Mục đích nghiên cứu
- Ứng dụng chế phẩm enzyme trong chế biến tiêu trắng
Ứng dụng chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật tổng hợp enzym pectinase và cellulase giúp phân giải pectin và cellulose, đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất tiêu trắng (tiêu sọ) từ vỏ hạt tiêu.
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như tỷ lệ nguyên liệu nước ngâm, thời gian ngâm, nhiệt độ thanh trùng, thời gian thanh trùng, nồng độ chế phẩm enzyme, pH, nhiệt độ ủ và thời gian thủy phân đến hiệu suất bóc vỏ của tiêu đen bằng enzyme Cellulase, thương mại là Cellusoft L, là một nghiên cứu quan trọng nhằm tối ưu hóa quy trình chế biến tiêu đen.
Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như độ ẩm môi trường, tỷ lệ cơ chất, nồng độ dinh dưỡng và thời gian nuôi cấy đến sự hình thành bào tử của nấm T konigii trên môi trường lên men bán rắn Nghiên cứu này nhằm xác định điều kiện tối ưu để nâng cao hiệu suất sản xuất bào tử, từ đó ứng dụng trong các lĩnh vực nông nghiệp và công nghiệp.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện từ ngày 1 tháng 1 năm 2014 đến ngày 15 tháng 4 năm 2014 tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới, phòng nghiên cứu các hoạt chất có hoạt tính sinh học, địa chỉ 9/621 xa lộ Hà Nội, phường Linh Trung, quận Thủ Đức.
Vật liệu
Nấm mốc Trichoderma koningii được cung cấp bởi Viện Sinh Học Nhiệt Đới
Các chủng giống được nuôi cấy trong ống nghiệm hạch nghiêng với môi trường PGA ở nhiệt độ 30°C trong 5 – 7 ngày Sau khi bào tử hình thành, chúng được bảo quản ở nhiệt độ từ 4 – 8°C.
2.2.2 Nguyên liệu và cơ chất
- Tiêu đen là tiêu xanh sau khi tách cuống, đem phơi nẵng cho khô, được mua tại vườn của các hộ trồng tiêu ở Đồng Nai
- Cám gạo, trấu: mua tại chợ
Tên thương mại: Cellusoft L Đặc tính: sản xuất từ chủng Trichoderma viridae Hoạt tính chính cellulase Điều kiện hoạt động tối ưu: nhiệt độ 50-55 0 C, pH: 4,5-5,5
[http://bakteri-enzim.com/a_cellusoft_L_e.html]
– Các hóa chất dùng trong vi sinh: glucose, saccharose, agar, NaNO3, K2HPO4, MgSO4.7H2O, KCl, FeSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2.2H2O, CuSO4.5H2O, KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4, CaCl2.2H2O, NH4NO3, xanh methylene, Tween 80…
– Các hóa chất dùng trong xác định thành phần sinh hóa: HNO3đđ, H2O2,
CH3COOHđđ, HCl, NaOH, CaCl2, AgNO3, H2SO4, H3BO3, cồn 96 o , ete etylic, hexan…
- Pipette 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml
- Cốc thủy tinh 100 ml, cốc 250 ml, cốc 500 ml, cốc 1000 ml
- Đũa khuấy, ống đong, giấy lọc, phễu
- Cân phân tích TE 313 Satorius
- Buồng đếm hồng cầu Thomas (Đức)
2.2.6.1 Môi trường giữ giống PGA
Môi trường dùng để giữ giống: PGA (potato glucose agar) (Trần Linh Thước,
Bảng 2.1.Hàm lượng các chất trong môi trường PGA
THÀNH PHẦN PGA HÀM LƯỢNG
Sau khi gọt vỏ và rửa sạch, khoai tây được cắt lát và nấu với nước cất trong khoảng 30 phút Sau đó, lọc để lấy nước khoai tây, cho agar vào và tiếp tục nấu, nhớ khuấy đều trong suốt quá trình Cuối cùng, thêm glucose vào và khuấy cho đến khi tan hoàn toàn.
Chuẩn bị môi trường bằng cách cho vào 1/4 ống nghiệm, sau đó khử trùng ở nhiệt độ 121°C và áp suất 1 atm trong 20 phút Tiếp theo, xếp nghiêng các ống nghiệm để nguội, tạo ra môi trường thạch nghiêng, với mặt thạch không vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm.
Sử dụng que cấy đã được khử trùng, cấy truyền từ ống giống sang các ống nghiệm đã chuẩn bị Sau 2 ngày ở nhiệt độ phòng, bào tử nấm sẽ phát triển đồng đều Các ống nghiệm giữ giống cần được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 – 9 độ C để phục vụ cho các thí nghiệm sau này Tất cả các thao tác này phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
2.2.6.2 Môi trường Czapek (môi trường bổ sung khoáng cho môi trường lên men bán rắn)
Bảng 2.2 Thành phần các chất trong môi trường Czapek
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp cấy chuyền giữ giống, nhân giống và thu sinh khối nấm mốc
Trichoderma koningii là một loại nấm có tiềm năng lớn trong sản xuất enzyme và protein Nghiên cứu của Nguyễn Tiến Thắng và các tác giả (2006) đã chỉ ra rằng môi trường lên men bán rắn là điều kiện tối ưu để phát triển Trichoderma koningii, giúp tăng cường khả năng sinh trưởng và hoạt động enzyme Kết quả từ nghiên cứu này có thể ứng dụng trong công nghệ sinh học và sản xuất thực phẩm, mở ra hướng đi mới cho việc khai thác nguồn tài nguyên sinh học.
– Phương pháp cấy chuyền giữ giống
Môi trường nuôi cấy PGA được pha chế, rót vào 1/3 ống nghiệm và hấp khử trùng ở 121 oC trong 15 phút, sau đó để nghiêng cho thạch đông cứng lại Sử dụng que cấy đã khử trùng, cấy chuyền theo phương pháp cấy ria trên bề mặt thạch trong tủ cấy vô trùng Sau khi cấy, giống được nuôi ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong khoảng 5 – 7 ngày và sau đó bảo quản ở 4 – 8 oC Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật, cần thực hiện cấy chuyền giữ giống một lần sau khoảng 2 tháng.
– Phương pháp nhân giống nấm mốc
Nhân giống trên môi trường lúa nhằm mục đích tạo ra giống tốt hơn, bảo quản lâu dài và chuẩn bị giống, đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cho việc nuôi cấy trong môi trường lên men bán rắn.
Rửa sạch lúa và để ráo, sau đó cân 10 g cho vào bình erlen 250 ml Thêm 10 ml dung dịch khoáng dinh dưỡng Czapeck vào và trộn đều Tiến hành hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 oC trong 15 phút, rồi để nguội.
Lấy 5 ml dung dịch nước muối sinh lý chứa Tween 80 0,1% đã khử trùng cho vào ống giống, sử dụng que cấy đã khử trùng để mài nhẹ trên mặt thạch nhằm tách bào tử, đảm bảo chúng hoàn toàn nằm trong pha nước như các dịch huyền phù Sau đó, đổ toàn bộ nước chứa dịch huyền phù bào tử vào môi trường nhân giống và trộn kỹ để bào tử phân phối đều, rồi đậy nút bông và bao gói Nuôi trong điều kiện nhiệt độ phòng, sau 3 – 5 ngày, bào tử nấm mốc sẽ mọc phủ kín các hạt lúa, sau đó bảo quản ở nhiệt độ 4 – 8 độ C.
– Phương pháp thu sinh khối nấm mốc Trichoderma sp
Cho 20 ml nước muối sinh lý chứa Tween 80 0,1% vào bình môi trường lúa và khuấy đều bằng đũa thủy tinh vô trùng để hòa tan các bào tử nấm mốc Sau đó, dùng pipetman để hút một lượng dịch huyền phù bào tử nhất định và cho vào môi trường bán rắn Cuối cùng, nuôi ủ ở nhiệt độ phòng để đảm bảo sự phát triển của bào tử.
2.3.2 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng buồng đếm hồng cầu (Lê Duy Linh và cộng sự, 1997)
Buồng đếm hồng cầu là thiết bị chuyên dụng để đếm vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men và bào tử nấm mốc Hai loại buồng đếm hồng cầu phổ biến hiện nay là buồng đếm Thomas và buồng đếm Goriep.
Nguyên tắc cấu tạo của hai loại buồng đếm này tương tự nhau, bao gồm một phiến kính hình chữ nhật chia thành ba khoảng ngang Khoảng giữa được chia thành hai khoảng nhỏ, mỗi khoảng đều có lưới đếm với nhiều ô vuông Mỗi ô lớn có diện tích 1/25 mm², được chia thành 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400 mm² và chiều cao 0,1 mm Do đó, thể tích của một ô nhỏ là 1/400 mm² x 0,1 mm, tương đương với 1/4000 mm³ hay 1/4000000 ml.
2.3.3 Xác định số lượng bào tử nấm mốc bằng phương pháp đếm khuẩn lạc [Trần
Linh Thước (2012) discusses the methods for analyzing microorganisms in water, food, and cosmetics in his publication from NXB Giáo dục, covering pages 63-71 and 101-104 Additionally, Elad, Chet, and Henis (1981) present a selective medium designed to enhance the quantitative isolation of Trichoderma species from soil in their study published in Phytoparasitica, volume 9, issue 1, pages 59-67.
Phương pháp đếm khuẩn lạc, khác với đếm trực tiếp, giúp xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống trong mẫu Tế bào sống có khả năng phân chia và tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc Có hai phương pháp chính để đếm khuẩn lạc: phương pháp trải đĩa và phương pháp đổ đĩa, trong đó chúng tôi lựa chọn sử dụng phương pháp trải đĩa.
– Sử dụng môi trường chọn lọc Trichoderma Selective Medium (TSM) được hấp khử trùng ở 121 o C/15 phút Sau đó đổ đĩa để nguội trong 2 ngày để kiểm tra độ vô trùng
Pha loãng mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý 0,85% có chứa Tween 80 0,1% để tạo ra các nồng độ pha loãng 10^-1, 10^-2, 10^-3 Sử dụng pipetman và đầu tip vô trùng, hút 0,1 ml mẫu đã pha loãng và đưa lên bề mặt môi trường trong đĩa petri, thực hiện cấy 3 đĩa cho mỗi độ pha loãng.
– Dùng đầu que trải đã vô trùng trải đều dịch mẫu lên khắp mặt thạch
Để nuôi cấy nấm mốc, hãy úp ngược đĩa và bao gói ủ ở nhiệt độ khoảng 30 – 32 o C cho đến khi khuẩn lạc xuất hiện Sau 24 giờ, tiến hành đếm khuẩn lạc và kiểm tra lại sau 48 giờ, vì nếu thời gian nuôi cấy quá dài, các khuẩn ty sẽ phát triển tràn lan trên bề mặt thạch.
Ghi nhận nồng độ pha loãng với số khuẩn lạc từ 25 đến 250 trên đĩa Kết quả tính toán cho thấy NI là số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) trong 1 ml mẫu.
Ni (CFU/ml) = Ci x Di/V
Ci: số khuẩn lạc trung bình/đĩa
V: thể tích cấy vào mỗi đĩa
Mật độ tế bào trung bình NI trong mẫu ban đầu là trung bình cộng của Ni ở các nồng độ pha loãng khác nhau
2.3.4 Phương pháp xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí [Trần Linh Thước (2012),
Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mĩ phẩm, NXB Giáo dục, Tp.HCM, tr 63-71, 101-104.]
– Sử dụng môi trường thạch PCA pH 7,0 ± 0,2
Mẫu tiêu được thanh trùng ở các nhiệt độ 70 o C, 80 o C và 90 o C trong khoảng thời gian khác nhau trước khi để nguội Sau đó, tiến hành pha loãng mẫu bằng cách lấy 1 ml dung dịch từ mẫu tiêu và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml dung dịch nước muối sinh lý có chứa Tween.
Để thực hiện quá trình pha loãng, bắt đầu với dung dịch 80 0,1% vô trùng, huyền phù, ta tiến hành pha loãng ở tỷ lệ 1/10 (10 -1) Tiếp theo, tiếp tục pha loãng theo dãy thập phân để đạt được mật độ khuẩn lạc trong mỗi đĩa petri dao động từ 25 đến 250 khuẩn lạc.
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến HSBV
Khảo sát ảnh hưởng của pH đến
HSBV của chế phẩm enzyme
Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến HSBV của chế phẩm enzyme
Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ủ đến HSBV của chế phẩm enzyme
Khảo sát nồng độ giống bổ sung thích hợp nhất
Khảo sát thời gian nuôi ủ đến HSBV của chủng T.koningii
Khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí đến HSBV của chủng T.koningii
Khảo sát ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng tạo bào tử của
Thu nhận sinh khối nấm sợi
T.koningii bằng lên men bán rắn Ảnh hưởng của độ ẩm Ảnh hưởng của cơ chất Ảnh hưởng của nồng độ dinh dưỡng Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Khảo sát độ ẩm tiêu theo thời gian ngâm
Sử dụng chế phẩm vi sinh T.koningii
Sử dụng chế phẩm enzyme
Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm
Ứng dụng chế phẩm enzyme thương mại trong sản xuất tiêu sọ
2.5.1 Khảo sát độ ẩm hạt tiêu theo thời gian ngâm
– Cho 10 g hạt tiêu đen được cho vào chén và được đặt vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ
105 o C cho đến khi khối lượng hạt tiêu không đổi
Để thực hiện thí nghiệm, cho 10 gram hạt tiêu đen vào cốc và thêm 50 ml nước Ngâm hạt tiêu trong các khoảng thời gian khác nhau như 2, 4, 6 và 8 giờ Sau mỗi thời gian ngâm, loại bỏ nước và cân hạt tiêu, ghi nhận khối lượng tương ứng Tiếp tục ngâm cho đến khi hạt tiêu đạt trạng thái bão hòa.
– Độ ẩm hạt tiêu đen được tính theo công thức sau:
W: độ ẩm hạt tiêu (%) m3: khối lượng ban đầu của hạt tiêu (g) m4: khối lượng hạt tiêu sau khi ngâm (g)
100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo phần trăm (%)
2.5.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen bằng enzyme
Hạt tiêu đen cần được ngâm nước trước khi xử lý với enzyme thương phẩm và chế phẩm vi sinh, nhằm loại bỏ đất, bụi và vi sinh vật bám trên bề mặt Quá trình này giúp trương nở lớp vỏ ngoài, tăng khả năng tiếp xúc với enzyme và tạo độ ẩm thích hợp cho sự phát triển của nấm mốc Trichoderma.
Hiệu suất bóc vỏ (%) = ∑ số hạt bóc vỏ hoàn toàn
∑ số hạt có trong mẫu × 100%
2.5.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen
- Mục tiêu: chọn được tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm tối ưu nhất cho HSBV cao nhất
– Yếu tố cố định: khối lượng tiêu 20 g, thời gian ngâm 24 giờ
– Yếu tố khảo sát: tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm lần lượt là (1 : 2), (1 : 3), (1 : 4),
Sơ đồ 2.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu : nước ngâm đến HSBV hạt tiêu đen
2.5.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen
- Mục tiêu: chọn được thời gian ngâm nước thích hợp nhất cho hiệu suất bóc vỏ cao nhất
Ngâm nguyên liệu: nước với các tỷ lệ khác nhau
Xác định HSBV (%) Xát vỏ bằng tay 3 phút Sau 24 giờ
– Yếu tố cố định: khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu:nước ngâm sử dụng kết quả thích hợp thu được ở thí nghiệm 2.5.2.1
– Yếu tố khảo sát: thời gian ngâm nước là 12 giờ, 15 giờ, 18 giờ ,21 giờ và 24 giờ
Sơ đồ 2.3 Ảnh hưởng của thời gian ngâm nước đến HSBV hạt tiêu đen
2.5.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ thanh trùng đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật
- Mục tiêu: chọn được nhiệt độ thanh trùng thích hợp nhất để cho hiệu suất bóc vỏ cao nhất
- Yếu tố cố định: khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu:nước ngâm và thời gian ngâm thích hợp sử dụng kết quả ở thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2
– Yếu tố khảo sát: nhiệt độ thanh trùng là 70 o C, 80 o C và 90 o C
Xát vỏ bằng tay 3 phút
Xác định hiệu suất tróc vỏ (%) Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ thích hợp trong các khoảng thời gian
12 giờ 15 giờ 18 giờ 21 giờ 24 giờ
Sơ đồ 2.4 Khảo sát nhiệt độ thanh trùng
2.5.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian thanh trùng đến khả năng tiêu diệt vi sinh vật
- Mục tiêu: chọn được thời gian thanh trùng thích hợp nhất để cho hiệu suất bóc vỏ cao nhất
Trong nghiên cứu, các yếu tố cố định bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm, và thời gian ngâm được xác định dựa trên kết quả của thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Ngoài ra, quá trình thanh trùng được thực hiện ở nhiệt độ phù hợp theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.3.
– Yếu tố khảo sát: thời gian thanh trùng là 10 phút, 20 phút và 30 phút
Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ và thời gian thích hợp
Rửa sạch và bổ sung nước tỷ lệ 1 : 1,5
Xác định TSVKHK (CFU/ml) Thanh trùng 10 phút ở các nhiệt độ
Sơ đồ 2.5 Khảo sát thời gian thanh trùng
2.5.2.5 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen
- Mục tiêu: chọn được nồng độ chế phẩm enzyme thích hợp để cho hiệu suất bóc vỏ cao nhất
Yếu tố cố định trong thí nghiệm bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm, và thời gian ngâm phù hợp dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Ngoài ra, quá trình thanh trùng cần được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, căn cứ vào kết quả thu được từ thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4.
– Yếu tố khảo sát: nồng độ chế phẩm enzyme (v/w) thay đổi lần lượt là 1%, 2%, 3%, 4%, 5% và 6 %
Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ và thời gian thích hợp
Rửa sạch và bổ sung nước tỷ lệ 1: 1,5
Xác định TSVKHK (CFU/ml) Thanh trùng ở nhiệt độ thích hợp trong các khoảng thời gian
Sơ đồ 2.6 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme đến HSBV hạt tiêu đen
Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ và thời gian thích hợp
Rửa sạch và bổ sung nước tỷ lệ 1: 1,5
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Làm nguội về 30 - 40 0 C Ủ ở 45 0 C trong 24 giờ
Xát vỏ bằng tay 3 phút
Bổ sung chế phẩm enzyme với các nồng độ (v/w)
2.5.2.6 Ảnh hưởng của pH đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme
- Mục tiêu: chọn được pH thích hợp để cho hiệu suất bóc vỏ cao nhất
Trong nghiên cứu này, các yếu tố cố định bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu và nước ngâm, cùng thời gian ngâm phù hợp theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Ngoài ra, quá trình thanh trùng được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian thích hợp dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4 Cuối cùng, enzyme được bổ sung theo các kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.5.
– Yếu tố khảo sát: pH thay đổi lần lượt là 3, 4, 5 và 6
Xát vỏ bằng tay 3 phút
Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ và thời gian thích hợp
Rửa sạch và bổ sung nước tỷ lệ 1: 1,5
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Bổ sung enzyme ở nồng độ thích hợp nhất Ủ 45 0 C trong 24 giờ Thay đổi pH ớ các giá trị pH = 3 pH = 4 pH = 5 pH = 6
Sơ đồ 2.7 Ảnh hưởng của pH đến HSBV hạt tiêu đen
2.5.2.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme
Mục tiêu của nghiên cứu là xác định nhiệt độ ủ tối ưu nhằm đạt hiệu suất bóc vỏ cao nhất Trong đó, các yếu tố cố định bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm và thời gian ngâm phù hợp, dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Đồng thời, quá trình thanh trùng sẽ được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4 Việc bổ sung enzyme cũng sẽ được căn cứ vào kết quả thí nghiệm 2.5.2.5, và cuối cùng, pH sẽ được điều chỉnh về mức tối ưu nhất dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.6.
- Yếu tố khảo sát: nhiệt độ thay đổi lần lượt là 35 o C, 45 o C và 55 o C
Xát vỏ bằng tay 3 phút
Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ và thời gian thích hợp
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Chỉnh pH tối thích Rửa sạch và bổ sung nước tỷ lệ 1: 1,5
Bổ sung enzyme ở nồng độ thích hợp nhất Đem ủ trong 24 giờ ở các nhiệt độ
Sơ đồ 2.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến HSBV hạt tiêu đen
2.5.2.8 Ảnh hưởng của thời gian ngâm ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chế phẩm enzyme
- Mục tiêu: chọn được thời gian ngâm ủ thích hợp để cho hiệu suất bóc vỏ cao nhất
Trong quá trình nghiên cứu, các yếu tố cố định bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm, và thời gian ngâm được xác định dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Thanh trùng được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian phù hợp theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4 Enzyme được bổ sung dựa trên kết quả thí nghiệm 2.5.2.5, trong khi pH được điều chỉnh về mức tối ưu dựa trên kết quả thí nghiệm 2.5.2.6 Cuối cùng, quá trình ủ được thực hiện ở nhiệt độ tối ưu theo kết quả thí nghiệm 2.5.2.7.
– Yếu tố khảo sát: thời gian ủ lần lượt là 24 giờ và 48 giờ và 72 giờ
Sơ đồ 2.9 Ảnh hưởng của thời gian ngâm ủ đến HSBV hạt tiêu đen
Bổ sung enzyme ở nồng độ thích hợp nhất
Ngâm ủ ở nhiệt độ tối ưu với các khoảng thời gian
Xát vỏ bằng tay 3 phút
Ngâm nguyên liệu : nước với tỷ lệ và thời gian thích hợp
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp
Chỉnh pH tối thích Rửa sạch và bổ sung nước tỷ lệ 1: 1,5
Ứng dụng chế phẩm vi sinh T.koningii trong sản xuất tiêu trắng
2.6.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của T koningii trên môi trường lên men bán rắn
2.6.1.1 Khảo sát nồng độ giống bổ sung thích hợp
- Mục tiêu: chọn ra nồng độ giống tốt nhất
Yếu tố cố định trong thí nghiệm bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm và thời gian ngâm phù hợp dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Quá trình thanh trùng được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo kết quả của thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4 Cuối cùng, bổ sung chủng T koningii, thực hiện ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày.
– Yếu tố khảo sát: bổ sung mật độ bào tử chủng Trichoderma koningii thay đổi lần lượt là 10 4 , 10 5 , 10 6 và 10 7 CFU/g
Sơ đồ 2.10 Ảnh hưởng của nồng độ giống bổ sung đến HSBV của Trichoderma koningii
2.6.1.2 Khảo sát thời gian nuôi ủ đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng Trichoderma koningii
- Mục tiêu: chọn ra thời gian nuôi ủ tốt nhất cho hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen cao nhất
Yếu tố cố định trong thí nghiệm bao gồm khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm và thời gian ngâm phù hợp, dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Ngoài ra, quá trình thanh trùng cần được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian thích hợp, theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4, cùng với việc bổ sung chủng.
Ngâm nguyên liệu : nước tỷ lệ và thời gian thích hợp
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp nhất
Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày
Rửa sạch, xát vỏ bằng tay 5 phút
Bổ sung bào tử của chủng T koningii với mật độ (CFU/g)
T koningii, nhiệt độ phòng, bổ sung nồng độ giống thích hợp sử dụng kết quả của thí nghiệm 2.6.1.1
– Yếu tố khảo sát: thời gian nuôi ủ lần lượt là 24 giờ, 32 giờ, 48 giờ, 60 giờ
Sơ đồ 2.11 Ảnh hưởng của thời gian nuôi ủ đến HSBV của Trichoderma koningii
Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong các khoảng thời gian
Ngâm nguyên liệu: nước tỷ lệ và thời gian thích hợp
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp nhất
Bổ sung bào tử của chủng Trichoderma koningii với mật độ thích hợp
Rửa sạch, xát vỏ bằng tay 5 phút
Xác định hiệu suất bóc vỏ (%)
2.6.1.3 Khảo sát ảnh hưởng của độ thoáng khí đến hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen của chủng Trichoderma koningii
- Mục tiêu: chọn ra điều kiện nuôi ủ tốt nhất cho hiệu suất bóc vỏ hạt tiêu đen là cao nhất
Để đạt được kết quả tối ưu trong quá trình thí nghiệm, cần chú ý đến các yếu tố cố định như khối lượng mẫu 20 g, tỷ lệ nguyên liệu với nước ngâm, và thời gian ngâm phù hợp dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.1 và 2.5.2.2 Bên cạnh đó, quá trình thanh trùng cần được thực hiện ở nhiệt độ và thời gian thích hợp theo kết quả từ thí nghiệm 2.5.2.3 và 2.5.2.4 Việc bổ sung chủng T koningii cũng cần được thực hiện ở nhiệt độ phòng, cùng với nồng độ giống và thời gian nuôi ủ phù hợp, dựa trên kết quả của thí nghiệm 2.6.1.1 và 2.6.1.2.
- Yếu tố khảo sát: ủ kín trong túi nilon và ủ trong hộp nhựa
Sơ đồ 2.12 Ảnh hưởng của độ thoáng khí đến HSBV hạt tiêu đen
2.6.2 Phương pháp lên men bán rắn thu nhận bào tử nấm sợi T koningii
Nấm sợi Trichoderma koningii được nuôi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng với môi trường PGA ở nhiệt độ phòng trong 3 – 5 ngày Sau đó, bào tử được rửa sạch từ bề mặt thạch nghiêng bằng dung dịch nước muối sinh lý có chứa 0,1% Tween 80 vô trùng trước khi tiến hành cấy.
Ngâm nguyên liệu : nước tỷ lệ và thời gian thích hợp
Thanh trùng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp nhất
Bổ sung bào tử của chủng Trichoderma koningii với mật độ thích hợp Ủ trong thời gian thích hợp nhất
Rửa sạch, xát vỏ bằng tay 5 phút
Nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong điều kiện
Nuôi ủ bào tử trong hộp nhựa hoặc túi nilon là phương pháp hiệu quả để phát triển môi trường nhân giống lúa Sau khoảng 5 đến 7 ngày, quá trình này sẽ cho ra bào tử, phục vụ cho các thí nghiệm giống lúa tiếp theo.
Phối trộn trấu và cám mì theo tỷ lệ phù hợp, sau đó làm ẩm bằng nước có bổ sung dung dịch dinh dưỡng Quá trình lên men diễn ra trong các bình tam giác 250 ml chứa 10 g môi trường, được hấp khử trùng ở 121 oC trong 20 phút và sau đó làm nguội Tiếp theo, bổ sung dịch huyền phù bào tử với mật độ thích hợp dựa trên kết quả từ thí nghiệm 2.6.1.1, và nuôi ủ ở nhiệt độ phòng trong thời gian cần thiết.
Để xác định thành phần môi trường và điều kiện tối ưu cho sự hình thành bào tử của chủng nấm sợi Trichoderma, nghiên cứu đã được thực hiện trên môi trường trấu – cám mì với các tỷ lệ khác nhau (3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3) Độ ẩm môi trường được điều chỉnh trong khoảng 45 – 65%, nồng độ dinh dưỡng được phân loại từ X1 đến X5, và thời gian nuôi từ 5 đến 10 ngày.
Bào tử nấm sợi được thu nhận thông qua quá trình huyền phù trong nước muối sinh lý có chứa Tween 80 0,1% vô trùng, và được xác định bằng buồng đếm hồng cầu.
2.7 Phương pháp bố trí và xử lý số liệu thực nghiệm
Tất cả thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, ba lần lặp lại
Số liệu thu được từ các nghiệm thức đã được phân tích bằng phương pháp ANOVA một chiều (One-Way ANOVA) để đánh giá sự khác biệt giữa chúng, sử dụng phần mềm Excel 2007 với mức ý nghĩa P ≤ 0,05 Nguồn tham khảo: Hoàng Trọng (2002), "Xử lý dữ liệu nghiên cứu với SPSS for Windows", NXB Thống kê, Hà Nội.
Phương pháp bố trí và xử lý số liệu thực nghiệm
3.1 Kết quả khảo sát độ ẩm hạt tiêu theo thời gian ngâm
Khảo sát độ ẩm hạt tiêu được thực hiện bằng cách giữ nguyên lượng nước và trọng lượng hạt tiêu, trong khi thay đổi thời gian ngâm từ 2 đến 20 giờ cho đến khi đạt độ bão hòa Mỗi loại tiêu có khả năng hút nước khác nhau, do đó cần khảo sát độ ẩm để xác định thời gian ngâm phù hợp cho quá trình lên men Độ hút nước của tiêu, được xác định khi ngâm mẫu trong nước ở nhiệt độ 20 - 30 độ C, phản ánh khả năng hút và giữ nước của hạt tiêu Khi áp suất trong hạt tiêu bằng áp lực xung quanh, hạt tiêu đạt đến độ bão hòa ẩm, tức là không thể hấp thu nước thêm nữa.
– Độ ẩm trong hạt tiêu tăng dần theo thời gian ngâm trong nước Tiêu hút nước