ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LÊ THÀNH LONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GENE VẠN TIỀM NĂNG ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO GỐC PHƠI BỊ LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC Tp Hồ Chí Minh – 2016 ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LÊ THÀNH LONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GENE VẠN TIỀM NĂNG ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO GỐC PHƠI BỊ Chun ngành: Sinh lý học Người Động vật Mã số: 62 42 30 01 Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Văn Thuận Phản biện 2: PGS.TS Vũ Thị Nhung Phản biện 3: PGS.TS Lê Văn Đông Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Trọng Ngữ Phản biện độc lập 2: TS Nguyễn Trọng Tuệ NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Hoàng Nghĩa Sơn PGS.TS.BS Huỳnh Nghĩa Tp Hồ Chí Minh – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Những kết nghiên cứu hồn tồn chưa cơng bố tác giả khác Lê Thành Long i LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Hồng Nghĩa Sơn, Thầy ln tận tâm dẫn, tạo điều kiện cho em học tập, nghiên cứu hoàn chỉnh đề tài Em xin gởi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS.BS Huỳnh Nghĩa, Thầy cho em lời khuyên định hướng quan trọng suốt trình em thực đề tài Em xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Thuận GS.TS Bùi Hồng Thủy, Thầy, Cơ dìu dắt em bước đường nghiên cứu khoa học Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đỗ Minh Sĩ, người Thầy, người Anh cho em lời khuyên, kiến thức bổ ích khoa học sống Anh xin cảm ơn Chung, em giúp đỡ anh nhiều trình thực đề tài Em xin cảm ơn Thầy, Cô, bạn đồng nghiệp, bạn sinh viên động viên giúp đỡ em q trình cơng tác nghiên cứu Con xin cảm ơn ba, mẹ, em bên con, động viên lúc khó khăn Cảm ơn tất cả! ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình, đồ thị x PHẦN MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tế bào gốc phôi 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Các đặc tính tế bào gốc phơi 1.1.3 Các dịng tế bào gốc phơi .6 1.1.4 Biến đổi di truyền ngồi nhân tế bào gốc phơi 1.1.5 Điều kiện thu nhận nuôi cấy tế bào gốc phôi .8 1.1.6 Quần thể tế bào gốc phôi 10 1.2 Các đường tín hiệu tế bào gốc phơi 11 1.2.1 Con đường tín hiệu LIF-Jak STAT 14 1.2.2 Con đường siêu họ TGF-β 16 1.2.3 Con đường FGF2 20 1.2.4 Con đường WNT 22 1.2.5 Con đường PI3K 24 1.2.6 Con đường họ SRC Tyrosine Kinases 25 1.3 Vai trò gene vạn tiềm 26 1.3.1 Oct4 26 1.3.2 Sox2 26 1.3.3 C-myc 27 iii 1.3.4 Klf4 27 1.3.5 Nanog 28 1.3.6 Lin-28 28 1.4 Đánh giá tính vạn tiềm tế bào gốc phơi bị 29 1.4.1 Đánh giá marker vạn tiềm 30 1.4.2 Thử nghiệm biệt hóa in vitro 30 1.5 Những nghiên cứu tế bào gốc phơi bị 32 1.5.1 Trên giới 32 1.5.2 Việt Nam 34 1.6 Ứng dụng tế bào gốc phôi 34 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Vật liệu 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 38 2.2.1 Cải thiện q trình ni cấy phơi bị giai đoạn tiền làm tổ 38 2.2.1.1 Ni chín trứng bị 39 2.2.1.2 Thụ tinh in vitro 41 2.2.1.3 Nuôi phôi giai đoạn tiền làm tổ 41 2.2.1.4 Xác định số lượng tế bào phôi 42 2.2.1.5 Phương pháp thống kê 42 2.2.2 Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc phơi bị 42 2.2.2.1 Loại bỏ zona pellucida 43 2.2.2.2 Tạo lớp tế bào nuôi dưỡng 44 2.2.2.3 Nuôi cấy tế bào gốc phôi 45 2.2.2.4 Xác định biểu gene vạn tiềm 46 2.2.2.5 Phương pháp thống kê 48 2.2.3 Đánh giá biểu gene vạn tiềm tế bào gốc phơi bị 49 2.2.3.1 Xác định biểu alkaline phosphatase 50 iv 2.2.3.2 Sự biểu gene vạn tiềm mức phiên mã 50 2.2.3.3 Sự biểu gene vạn tiềm mức dịch mã 53 2.2.3.4 Thử nghiệm khả biệt hóa 53 2.2.3.5 Đánh giá q trình methyl hóa 56 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 60 3.1 Sản xuất phơi bị in vitro 60 3.1.1 Ảnh hưởng LIF lên phát triển phơi bị giai đoạn tiền làm tổ 60 3.1.2 Ảnh hưởng LIF lên chất lượng phơi bị giai đoạn phơi nang 63 3.2 Thu nhận nuôi cấy tế bào gốc phôi bò 65 3.2.1 Thử nghiệm tác nhân loại bỏ zona pellucida phơi bị 65 3.2.2 Thử nghiệm phân lập ni cấy tế bào gốc phơi bị từ phôi nang 69 3.3 Đánh giá biểu gene vạn tiềm tế bào gốc phôi bò 80 3.3.1 Đánh giá biểu Alkaline phosphatase 80 3.3.2 Đánh giá biểu gene vạn tiềm mức phiên mã 81 3.3.3 Đánh giá trình methyl hóa gene vạn tiềm 87 3.3.3.1 Q trình methyl hóa gene Nanog 87 3.3.3.2 Q trình methyl hóa gene Oct4 88 3.3.4 Đánh giá biểu protein vạn tiềm 91 3.3.5 Thử nghiệm khả biệt hóa thể phơi tế bào gốc phơi bị 96 KẾT LUẬN 98 ĐỀ NGHỊ 99 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO 101 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ASCs Adult stem cells b-ME beta mercaptoethanol BMP4 Bone Morphogenetic Protein BSA Bovine Serum Albumin CpG Cytosine phosphate Guanine DAPI 4'-6-Diamidino-2-phenylindole DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EGF Epidermal Growth Factor ERK Extracellular-signal-Regulated Kinases ESCs Embryonic Stem Cells Fert-TALP Fertilization Tyrode's Albumin Lactate Pyruvate FGF2 Fibroblast Growth Factor FGFR Fibroblast Growth Factor Receptor FITC Fluorescein isothiocyanate FRS2 Fibroblast growth factor Receptor Substrate FSH Follicle Stimulating Hormon GP130 Glycoprotein 130 GSK-3β Glycogen synthase kinases β ICM Inner Cell Mass IL-6 Interleukin-6 iPSCs induced Pluripotent Stem Cells IU International Unit vi STAT3 Signal Transducer and Activator of Transcription Kfl4 Krüppel-like factor LH Lutenizing Hormon LIF Leukemia Inhibitory Factor MAP kinases Mitogen-activated protein kinase MEF Mouse Embryonic Fibroblast mRNA Messenger Ribonucletic Acid mTOR mammalian Target Of Repamycin Nanog Tir Na Nog Oct4 Octamer-binding transcription factor PBS Phosphate Balanced Solution PCR Polymerase Chain Reaction PE Phycoerythrin PH Pleckstrin Homology domain PI Propidium Iodide PI3K Phosphoinositide 3-kinases PVA PolyVinylAlcohol MEK ERK RT Mitogen-activated Protein/Extracellular Signal-regulated Kinase Extracellular signal regulated Kinase Reverse Transcription Smad Sma and Mad related family Sof Synthetic oviductal fluid Sox2 Sex-determining region Y-box Ssea1 Stage-Specific Embryonic Antigen TGF-β Transforming Growth Factor beta TRA-1 Tumor Rejection Antigen-1 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi .9 Bảng 2.1 Trình tự mồi cho phản ứng real-time RT-PCR khuếch đại mRNA gene Oct4 Nanog 47 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng real-time RT-PCR định lượng mRNA gene Oct4 Nanog 47 Bảng 2.3 Chu kì nhiệt phản ứng real-time RT-PCR định lượng mRNA gene Oct4 Nanog 48 Bảng 2.4 Trình tự mồi cho phản ứng real-time RT-PCR gene Oct4, Nanog, Sox2, C-myc 51 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng real-time RT-PCR định lượng mRNA gene Oct4, Nanog, Sox2, C-myc 52 Bảng 2.6 Chu kì nhiệt phản ứng real-time RT-PCR định lượng mRNA gene Oct4, Nanog, Sox2, C-myc 52 Bảng 2.7 Trình tự mồi khuếch đại gene đặc trưng cho lớp mầm phôi 54 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng RT-PCR xác định mRNA gene đặc trưng cho lớp mầm phôi 55 Bảng 2.9 Chu kì nhiệt phản ứng RT-PCR xác định mRNA gene đặc trưng cho lớp mầm phôi 55 Bảng 2.10 Trình tự mồi khuếch đại vùng CpG gene Oct4 Nanog 58 Bảng 2.11 Thành phần phản ứng khuếch đại vùng trình tự CpG gene Oct4 Nanog 58 Bảng 2.12 Chu kì phản ứng khuếch đại vùng trình tự CpG gene Oct4 Nanog 59 Bảng 3.1 Ảnh hưởng nồng độ LIF lên phát triển phơi bị 62 Bảng 3.2 Số lượng tế bào phôi nang 64 Bảng 3.3 Kết loại zona pellucida 66 viii - Chuẩn hóa giá trị ∆CT mẫu thí nghiệm với ∆CT mẫu chuẩn ∆∆CT = ∆CT(mẫu) - ∆CT(chuẩn) - Cuối cùng, tỉ lệ biểu tính theo cong thức Tỉ lệ biểu = 2-∆∆Ct Kết thu tăng (hay giảm) theo tỷ lệ gene đích mẫu thí nghiệm tương quan với mẫu chuẩn chuẩn hóa theo biểu gen tham chiếu Chuẩn hóa biểu gene đích theo gene tham chiếu bù đắp cho khác biệt lượng tế bào mẫu 3.3 Đánh giá q trình methyl hóa gene đa tiềm Kết khuếch đại vùng trình tự gene oct4 nanog mơ tả hình 34-37 Hình 34 Kết PCR khuếch đại gene oct4 nanog Lane 1: thang DNA 100 bp, Lane 2-6: mẫu tế bào gốc phôi 1-5 (cấy chuyền lần 1), Lane 7-11: mẫu tế bào gốc phôi 1-5 (cấy chuyền lần 3), Lane 12-16: mẫu nguyên bào sợi bò trưởng thành 1-5, Lane 17-18: mẫu tế bào gốc phôi 1-2 (cấy chuyền lần 1-sản phẩm khuếch đại gene nanog) PL-31 Hình 35 Kết PCR khuếch đại gene nanog Lane 1: thang DNA 100 bp, Lane 3-5: mẫu tế bào gốc phôi 3-5 (cấy chuyền lần 1), Lane 6-9: mẫu tế bào gốc phơi 1-4 (cấy chuyền lần 3) Hình 36 Kết PCR khuếch đại gene nanog Lane 1: thang DNA 100 bp, Lane 2: mẫu tế bào gốc phôi (cấy chuyền lần 3), Lane 3-5: mẫu nguyên bào sợi bị trưởng thành 1-3 Hình 37 Kết PCR khuếch đại gene nanog Lane 1: thang DNA 100 bp, Lane 2-3: mẫu nguyên bào sợi bò trưởng thành 3-5 Kết giải trình tự vùng methyl hóa gene nanog a Cấy chuyền lần PL-32 Hình 38 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 39 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 40 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số PL-33 Hình 41 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 42 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số b Cấy chuyền lần Hình 43 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số PL-34 Hình 44 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 45 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 46 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số PL-35 Hình 47 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số c Đối chứng (nguyên bào sợi bị trường thành- bovine adult fibroblast) Hình 48 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số PL-36 Hình 49 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 50 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 51 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Hình 52 Trình tự vùng methyl hóa gene nanog mẫu số Kết giải trình tự vùng methyl hóa gene oct4 a Cấy chuyền lần PL-37 Hình 53 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 54 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 55 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số PL-38 Hình 56 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 57 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số b Cấy chuyền lần Hình 58 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số PL-39 Hình 59 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 60 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 61 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số PL-40 Hình 62 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số c Đối chứng Hình 63 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số PL-41 Hình 64 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 65 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 66 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Hình 67 Trình tự vùng methyl hóa gene oct4 mẫu số Sự biểu oct4 nanog trứng bò Trứng bò giai đoạn túi mầm sử dụng làm đối chứng việc xác định biểu protein đa tiềm oct4 nanog PL-42 Hình 68 Sự biểu protein oct4 nanog trứng bò giai đoạn túi mầm Môi trường thụ tinh môi truờng nuôi phơi bị 5.1 Mơi trường thụ tinh FERT-TALP - NaHCO3 25 mM - Na pyruvate 0,2 mM - CaCl2.2H2O mM - Glucose mM - Na lactate 10 mM - MgCl2.6H2O 0,5 mM - NaCl 114 mM - KCl 3,2 mM - KH2PO4 0,3 mM - BSA mg/ml - Lọc vô trùng bảo quản 4oC, sử dụng tuần 5.2 Môi trường nuôi phôi SOFaa Chuẩn bị môi trường Stock: Môi trường Stock B (250 mM NaHCO3): - 1,05 g NaHCO3 - Bổ sung Phenol red - Bổ sung nước cất đủ 50 ml (dự trữ 4oC) Môi trường Stock C (33mM pyruvate) - 0.036 g pyruvic acid - Bổ sung nước đủ 10 ml - Bảo quản 4oC PL-43 Môi trường Stock D (171mM CaCl2.2H2O) - 1,26 g CaCl2.2H2O - Bổ sung nước cất đủ 50 ml - Bảo quản 4oC Môi trường Stock G (60 mM Glucose) - 0,54 g glucose - Bổ sung nước cất đủ 50 ml - Bảo quản 4oC Môi trường Stock GLN (10 mM L-Glutamine) - ,0438 g L-Glutamine - Bổ sung nước cất đủ 30 ml - Bảo quản 4oC Môi trường Stock L (330 mM Na lactate) - 11,75 ml Na lactate (60 % syrup) - Bổ sung nước cất đủ 250 ml - Bảo quản 4oC Môi trường Stock M (MgCl2.6H2O) - 2.0 g MgCl2.6H2O - Bổ sung nước cất đủ 200 ml - Bảo quản 4oC Môi trường Stock S2 - 6.29 g NaCl - 0.534 g KCl - 0.162 KH2PO4 - 0.025 g Kanamycin - Bổ sung nước cất đủ 100 ml - Bảo quản 4oC Môi trường nuôi phôi: - Stock S2 10 ml - Stock B 10 ml - Stock C ml - Stock D ml - Stock M ml - Stock L ml - Stock G 2,5 ml - Stock GLN 10 ml - Non essential amino acids ml - Essential amino acid ml - Nước cất 60,5 ml - Chỉnh pH 7.4 PL-44 - Bổ sung 0,8 g BSA (FAF) Lọc vô trùng bảo quản 4oC, dùng tuần 5.3 Môi trường nuôi cấy tế bào gốc phôi bị Thành phần mơi trường ni cấy tế bào gốc phơi bị bao gồm: Knock-out DMEM (Gibco) chứa 20 % Knock-out Serum Replacement (Gibco), % pen/strep (Gibco), 200 µM mercaptoethanol (Sigma), 1% L-glutamine (Gibco), % Non-essencial amino acid (Gibco), % nucleoside (0,73 g/L cytidine, 0,85 g/L guanosine, 0,73 g/L uridine, 0,8 g/L adenosine, 0,24 g/L thymidine) LIF nồng độ khác PL-45 ... tài ? ?Nghiên cứu phân lập, ni cấy đánh giá biểu gene vạn tiềm đặc trưng tế bào gốc phơi bị” thực với mong muốn cải thiện trình phân lập, ni cấy tế bào gốc phơi bị tìm mối quan hệ gene vạn tiềm. .. ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  LÊ THÀNH LONG NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ SỰ BIỂU HIỆN CỦA CÁC GENE VẠN TIỀM NĂNG ĐẶC TRƯNG CỦA TẾ BÀO GỐC PHƠI BỊ Chun ngành: Sinh lý học Người Động... cấy tế bào gốc phôi Điều kiện nuôi cấy thường giống nuôi cấy thiết lập cho tế bào gốc phôi chuột, tế bào gốc phôi khỉ [120] tế bào gốc phôi người [120] Tuy nhiên, tất nhân tố cần cho nuôi cấy tế