạy sắc ký
Chọn lấy tỷ lệ tốt nhất
Xác định hoạt tính Xác định hàm lƣợng
Sau khi khảo sát pH, ta có hoạt tính và hàm lƣợng protein ứng với từng pH
Ta chọn pH cho kết quả hoạt tính và hàm lƣợng tốt nhất để thu nhận dịch tủa
Thí nghiệm 7 Khảo sát ảnh hưởng theo nhiệt độ
Chuẩn bị: Dịch tủa enzyme
Chọn lấy pH tốt nhất
Xác định hoạt tính pH 3 pH 4 pH 5
Chọn lấy nhiệt độ tốt
Sau khi tiến hành khảo sát nhiệt độ, chúng ta đã xác định được hoạt tính và hàm lượng protein tương ứng với từng mức nhiệt độ Dựa trên kết quả thu được, chúng ta lựa chọn nhiệt độ mang lại hoạt tính và hàm lượng protein tối ưu nhất.
2.4.4 Tinh sạch protein enzyme bằng sắc ký lọc gel
- Chuẩn bị cột sắc ký: sử dụng cột sắc ký Bio – Rad
- Tốc độ dòng chảy: 1 ml/phút
Cho 10 g bột gel Biogel P – 100 từ từ vào dung dịch đệm phosphate 0.1 N, pH 7 đựng trong cốc, không khuấy, để yên trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng cho quá trình trương nở xảy ra hoàn toàn tạo thể huyền phù đồng nhất của các hạt, sau khi quá trình trương nở xảy ra hoàn toàn gạn lớp nổi trên bề mặt bỏ đi, đổ thêm đệm cho ngập phần gel và đuổi bọt khí bằng máy đuổi khí Để gel ổn định cho đến khi 90 – 95% số hạt ổn định, gạn hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn Lặp lại công việc trên 4 lần để loại hơn 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel
Gắn phễu đổ gel vào cột và đóng lỗ thoát, sau đó cho dung dịch đệm vào để làm đầy 20% thể tích cột Rót dung dịch đều và khuấy nhẹ để gel hấp phụ lắng từ từ, tránh tạo bọt khí và rót liên tục Để dịch đệm thừa chảy qua van dưới cột Khi lớp nền đạt từ 2 – 5 cm, mở khóa đầu ra cho đến khi cột được nạp đầy gel Sau khi nạp đầy gel, đặt một đĩa giấy lọc hoặc bông thủy tinh lên bề mặt nền cột để bảo vệ, sau đó khóa đầu ra và gắn adaptor vào.
Chạy máy sắc ký để ổn định cột bằng đệm phosphate pH 7 với lượng đệm gấp 2 – 3 lần thể tích cột Sau khi cột ổn định, đóng đầu ra của cột và điều chỉnh adaptor sát lớp nền gel.
Nạp mẫu vào trên bề mặt lớp nền gel qua adaptor
Bước 3: Nạp mẫu vào cột
Chuẩn bị mẫu: Mẫu chạy bằng sắc ký phải sạch, hòa tan mẫu trong NaOH
0.1 N Lọc mẫu qua milipore (màng lọc 0.45 micrometre) để làm gia tăng độ bền và thời gian sử dụng cột
Dùng xi lanh hút mẫu, bơm mẫu vào hệ thống sắc ký
Bước 4: Thêm dung dịch đệm rửa
Sau khi mẫu thấm vào cột, hãy bổ sung vài ml dung dịch đệm rửa để đảm bảo mẫu còn lại thấm hết vào nền cột Mẫu và dung dịch đệm sẽ di chuyển qua cột, cho phép các phân tử đi vào và ra khỏi lỗ hạt gel Cuối cùng, kết nối cột với bình chứa dịch cột thổi.
Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu và xử lí kết quả
2.5.1 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
2.5.1.1 Phương pháp xác định độ ẩm
- B: độ ẩm muốn bổ sung vào môi trường (%)
- C: độ ẩm trong cơ chất A (%)
- F: lượng nước cần bổ sung vào môi trường để đạt độ ẩm thích hợp
2.5.1.2 Phương pháp Bradford xác định hàm lượng protein
Phương pháp này dựa vào bước sóng hấp thụ cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue khi tương tác với protein Trong môi trường dung dịch acid, thuốc nhuộm này có bước sóng hấp thu cực đại khi chưa liên kết với protein.
595nm Độ hấp thu trực tiếp có liên hệ trực tiếp với nồng độ protein
Để chuẩn bị dung dịch albumin chuẩn, cân chính xác 10mg albumin và thêm 50-60ml nước cất để khuấy tan Sau đó, chuyển dung dịch vào bình định mức 100ml và dẫn nước cho đến vạch, tạo ra dung dịch albumin có nồng độ 0,1mg/ml.
Chuẩn bị 10 ống nghiệm đánh số 0 9, tiến hành thí nghiệm theo bảng sau: Ống số 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Bảng 3.1 Bảng số liệu dựng đường chuẩn Bradford
Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát, nồng độ protein của mẫu được xác định là X (µg/ml) trong mg nguyên liệu.
Vậy hàm lƣợng protein có trong 1g nguyên liệu là:
- X (àg/ml): nồng độ protein trong mẫu khảo sỏt dựa vào phương trỡnh đường chuẩn
- n: hệ số pha loãng mẫu từ 1g chế phẩm protein thô ban đầu
2.5.1.3 Xây dựng đường chuẩn xylose
Chuẩn bị dung dịch xylose nồng độ 10mM: hòa tan 150mg xylose trong đệm
Na-citrate 0,05M pH 5,3 chuyển vào bình định mức 100ml, thêm dung dịch đệm đến vạch Dung dịch này tiếp tục đƣợc pha loãng với dung dịch đệm
Na-citrate 0,05M pH 5,3 theo bảng sau: Độ pha loóng Xylose (àMol/ml) BXU
Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng dung dịch Xylose chuẩn
+ Hút vào mỗi ống nghiệm 1,8 ml dung dịch xylan 1%
+ Thờm 3 ml dung dịch DNS và 200 àl dung dịch xylose chuẩn
+ Chuẩn bị ống đối chứng với 200 àl dung dịch đệm Na-citrate 0,05M pH 3,5 thay cho dung dịch xylose chuẩn
+ Đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm trên máy quang phổ
+ Hút 1,8 ml dung dịch cơ chất cho vào 3 ống nghiệm có dung tích 25ml (hai ống nghiệm cho mỗi lần xác định) và một ống đối chứng
+ Đặt vào bể ổn định nhiệt có nhiệt độ 50º trong 5phút
Tại thời điểm 0, bắt đầu quá trình, thêm 200 ml dung dịch enzyme đã pha loãng vào ống nghiệm thứ nhất và trộn đều bằng máy vortex Tiếp tục thêm enzyme vào các ống nghiệm còn lại, ngoại trừ ống đối chứng.
+ Sau 5 phút phản ứng, thêm 3 ml dung dịch DNS vào mỗi ống và lắc đều
+ Thờm 3 ml thuốc thử DNS, sau đú thờm 200àl dung dịch enzyme vào ống đối chứng
+ Đun sôi cách thủy các ống nghiệm trong thời gian 5 phút, sau đó làm mát trong nước lạnh cho đến nhiệt độ phòng
+ Đo độ hấp thu ở bước sóng 540 nm và tính theo đường chuẩn xylose trên máy quang phổ
Một đơn vị hoạt tính xylanase (BXU) được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng thủy phân xylan, tạo ra lượng đường khử tương ứng với 1 nmol xylose trong 1 giây dưới các điều kiện phản ứng nhất định.
Một đơn vị hoạt tính xylanase (UI) được định nghĩa là lượng enzyme thủy phân xylan tạo ra đường khử tương ứng với 1 micromol xylose trong 1 phút dưới các điều kiện phản ứng nhất định.
Nhƣ vậy 1 UI BXU ; 1UI = 1 àmol xylose/ml/phỳt
- X: số àmol xylose suy ra từ đường chuẩn
- v: thể tích enzyme cho vào hỗn hợp phản ứng enzyme
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Quan sát hình thái Trichoderma spp trên môi trường PGA
Mặt dư i khẩn lạc Mặt trên khuẩn lạc
Hình 3.1 Hình thái đại thể của Trichoderma spp
Sau 24 giờ quan sát, hình thái đại thể của tơ Trichoderma spp cho thấy chúng có dạng bông Khi còn non, khuẩn lạc có màu trắng, nhưng khi trưởng thành, khuẩn lạc chuyển sang màu xanh lục do sự xuất hiện của bào tử đính Đặc biệt, Trichoderma spp không tiết sắc tố màu vàng ra môi trường thạch.
Hình 3.2 Hình thái vi thể của Trichoderma spp nuôi ủ ở 24h
Hình 3.3 Hình thái vi thể của Trichoderma spp nuôi ủ ở 36h
Hình 3.4 Hình thái vi thể của Trichoderma spp nuôi ủ ở 48h
Sau khi nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian 24h thì khuẩn ty có vách ngăn, cuống sinh bào tử có dạng phân nhánh giống nhƣ cành cây.
Sau 36 giờ nuôi ủ, khuẩn lạc phát triển thành tơ già, với mỗi nhánh chứa nhiều tế bào tạo ra bào tử đính Những bào tử này không chỉ tồn tại riêng lẻ mà còn kết hợp lại thành các cụm.
Sau 48h nuôi cấy, bào tử phát triển mạnh, đính dính nhau thành nút thắt bào tử
3.2 Định tính enzyme xylanase của Trichoderma spp
64h 59mm Hình 3.5 Kết quả vành phân giải xylanase của Trichoderma spp
Khi nuôi ủ ở thời gian 8h thì vi sinh vật chƣa phát triển nên chƣa thấy đƣợc vòng phân giải enzyme
Bắt đầu từ 16h đến 40h nấm mốc phát triển enzyme xylanase thủy phân cơ chất xylan tạo vòng phân giải lớn dần (11mm đến 34mm) Thời điểm từ 48h đến
56h tơ non phát triển mạnh và đạt kích thước 49mm
Thời gian sau nuôi ủ 56h và 64h là giai đoạn nấm mốc phát triển tiếp tục bắt đầu sinh bào tử
Nhƣng ở thời gian nuôi cấy 56h và 64h thì nấm mốc sinh bào tử cho nên sinh ra enzyme xylanase không tốt bằng thời gian 48h nấm mốc phát triển tơ non
3.3 Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp
Sau 48 giờ nuôi cấy giống mốc Trichoderma spp., chúng tôi đã xác định được số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu Kết quả cho thấy sự phát triển mạnh mẽ của giống mốc này, cho phép đánh giá tiềm năng ứng dụng trong nông nghiệp và các lĩnh vực khác.
Kết quả số tế bào đếm đƣợc trong 1g mốc giống ở nồng độ pha loãng 10 -4 là
Sau đó ta tiến hành cấy vào môi trường lên men bán rắn
3.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp xylanase của
Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất đến sinh tổng hợp xylanase
Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính xylanase Ta có kết quả ở bảng 3.1 nhƣ sau:
Bảng 3.1 trình bày kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma spp khi sử dụng các tỷ lệ cơ chất khác nhau Đồ thị 3.1 minh họa sự thay đổi của hàm lượng protein và hoạt tính xylanase trong môi trường nuôi cấy Trichoderma spp với các tỷ lệ cơ chất khác nhau.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính xylanase đạt cao nhất ở tỷ lệ 4:6 với 139,48 UI/g, trong khi tỷ lệ 6:4 chỉ đạt 78,96 UI/g Đồng thời, hàm lượng protein cũng cao nhất ở tỷ lệ 4:6, đạt 35,47 mg, và giảm xuống còn 21,87 mg ở tỷ lệ 6:4.
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
Kết quả nghiên cứu cho thấy bã mía có khả năng giữ nước tốt hơn và cấu trúc phức tạp hơn cám mì Khi pha chế với tỷ lệ cám mì và bã mía khác nhau, tỷ lệ 6:4 giữa cám mì và bã mía tạo ra môi trường có độ ẩm và lượng bã mía thấp hơn so với các tỷ lệ khác.
Bã mía có tỷ lệ 4:6 với độ ẩm và hàm lượng cao, tạo ra độ xốp và khả năng thoáng khí tốt hơn Điều này rất phù hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp xylanase.
Khi tỷ lệ bã mía và Trichoderma là 6:4, hoạt tính xylanase giảm xuống còn 78,96 UI/g và hàm lượng protein chỉ đạt 21,87 mg Nguyên nhân là do hàm lượng bã mía thấp không đủ tạo độ thông thoáng cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc.
Kết quả cho thấy môi trường có tỷ lệ 4:6 là tối ưu nhất, tuy nhiên còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như độ ẩm và pH, do đó cần tiếp tục thực hiện khảo sát.
Chúng tôi chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía là môi trường nuôi cấy cho các thí nghiệm tiếp theo
Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm môi trường đến sự sinh tổng hợp xylanase cho thấy độ ẩm có tác động quan trọng đến sự sinh trưởng và trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn Trong nghiên cứu, tỷ lệ 4 cám mì và 6 bã mía được lựa chọn để điều chỉnh độ ẩm môi trường Nước cất được thêm vào để đạt các mức độ ẩm 45%, 50%, 55%, 60%, 65% và 70% Sau đó, dịch huyền phù từ môi trường nhân giống cấp 1 (môi trường lúa) được cấy vào môi trường thí nghiệm.
Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính xylanase Ta có kết quả ở bảng 3.2 nhƣ sau:
Bảng 3.2 Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma spp có độ ẩm môi trường khác nhau Độ ẩm Tỷ lệ
70% 34,40 108,09 Đồ thị 3.2 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có độ ẩm khác nhau
Trong thí nghiệm này ta chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát độ ẩm
Kết quả từ bảng 3.2 và đồ thị 3.2 cho thấy hoạt tính xylanase và hàm lượng protein tăng dần khi độ ẩm từ 45% đến 55%, đạt đỉnh cao nhất tại độ ẩm 55% với giá trị lần lượt là 149,68 UI/g và 39,73 mg, sau đó giảm khi độ ẩm đạt 60%.
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
H àm lƣ ợn g pr ot ein( m g/g ) Độ ẩm
Hoạt tính xylanase (IU/g) có thể được cải thiện nhờ vào độ ẩm thích hợp, giúp làm phồng cơ chất và tăng độ xốp, tạo điều kiện thuận lợi cho Trichoderma tiếp xúc với cơ chất Ngược lại, trong môi trường có độ ẩm thấp, hoạt lực xylan và hàm lượng protein sẽ giảm do cơ chất bị khô, gây bất lợi cho sự sinh trưởng và tổng hợp xylanase.
Trichoderma spp cho thấy rằng trong môi trường có độ ẩm cao hơn 55%, hoạt lực xylan và hàm lượng protein giảm Nguyên nhân có thể là do độ ẩm quá cao làm giảm độ xốp, cản trở sự khuếch tán oxy từ bên ngoài vào môi trường.
Thí nghiệm 3 Kết quả khảo sát pH môi trường đến sinh tổng hợp xylanase
Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có pH khác nhau pH Tỷ lệ
6.5 36,27 136,38 Đồ thị 3.3 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có pH khác nhau
Theo bảng 3.3 và đồ thị 3.3, hoạt tính xylanase và hàm lượng protein đạt mức thấp nhất ở pH 4.5 với giá trị lần lượt là 110,20 UI/g và 29,33 mg/g Khi pH tăng lên 5.5, hoạt tính xylanase và hàm lượng protein tăng cao nhất, đạt 150,74 UI/g.
41,60 mg/g, ở pH 6.0 và 6.5 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein giảm dần
Môi trường có độ pH quá kiềm hoặc quá acid có thể ảnh hưởng đến sự ion hóa và độ bền của cơ chất, từ đó tác động đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của Trichoderma Khi Trichoderma hoạt động trong môi trường pH thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ tăng theo thời gian nuôi cấy.
Thí nghiệm 4 Kết quả khảo sát nồng độ dinh duỡng đến sinh tổng hợp xylanase
Định lƣợng mốc giống Trichoderma spp
Sau 48 giờ nuôi cấy giống mốc Trichoderma spp., chúng tôi đã xác định được số lượng tế bào vi sinh vật có trong mẫu Kết quả thu được cho thấy sự phát triển mạnh mẽ của giống mốc này.
Kết quả số tế bào đếm đƣợc trong 1g mốc giống ở nồng độ pha loãng 10 -4 là
Sau đó ta tiến hành cấy vào môi trường lên men bán rắn.
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp xylanase của
Thí nghiệm 1: Kết quả khảo sát tỷ lệ cơ chất đến sinh tổng hợp xylanase
Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính xylanase Ta có kết quả ở bảng 3.1 nhƣ sau:
Bảng 3.1 trình bày kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma spp khi sử dụng các tỷ lệ cơ chất khác nhau Đồ thị 3.1 minh họa sự biến đổi hàm lượng protein và hoạt tính xylanase trong môi trường nuôi cấy Trichoderma spp tùy thuộc vào tỷ lệ cơ chất.
Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt tính xylanase đạt cao nhất ở tỷ lệ 4:6 với 139,48 UI/g, trong khi tỷ lệ 6:4 chỉ đạt 78,96 UI/g Đồng thời, hàm lượng protein tối đa là 35,47 mg tại môi trường 4:6, giảm xuống còn 21,87 mg ở tỷ lệ 6:4.
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
Kết quả nghiên cứu cho thấy bã mía có khả năng giữ nước tốt hơn và cấu trúc phức tạp hơn cám mì Khi pha chế với tỷ lệ cám mì và bã mía khác nhau, tỷ lệ 6:4 cho thấy độ ẩm và lượng bã mía thấp hơn so với các tỷ lệ khác.
Bã mía có tỷ lệ 4:6 với độ ẩm và hàm lượng cao, tạo điều kiện cho độ xốp và khả năng thoáng khí tốt hơn Điều này rất thích hợp cho sự sinh trưởng và tổng hợp xylanase.
Khi tỷ lệ Trichoderma là 6:4, hoạt tính xylanase và hàm lượng protein giảm xuống còn 78,96 UI/g và 21,87 mg Nguyên nhân là do hàm lượng bã mía thấp, không đủ tạo độ thông thoáng cần thiết cho sự phát triển của nấm mốc.
Kết quả cho thấy môi trường có tỷ lệ 4:6 là tối ưu, tuy nhiên còn phụ thuộc vào các yếu tố khác như độ ẩm và pH, do đó cần tiến hành khảo sát thêm.
Chúng tôi chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía là môi trường nuôi cấy cho các thí nghiệm tiếp theo
Trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm đến sinh tổng hợp xylanase, độ ẩm được điều chỉnh ở các mức 45%, 50%, 55%, 60%, 65% và 70% bằng cách thêm nước cất vào môi trường bán rắn với tỷ lệ 4 cám mì và 6 bã mía Độ ẩm không chỉ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng mà còn tác động đến quá trình trao đổi chất của vi sinh vật trong quá trình lên men bán rắn Dịch huyền phù từ môi trường nhân giống cấp 1 (môi trường lúa) được cấy vào để tiến hành thí nghiệm.
Sau 48h nuôi cấy, tách chiết enzyme xylanase, xác định hàm lƣợng protein và xác định hoạt tính xylanase Ta có kết quả ở bảng 3.2 nhƣ sau:
Bảng 3.2 Kết quả hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase của Trichoderma spp có độ ẩm môi trường khác nhau Độ ẩm Tỷ lệ
70% 34,40 108,09 Đồ thị 3.2 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có độ ẩm khác nhau
Trong thí nghiệm này ta chọn tỷ lệ 4 cám mì : 6 bã mía để khảo sát độ ẩm
Theo bảng 3.2 và đồ thị 3.2, hoạt tính xylanase và hàm lượng protein tăng dần khi độ ẩm môi trường từ 45% đến 55%, đạt mức cao nhất tại 55% với 149,68 UI/g và 39,73 mg Tuy nhiên, khi độ ẩm tăng lên 60%, cả hai chỉ số này đều giảm.
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
H àm lƣ ợn g pr ot ein( m g/g ) Độ ẩm
Hoạt tính của xylanase (IU/g) có thể tăng lên nhờ vào độ ẩm thích hợp, giúp làm phồng cơ chất và tăng độ xốp, tạo điều kiện thuận lợi cho Trichoderma tiếp xúc với cơ chất Ngược lại, trong môi trường có độ ẩm thấp, hoạt lực xylan và hàm lượng protein giảm do cơ chất khô, gây bất lợi cho sự sinh trưởng và tổng hợp xylanase.
Trichoderma spp cho thấy rằng trong môi trường có độ ẩm cao hơn 55%, hoạt lực xylan và hàm lượng protein sẽ giảm Nguyên nhân có thể là do độ ẩm quá cao làm giảm độ xốp, từ đó cản trở sự khuếch tán oxy vào môi trường.
Thí nghiệm 3 Kết quả khảo sát pH môi trường đến sinh tổng hợp xylanase
Bảng 3.3 Kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có pH khác nhau pH Tỷ lệ
6.5 36,27 136,38 Đồ thị 3.3 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có pH khác nhau
Theo bảng 3.3 và đồ thị 3.3, hoạt tính xylanase và hàm lượng protein ở pH 4.5 đạt mức thấp nhất với 110,20 UI/g và 29,33 mg/g Khi pH tăng lên 5.5, cả hoạt tính xylanase và hàm lượng protein đều tăng cao nhất, đạt 150,74 UI/g.
41,60 mg/g, ở pH 6.0 và 6.5 thì hoạt tính xylanase và hàm lƣợng protein giảm dần
Hiện tượng này có thể xuất phát từ môi trường quá kiềm hoặc quá acid, ảnh hưởng đến sự ion hóa và độ bền của cơ chất Điều này tác động đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của Trichoderma; khi môi trường pH thích hợp, hoạt tính enzyme sẽ tăng theo thời gian nuôi cấy.
Thí nghiệm 4 Kết quả khảo sát nồng độ dinh duỡng đến sinh tổng hợp xylanase
Cơ chất lý tưởng cho vi sinh vật là nơi cung cấp tất cả các chất dinh dưỡng cần thiết Tuy nhiên, nhiều cơ chất lại thiếu dinh dưỡng, do đó cần bổ sung thêm các chất dinh dưỡng từ bên ngoài khi pha chế môi trường với nồng độ dinh dưỡng x1, x2,….,x5 Độ ẩm cần được điều chỉnh đến 55% và pH đạt 5,5, với tỷ lệ cám mì và bã mía là 4:6.
Sau khi nuôi cấy 48h, xác định hàm lƣợng protein và hoạt tính enzyme xylanase
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
H àm lƣợng pro tein ( m g/g ) pH
Bảng 3.4 Kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có nồng độ dinh dƣỡng khác nhau
Tỷ lệ CM:BM pH Độ ẩm
32,53 120,34 x2 34,40 128,57 x3 35,47 135,75 x4 42,40 170,80 x5 39,47 149,47 Đồ thị 3.4 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có nồng độ dinh dưỡng khác nhau
Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme xylanase và hàm lƣợng protein tăng dần lên từ môi trường có nồng độ dinh dưỡng x1 đến x3, Ở nồng độ dinh dưỡng x4
Hoạt tính enzyme xylanase đạt mức cao nhất với 170,80 IU/g và 42,40 mg, sau đó giảm dần khi nồng độ dinh dưỡng giảm xuống x5, với hàm lượng protein còn lại là 149,47 UI/g và 39,47 mg/g.
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
Thí nghiệm 5 Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy đến sinh tổng hợp xylanase
Bảng 3.5 Kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có thời gian nuôi cấy khác nhau
Tỷ lệ CM:BM pH Độ ẩm Nồng độ dinh dƣỡng
80h 39,73 160,87 Đồ thị 3.5 Biểu diễn hàm lƣợng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có thời gian nuôi cấy khác nhau
Kết quả từ bảng 3.5 và đồ thị 3.5 cho thấy hoạt tính xylanase và hàm lượng protein tăng rõ rệt trong khoảng thời gian từ 8 đến 48 giờ, đạt đỉnh cao nhất tại 48 giờ Sau thời điểm này, hoạt tính và hàm lượng protein bắt đầu giảm dần Điều này có thể được giải thích bởi sự phát triển mạnh mẽ của Trichoderma spp sau 48 giờ nuôi cấy, dẫn đến việc cơ chất bị thủy phân gần như hoàn toàn, từ đó làm giảm hoạt tính và hàm lượng protein.
H oạ t tính Xy la na se (I U/g )
Thí nghiệm 6 Kết quả khảo sát tỷ lệ giống đến sinh tổng hợp xylanase
Bảng 3.6 Kết quả hàm lượng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có tỷ lệ giống khác nhau
Tỷ lệ CM:BM Độ ẩm pH
5.60x10 11 46,40 173,54 Đồ thị 3.6 Biểu diễn hàm lượng protein và hoạt tính xylanase từ môi trường nuôi cấy Trichoderma spp có tỷ lệ giống khác nhau
Kết quả cho thấy, hoạt tính enzyme và hàm lƣợng protein đạt cao nhất tại
Tinh sạch enzyme xyalanse bằng phương pháp chạy sắc ký lọc gel
Sau khi chiết xuất enzyme bằng nước cất, đệm acetate pH 5, và NaCl, cùng với việc tủa enzyme bằng cồn, muối và acetone, kết quả cho thấy rằng chiết xuất bằng nước cất và tủa bằng muối mang lại hoạt tính enzyme cao nhất Do đó, chúng tôi chọn nước cất và muối với tỷ lệ hòa tan 65% để thu enzyme Quá trình tinh sạch được thực hiện trên gel Biogel P-100 của hãng Bio-Rad, Mỹ.
Sau khi ly trích enzyme bằng muối (NH4)2SO4, dịch chiết enzyme được thu nhận và tiến hành tinh sạch sản phẩm thông qua sắc ký Trước khi thực hiện sắc ký, muối được loại bỏ bằng màng thẩm tích, cho phép chỉ muối (NH4)2SO4 đi qua, trong khi protein được giữ lại Sau đó, mẫu được thu và sắc ký được tiến hành.
Sau khi thực hiện chạy sắc ký, chúng tôi thu được hai peak Tiếp theo, tiến hành xác định hoạt tính xylanase và hàm lượng protein của hai peak này Hình 3.15 minh họa sắc ký đồ trên Excel cho quá trình phân tích enzyme xylanase.
Bảng 3.15 Hiệu suất tinh sạch
Nghiệm thức Σ HT Σ HL Hoạt tính riêng Độ tinh sạch (lần)
Hiệu suất (%) Trước sắc ký 544,0 340 1,6 1 100
Enzyme sau khi tinh sạch có hoạt tính và hàm lượng protein thấp hơn so với tổng hoạt tính và hàm lượng protein trước tinh sạch Sự giảm này là do các thao tác như tủa và ly tâm trong quá trình tinh sạch dẫn đến thất thoát enzyme Mặc dù vậy, hoạt tính riêng của enzyme lại cao hơn nhiều lần, cho thấy hiệu suất tinh sạch đạt kết quả khá cao.