BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI - - NGUYỄN THỊ THÙY SAO Mã sinh viên: 1101436 NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT WESTERN BLOT ĐỂ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN Ở MÔ GAN CHUỘT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2016 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ THÙY SAO Mã sinh viên: 1101436 NGHIÊN CỨU TRIỂN KHAI KỸ THUẬT WESTERN BLOT ĐỂ ĐÁNH GIÁ BIỂU HIỆN GEN Ở MÔ GAN CHUỘT KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: PGS TS Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện: Bộ môn hóa sinh Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm khoa học công nghệ Việt Nam HÀ NỘI - 2016 LỜI CẢM ƠN Trước hết em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc kính trọng tới ban giám hiệu Trường Đại học Dược Hà Nội, thầy cô trường tạo điều kiện truyền thụ kiến thức quý báu để em hoàn thành khóa học Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Phùng Thanh Hương, người thầy tâm huyết tạo điều kiện tốt để em hoàn thành khóa luận Cô tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em trình nghiên cứu khoa học lẫn sống, nguồn động lực lớn giúp em vượt qua khó khăn trình hoàn thành khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến chị NCS Hà Thị Thu, chị bên cạnh hướng dẫn, giúp đỡ, truyền thụ kinh nghiệm quý báu đưa lời khuyên để em đưa lựa chọn đắn Xin cảm ơn anh, chị, bạn công tác Phòng Vi sinh phân tử -Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho em trình thực khóa luận tốt nghiệp Cuối xin cảm ơn gia đình, anh chị em, bạn bè ủng hộ, khích lệ giúp đỡ em suốt trình học tập trường thời gian thực khóa luận Do thời gian hiểu biết thân có hạn nên khóa luận khó tránh khỏi sai sót Em mong nhận lời góp ý, bảo thầy cô để em hoàn thiện khóa luận Hà Nội, tháng năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thùy Sao MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG I :TỔNG QUAN 1.1 Đại cương kỹ thuật Western blot 1.1.1 Định nghĩa 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu 1.1.3 Vai trò, ứng dụng 1.1.4 Nguyên tắc 1.1.5 Các giai đoạn 1.1.6 Ứng dụng Western blot để đánh giá biểu gen 12 1.2 Đại cương AMPK 12 1.2.1 Giới thiệu nguồn gốc, cấu trúc 12 1.2.2 Vai trò AMPK chuyển hóa 14 1.2.3 Một số nghiên cứu AMPK tế bào 19 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị đối tượng nghiên cứu 20 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Hóa chất 20 2.1.3 Thiết bị 21 2.1.4 Dụng cụ 21 2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu 21 2.2.1 Khảo sát phương pháp tách chiết protein khỏi mô gan chuột 22 2.2.2 Phương pháp Western blot 23 2.2.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian ép phim 27 2.2.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng thời gian ngâm phim thuốc màu 27 2.2.5 Phương pháp khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp Western blot protein AMPKα1 28 2.2.6 Phương pháp khảo sát mức độ biểu AMPK lô khác 28 2.2.7 Phương pháp biểu diễn xử lý số liệu 29 CHƯƠNG III: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN 30 3.1 Kết 30 3.1.1 Kết khảo sát số thông số trình kỹ thuật Western blot 30 3.1.2 Kết sử dụng Western blot để sơ đánh giá mức độ biểu AMPK tế bào gan chuột 34 3.2 Bàn luận 38 3.2.1 Bàn luận kết khảo sát số thông số trình kỹ thuật Western blot 38 3.2.2 Về kết sử dụng Western blot để sơ đánh giá mức độ biểu AMPK tế bào gan chuột 41 KẾT LUẬN 44 ĐỀ XUẤT 44 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ACC1 Acetyl CoA carboxylase AMPK Adenosine monophosphate–activated protein kinase AP Alkaline phosphatase APS Ammonium persulphat AS160 Akt substrate of 160kDa BPB Bromophenol blue BSA Bovine serum albumin CaMKKβ Calmodulin-mediated kinase kinase β CBM Carbohydrat-binding modul CBS Cystathionine-β-synthase CCD Charge Coupled Device CPT1 Carnatine-acylcarnitine translocase ĐTĐ Đái tháo đường ECL Enhanced chemiluminescence FA Fatty acid FASN Fatty acid synthase GAPDH Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase GBD Glycogen-binding domain GEF GLUT4 enhancer factor GLUT4 Glucose transporter type HDAC Histon deacetylase HMGCoA Hydroxymethylglutaryl CoA HMGCR Hydroxymethylglutaryl CoA reductase HRP Horseradish peroxidase IRS-1 Insulin receptor substrate LKB1 Liver kinase B1 MEF2 Myocyte enhancer factor mTORC1 Mammalian target of rapamycin complex pAMPK AMPK phosphoryl hóa PBS Phosphate buffered saline PGC-1α Peroxisom proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α PI3K Phosphatidylinositol 3- kinase PMSF Phenylmethylsulfonyl fluorid PVDF Polyvinylidine difluorid Rab GAPs Rab GTPase-activating proteins SDS Sodium dodecyl sulfat SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis Ser Serin SIRT1 Sirtuin SREBP1 Sterol regulatory element-binding protein-1 TAK1 Transforming growth factor-bactivated kinase TBC1D1 (Tre-2/USP6, BUB2, Cdc16) Domain Family, Member TBS Tris/Tris buffered salin Temed Tetramethylethylenediamin Thr Threonin TSC Tuberous sclerosis complex TTBS Tween Tris/Tris buffered salin ULK1 UNC-51 like kinase DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Công thức cho gel 24 Bảng 3.1: Nồng độ protein (mg/ml) thu phương pháp chiết tách khác 30 Bảng 3.2: Kết cường độ tín hiệu hóa phát quang thí nghiệm khảo sát khoảng tuyến tính AMPKα1 35 Bảng 3.3: Cường độ tín hiệu lô chuột 37 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, BIỂU ĐỒ Hình 1.1: Mô hình điện di gel Hình 1.2: Vai trò SDS Hình 1.3: Mô hình điện dịch chuyển Hình 1.4: Kháng thể thứ cấp giúp khuếch đại tín hiệu Hình 1.5: Phát tín hiệu nhờ phát quang hóa học Hình 1.6: Phát tín hiệu nhờ hóa huỳnh quang 10 Hình 1.7: Cấu trúc tiểu đơn vị AMPK 14 Hình 1.8: Vai trò AMPK chuyển hóa 15 Hình 1.9: Vai trò AMPK chuyển hóa lipid glucose 18 Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu…………………………………… ………22 Hình 3.2: Cường độ tín hiệu hóa phát quang sau thời gian ép phim khác 32 Hình 3.3: Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu với thời gian ngâm phim thuốc màu khác 33 Hình 3.4: Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu thí nghiệm khảo sát khoảng tuyến tính AMPKα1 35 Hình 3.5 Mối tương quan cường độ tín hiệu AMPKα1và lượng protein tổng số 36 Hình 3.6: Cường độ tín hiệu hóa phát quang thu thí nghiệm khảo sát biểu AMPK lô chuột 36 Hình 3.7: So sánh mức độ biểu gen AMPK lô chuột 38 ĐẶT VẤN ĐỀ Sự biểu gen toàn trình tổng quát theo thông tin di truyền chuyển từ gen thành protein [2] Như vậy, protein sản phẩm biểu gen Protein đại phân tử đóng vai trò chủ yếu hình thành, trì cấu trúc chức thể sống [7] Việc nghiên cứu protein, tức nghiên cứu biểu gen, giúp đánh giá thay đổi cấu trúc, chức protein, có ý nghĩa to lớn ngành Dược nghiên cứu thay đổi thể điều kiện khác nhau, sinh lý hay bệnh lý, thay đổi dùng hay không dùng thuốc, góp phần chứng minh chế tác dụng thuốc Protein xem đại phân tử tế bào nhiều loại protein nội bào khó quan sát mắt thường số lượng nhỏ Việc nghiên cứu protein cần đến kỹ thuật tinh vi Đã có nhiều kỹ thuật ứng dụng nghiên cứu protein điện di chiều, khối phổ, Western blot … [55] Đặc biệt kỹ thuật Western blot sử dụng phổ biến giới [55] Tại Việt Nam, có số phòng thí nghiệm ứng dụng kỹ thuật Western blot đánh giá biểu gen kỹ thuật thường quy Mẫu protein nghiên cứu thường protein tái tổ hợp, protein tách từ tế bào nuôi cấy Tuy nhiên, việc đánh giá biểu gen từ mô tự nhiên vô quan trọng, tác dụng chất thân gen protein mà đánh giá thay đổi, ảnh hưởng thể đến chất cần quan tâm, từ phân bố hấp thu chuyển hóa thải trừ, đến điều hòa thể sử dụng chất, dẫn đến thay đổi gen protein Ở Việt Nam, nghiên cứu biểu gen mô động vật sử dụng kỹ thuật Western blot Những 37 Tiến hành đo cường độ tín hiệu phần mềm Image J, kết thu trình bày bảng 3.3 So sánh cường độ tín hiệu AMPKα /beta actin lô với để đánh giá mức độ biểu gen AMPK, kết thu thể hình 3.7 Bảng 3.3: Cường độ tín hiệu lô chuột STT Cường độ tín hiệu Lô sinh lý Lô bệnh lý Lô chứng dương AMPKα1 41489,250 44488,099 44225,714 Beta actin 51372,593 54430,300 54465,421 AMPKα1/Beta actin 0,808 0,817 0,812 Tỷ số tương đối so với 1,000 1,012 1,005 AMPKα1 42742,393 39948,068 50301,232 Beta actin 50349,057 51211,279 52910,957 AMPKα1/ Beta actin 0,849 0,780 0,951 Tỷ số tương đối so với 1,000 0,919 1,120 AMPKα1 41406, 621 40326,923 41784,458 Beta actin 49223,250 47142,271 50382,098 AMPKα1/ Beta actin 0,841 0,855 0,829 Tỷ số tương đối so với 1,000 1,017 0,986 lô sinh lý lô sinh lý lô sinh lý Mean ± SD 1,000 ± 0,000 0,983 ± 0,055 1,037 ± 0,073 38 Ghi chú: Lấy tín hiệu beta actin làm control, p nhóm lớn 0,05 Hình 3.7: So sánh mức độ biểu gen AMPK lô chuột Nhận xét: Biểu đồ thể khác biệt có ý nghĩa mức độ biểu gen AMPK lô chuột với 3.2 Bàn luận 3.2.1 Bàn luận kết khảo sát số thông số trình kỹ thuật Western blot 3.2.1.1 Về kết khảo sát phương pháp chiết tách protein khỏi mô gan chuột Kết định lượng nồng độ protein tổng số phương pháp chứng tỏ việc tách protein tổng số từ mô gan chuột, dung dịch đệm 39 ly giải EZLys cocktail có khả ly giải tốt (cao gấp 4,5 lần) dung dịch đệm chiết tách thông thường Việc sử dụng cách nghiền thủ công (thêm nitơ lỏng, thủy tinh vụn nghiền chày cối) hiệu (cao gấp 1,8 lần) so với nghiền máy nghiền đồng thể Tất khác biệt có ý nghĩa thống kê Lượng protein mục tiêu mô thường nhỏ so với lượng protein tổng số, cần lượng protein tổng số lớn đảm bảo lượng protein đích phát định lượng kỹ thuật Hơn nữa, lượng mẫu tra vào gel bị giới hạn (tối đa lần tra 18 µl, tra nhiều lần làm cho mẫu chưa cô hoàn toàn gel cô bị chuyển sang để tách gel tách), nên nồng độ protein tổng số mẫu cần phải lớn Ưu điểm ly giải tốt đệm ly giải EZLys cocktail có nguyên nhân Thứ khả phá vỡ tế bào để giải phóng protein lớn Thứ hai khả hòa tan protein đệm tốt Ngoài ưu điểm ly giải tốt đệm ly giải EZLys cocktail có bổ sung chất ức chế protease (PMSF chất ức chế serin, cystein thiol protease [20]), chất làm ức chế enzym thủy phân protein, bảo vệ protein khỏi phân hủy protease mô, làm giảm lượng protein đích gây kết không xác [20] Bên cạnh đó, đệm ly giải EZLys cocktail có số nhược điểm việc ly giải mạnh tạo lượng tạp nhiều Tạp bao gồm lipid, polysaccharid, nucleotid, phospholipid… Các chất tạo tương tác với protein, làm cản trở di chuyển tách protein gel Để loại tạp cần đến siêu ly tâm, tạo kết tủa aceton, amonium sulfat, phenol… [21] Việc sử dụng phương pháp ảnh hưởng đến lượng protein đích thu được, tùy thuộc vào loại protein đích Ngoài ra, việc ly giải mạnh ảnh 40 hưởng đến số liên kết hóa học dễ bị cắt đứt, ví dụ liên kết với gốc phosphat Trong trường hợp cần đánh giá bổ sung chất ức chế phosphatase cần thiết Một số chất ức chế phosphatase thường dùng sodium orthovanadat, calyculin A [20] Xét khả ly giải protein, phương pháp nghiền truyền thống (nghiền với nitơ lỏng, thủy tinh vụn chày cối) xếp vào mức độ trung bình, phương pháp nghiền máy nghiền đồng thể xếp vào loại ly giải nhẹ [20] Vì vậy, phương pháp sử dụng phổ biến phòng thí nghiệm không để ly giải mẫu để dùng cho thí nghiệm phân tích sau mà để so sánh khả ly giải đệm ly giải khác [47] Nó có ưu điểm ly giải tốt so với máy nghiền đồng thể có bổ sung nitơ (giúp nghiền làm nhỏ dễ dàng), kết hợp với thủy tinh vụn (tạo lực ma sát trình nghiền), có thêm ma sát chày cối nghiền Phương pháp có nhược điểm lực nghiền mạnh cắt đứt liên kết yếu khả ly giải phụ thuộc nhiều vào yếu tố chủ quan người làm thí nghiệm Việc nghiền mẫu máy nghiền đồng thể sử dụng lực phân cắt học để nghiền mẫu, có ưu điểm nhanh, ảnh hưởng đến đặc tính protein [20] 3.2.1.2 Về kết khảo sát ảnh hưởng thời gian ép phim, thời gian ngâm phim thuốc màu Đề tài khảo sát ảnh hưởng thời gian ép phim, ngâm phim thuốc màu đến phim thu Nếu thời gian ép phim, ngâm phim thuốc màu ngắn, phim ghi lại toàn tín hiệu hóa phát quang thu Nếu thời gian dài, background phim lớn Ngoài ra, thời gian ngâm thuốc màu dài, không phát 41 tín hiệu từ protein đích Mối liên hệ thu phù hợp với số tài liệu công bố Đối với ảnh hưởng thời gian ép phim: thời gian ép phim không đủ cho cường độ tín hiệu yếu [13,21,55] không xuất tín hiệu [13], thời gian ép phim dài làm background lớn [16,21,55], không phân biệt giới hạn băng [13] Đối với thời gian ngâm phim thuốc màu, thời gian ngâm lớn, background lớn [11,12] Vì trình ép phim thực phòng tối (do ánh sáng làm hỏng phim X – quang), nên biết điểm dừng thích hợp mắt thường Vì vậy, việc khảo sát ảnh hưởng yếu tố thực cần thiết, từ kết ta dùng thời gian để kiểm soát trình thực thí nghiệm 3.2.2 Về kết sử dụng Western blot để sơ đánh giá mức độ biểu AMPK tế bào gan chuột 3.2.2.1 Về kết khảo sát khoảng tuyến tính phương pháp Western blot AMPKα1 chiết từ mô gan chuột Phương pháp ghi lại hình ảnh tín hiệu thu X - quang cho mật độ tín hiệu có khoảng tuyến tính hẹp, hạn chế việc sử dụng phim X - quang so với CCD, cần thiết phải đánh giá khoảng tuyến tính trước so sánh mẫu [21] Từ kết đánh giá khoảng tuyến tính kỹ thuật AMPKα1, nhận thấy khoảng lượng protein tổng số tra vào giếng từ 28,880 µg đến 67,387 µg, cường độ tín hiệu protein đích AMPKα1 tăng tỷ lệ thuận với lượng protein tổng số tra vào giếng Lượng protein nằm khoảng 10 µg đến 100 µg mà hầu hết phòng thí nghiệm thường dùng, việc sử dụng lượng protein tổng số phòng thí nghiệm cho chủ yếu 42 dựa kinh nghiệm [56] Kết thí nghiệm tạo sở khoa học cho việc so sánh mẫu dùng cho thí nghiệm Nếu lượng protein tổng số tra vào giếng thí nghiệm nằm khoảng từ 28,880 µg đến 67,387 µg, hoàn toàn so sánh mẫu với thông qua cường độ tín hiệu thu 3.2.2.2 Về kết so sánh mức độ biểu AMPK lô chuột Protein AMPK thể đáp ứng sinh học phosphoryl hóa vị trí Thr172 tiểu đơn vị α tạo thành dạng pAMPK [45,54] Vì vậy, thay đổi tiểu đơn vị thể thay đổi đáp ứng sinh học AMPK Trong nghiên cứu Steinberg GR and Kemp BE, tác giả khẳng định đồng phân α1 phân bố nhiều mô gan chuột, đồng phân α2 phân bố gan với lượng [53] Trong nghiên cứu Mengwei Zang cộng dòng tế bào gan HepG2, lượng đồng phân AMPKα1 ghi nhận cao 10 lần so với đồng phân α2 [43] Chính lý này, sử dụng đồng phân AMPKα1 làm đại diện để đánh giá biểu protein AMPK mô gan chuột Với protein control beta actin, protein thường dùng làm control nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ biểu gen với kỹ thuật Western blot, biểu AMPKα1 lô chuột thí nghiệm khác biệt ý nghĩa thống kê Do đó, sơ xác định lượng AMPKα1 không đổi gan chuột bình thường, chuột gây đái tháo đường, chuột gây đái tháo đường điều trị metformin (để khẳng định chắn cần làm với cỡ mẫu lớn hơn) Trong nghiên cứu Mengwei Zang cộng dòng tế bào gan HepG2, metformin không làm tăng biểu AMPKα1 so với nhóm chứng không điều trị metformin [43] Cho đến nay, 43 chưa tìm công bố so sánh đồng thời mức độ biểu AMPKα1 chuột ĐTĐ typ có không điều trị metformin Như nói trên, mô gan, AMPKα1 đại diện cho AMPK tổng số Về mức độ biểu AMPK tổng số gan chuột so sánh lô chuột ĐTĐ typ có điều trị, có nhiều nghiên cứu giới ghi nhận khác biệt Trong nghiên cứu Qinwen Bao cộng sự, hình ảnh phim ghi lại cho thấy biểu AMPK không đổi gan chuột bình thường, chuột đái tháo đường chuột đái tháo đường điều trị metformin, thay đổi biểu gen ghi nhận với dạng phosphoryl hóa AMPK (pAMPK) (hình 3.8) [48] Trong nghiên cứu Xue Wang, hình ảnh phim ghi lại cho thấy biểu AMPK không đổi gan chuột đái tháo đường db/db chuột đái tháo đường db/db điều trị metformin 150 mg/kg, thay đổi nằm pAMPK (hình 3.9) [63] Tương tự, nghiên cứu Schroeder-Gloeckler JM, hình ảnh phim ghi lại cho thấy biểu AMPK không đổi gan chuột đái tháo đường Lepr db/db chuột đái tháo đường Lepr db/db điều trị metformin với liều thay đổi, thay đổi nằm pAMPK [51] Chính mức độ biểu AMPK tổng số không đổi gan chuột điều kiện khác nên nhiều nghiên cứu sử dụng AMPK tổng số làm protein control cho thí nghiệm muốn so sánh biểu AMPK phosphoryl hóa [32,40] Bởi có biểu gen pAMPK yếu tố thay đổi, tạo đáp ứng sinh học quan trọng 44 KẾT LUẬN Qua trình thực nghiệm, đề tài rút kết luận sau: Đã khảo sát thông số trình kỹ thuật Western blot nghiên cứu biểu gen mô gan chuột lựa chọn số thông số tối ưu: kỹ thuật tách protein, thời gian ép phim, thời gian ngâm phim thuốc màu Đã sử dụng kỹ thuật Western blot để sơ đánh giá mức độ biểu gen AMPK mô gan chuột Biểu AMPK không khác biệt lô chuột bình thường, lô chuột gây đái tháo đường thực nghiệm, lô chuột đái tháo đường thực nghiệm điều trị metformin ĐỀ XUẤT Tiếp tục nghiên cứu đánh giá mức độ biểu gen dạng pAMPK mô gan chuột để áp dụng nghiên cứu tác dụng thuốc mô hình thực nghiệm in vivo Tài liệu tham khảo: Tiếng Việt Vũ Tiến Chinh cộng (2008), Vật lý đại cương, nhà xuất giáo dục, Hà Nội, tr.415-416 Trần Bá Cừ cộng (2003), Từ điển bách khoa sinh học, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội, tr.383 Viện Dinh dưỡng (2009), "Bảng thành phần dinh dưỡng thực phẩm Việt Nam", Bộ Y Tế Nguyễn Thị Đông (2013), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết dịch chiết phân đoạn chloroform thân Ý dĩ động vật thực nghiệm, Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.20-40 Phùng Thanh Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết ảnh hưởng chuyển hoá glucose dịch chiết Bằng lăng nước (Lagertroemia Speciosa (L.) Pers.) Việt Nam, Luận án tiến sĩ Dược học, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.40-60 Đỗ Thị Nguyệt Quế (2012), Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết rễ chóc máu Nam Bộ (Salacia cochichinensis L., Celastraceae) thực nghiệm, Luận án tiến sĩ, Viện Dược liệu, tr.1-136 Nguyễn Văn Rư cộng (2014), Hóa sinh học, Nhà xuất giáo dục, Bộ Y Tế, Trường Đại học Dược Hà Nội, tr.33-220 Tiếng Anh Alice Alegria-Schaffer (2014), “Western Blotting using Chemiluminescent substrates”, Methods Enzymol, chapter 9, pp.251-252 Bae JH et al (2011), “Corpus cavernosal smooth muscle relaxation effect of a novel AMPK activator, beta-lapachone”, J Sex Med, 8(8), pp.2205-14 10 Bertoldo MJ et al (2015), “AMPK: a master energy regulator for gonadal function”, Frontiers in Neurostiers, 9, pp.1-11 11 Bio- Rad, Western Blotting Troubleshooter, Bio-rad Laboratories, 1-4 12 Bio –Rad, A Guide to Transfer and Detection Third Edition, Bio-rad Laboratories, pp.1-78 13 Brunelle JL, Rachel Green (2014), “Methods in Enzymology”, elsevier, Chapter 12, pp.151-159 14 Burnette WN (1981) “Western blotting : electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein”, A Anal Biochem, 112, pp.195-203 15 Canto C et al (2010), “Interdependence of AMPK and SIRT1 for metabolic adaptation to fasting and exercise in skeletal muscle”, Cell Metab, 11, pp.213-219 16 Corthell JT (2014), “Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls”, elsevier, chapter 7, pp.55-75 17 Egan DF et al (2011), “Phosphorylation of ULK1 (hATG1) by AMPactivated protein kinase connects energy sensing to mitophagy”, Science, 331, pp.456-461 18 Eid AA et al (2010), “AMP-activated protein kinase (AMPK) negatively regulates Nox4-dependent activation of p53 and epithelial cell apoptosis in diabetes”, J Biol Chem, 285(48), pp.37503-37512 19 Foretz M et al (1999), “Sterol regulatory element binding protein-1c is a major mediator of insulin action on the hepatic expression of glucokinase and lipogenesis-related genes”, Proc Natl Acad Sci USA, 96, pp.1273712742 20 GE Healthcare (2010), Protein sample preparation handbook, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden, pp.1-134 21 GE Healthcare (2011), Western blotting principles and methods, GE Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden, pp.1-189 22 Gorr TA, Vogel J (2015), “Western blotting revisited: critical perusal of underappreciated technical issues”, Proteomics Clin Appl, 9(3-4), pp.396405 23 Habegger KM et al (2012), “AMPK enhances insulin-stimulated GLUT4 regulation via lowering membrane Cholesterol”, Endocrinology, 153, pp.2130-2141 24 Hardie DG (1989), “Regulation of fatty acid synthesis via phosphorylation of acetyl-CoA carboxylase”, Prog Lipid Res, 28, pp.117-146 25 Hardie DG (2007), “AMP-activated/SNF1 protein kinases: conserved guardians of cellular energy”, Nat Rev Mol Cell Bio, l8, pp.774-785 26 Hardie DG (2011), “AMP-activated protein kinase: a cellular energy sensor with a key role in metabolic disorders and in cancer”, Biochem Soc Trans, 39, pp.1-13 27 Hardie DG (2016), “AMPK: An Energy-Sensing Pathway with Multiple Inputs and Outputs”, Trends Cell Biol, 26(3), pp.190-201 28 Hnasko TS, Hnasko RM (2015), “The Western Blot”, Methods Mol Biol, 1318, pp.87-96 29 Holmes BF et al (2005), “Regulation of muscle GLUT4 enhancer factor and myocyte enhancer factor by AMP-activated protein kinase”, Am J Physiol Endocrinol Metab, 289(6), pp.E1071-6 30 Horton JD et al (2002), “SREBPs: activators of the complete program of cholesterol and fatty acid synthesis in the liver”, J Clin Invest, 109, pp.1125-1131 31 Jager S et al (2007), “AMP-activated protein kinase (AMPK) action in skeletal muscle via direct phosphorylation of PGC-1 alpha”, Proc Natl Acad Sci USA, 104, pp.12017-22 32 Kim YH (2015), “Metformin ameliorates acetaminophen hepatotoxicity via Gadd45β-dependent regulation of JNK signaling in mice”, J Hepatol, 63(1), pp.75-82 33 Krishan S et al (2015), “Adenosine monophosphate–activated kinase and its key role in catabolism: structure, regulation, biological activity, and pharmacological activation”, Mol Pharmacol, 87(3), pp.363-77 34 Krishan S et al (2014), “AMP kinase (PRKAA1)”, J Clin Pathol, 67, pp.758-763 35 Kuriena BT, Scofielda RH (2002), “Protein blotting: a review”, J Immunol Methods, 274(1-2), pp.1-15 36 Kuriena BT, ScoWeld RH (2006), “Western blotting”, Methods, 38(4), pp.283-293 37 Kurth-Kraczek EJ et al (1999), “5’AMPactivated protein kinase activation causes GLUT4 translocation in skeletal muscle”, Diabetes, 48, pp.16671671 38 Leelavinothan SS (2010), "Efficacy of naringin on hepatic enzymes of carbohydrate metabolism in streptozotocin - nicotinamide induced type diabetic rats", International journal of Pharmaceutical & Biological archives, 1(2), pp.280 - 286 39 Li Y et al (2011), “AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulinresistant mice”, Cell Metab, 13, pp.376-388 40 Li Y et al (2011), “Epigallocatechin-3-O-gallate (EGCG) attenuates FFAs-induced peripheral insulin resistance through AMPK pathway and insulin signaling pathway in vivo”, Diabetes Res Clin Pract, 93(2), pp.205-214 41 Loffler AS et al (2011), “Ulk1-mediated phosphorylation of AMPK constitutes a negative regulatory feedback loop”, Autophagy, 7, pp.696706 42 McBride A (2009), “The glycogen-binding domain on the AMPK beta subunit allows the kinase to act as a glycogen sensor”, Cell Metab, 9, pp.23-34 43 Mengwei Zang (2006), “Polyphenols stimulate AMP-Activated protein kinase, lower lipids, and inhibit accelerated atherosclerosis in diabetic LDL receptor-deficient mice”, American Diabetes Association, 55(8), pp.2180-2191 44 Monica Baiula et al (2011), “Eosinophil as a cellular target of the ocular anti-allergic action of mapracorat, a novel selective glucocorticoid receptor agonist”, Molercular Vision, 17, pp.3208-3223 45 O’Neill HM (2013), “AMPK and exercise: glucose uptake and insulin sensitivity”, Diabetes Metab, J37, pp.1-21 46 Pierce staff (2004), Western blotting handbook and troubleshooting guide, Pierce biotecnology, United state, pp.1-52 47 Qiang Chen et al (2011), “Comparison of protein extraction methods suitable for proteomics analysis in seedling roots of Jerusalem artichoke under salt (NaCl) stress”, African Journal of Biotechnology, 10(39), pp.7650-7657 48 Qinwen Bao (2016), “Anti-diabetic activities of catalpol in db/db mice”, Korean J Physiol Pharmacol, 20(2), pp.153-160 49 Russo GL (2013), “AMP-activated Protein Kinase: a target for old drugs against diabetes and cancer”, 86(3), pp.339-50 50 Sanchez AM et al (2012), “The role of AMP-activated protein kinase in the coordination of skeletal muscle turnover and energy homeostasis”, Am J Physiol Cell Physiol, 303(5), pp.C475-85 51 Schroeder-Gloeckler JM (2007), “CCAAT/Enhancer-binding Protein β Deletion Reduces Adiposity, Hepatic Steatosis, and Diabetes in Leprdb/db Mice”, J Biol Chem, 282(21), pp.15717-15729 52 Shi Jin, Kennedy RT (2015), “New developments in Western blot technology”, Chinese Chemical Letters, 26(4), pp.416-418 53 Steinberg GR, Kemp BE (2009), “AMPK in health and disease”, Physiol Rev, 89, pp.1025-1078 54 Suter M et al (2006), “Dissecting the role of 59-AMP for allosteric stimulation, activation, and deactivation of AMP-activated protein kinase”, J Biol Chem, 281, pp.32207-32216 55 Tahrin Mahmood, Ping-Chang Yang (2012), “Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting”, North American Journal of Medical Sciences, 4(9), pp.429-434 56 Taylor SC (2014), “The Design of a Quantitative Western Blot Experiment”, Hindawi, 2014, pp.1-8 57 Towbin H et al (1979), "Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications", Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 76(9), pp.4350-54 58 Vickers SP et al (2013), "Effect of empagliflozin, on body weight, glucose control and plasma parameters in STZ-induced diabetic rats fed a high-fat diet: Comparison with Exenatide", Annual Meeting of the European Association for the Study of Diabetes, 771(48), pp.1-5 59 Walker JM (2003), “The Protein Protocols Handbook, 2nd Edition”, springer, 68(8), pp.943-943 60 Wakil SJ et al (1983), “Fatty acid synthesis and its regulation”, Annu Rev Biochem, 52, pp.537-579 61 Winder WW (2001), “Energy-sensing and signaling by AMP-activated protein kinase in skeletal muscle”, J Appl Physiol, 91(3), pp.1017-1028 62 Xiao B et al (2007), “Structural basis for AMP binding to mammalian AMP-activated protein kinase”, Nature, 449, pp.496-500 63 Xue Wang (2015), “Combination therapy with Oleanolic acid and Metformin as a synergistic treatment for diabetes”, J Diabetes Res, 2015, pp.1-12 64 Yung MH et al (2016), “Targeting AMPK signaling in combating ovarian cancers: opportunities and challenges”, Acta Biochim Biophys Sin, pp.117 [...]... mô động vật và phát hiện protein mục tiêu từ hỗn hợp protein phức tạp của mô động vật có thể là lý do kỹ thuật này chưa được triển khai rộng rãi ở Việt Nam Với lý do đó, chúng tôi tiến hành triển khai đề tài Nghiên cứu triển khai kỹ thuật Western blot để đánh giá biểu hiện gen ở mô gan chuột với hai mục tiêu: 1 Khảo sát một số thông số quá trình của Western blot đối với nghiên cứu biểu hiện gen ở. .. biểu hiện gen ở mô gan chuột 2 Sử dụng Western blot để sơ bộ đánh giá mức độ biểu hiện gen AMPK ở mô gan chuột 3 CHƯƠNG I :TỔNG QUAN 1.1 Đại cương về kỹ thuật Western blot 1.1.1 Định nghĩa Western blot là kỹ thuật được sử dụng với mục đích phát hiện và phân tích protein, dựa vào việc phát hiện phức hợp kháng thể đặc hiệu - protein được gắn trên màng [21] 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu Kỹ thuật này lần đầu... đựng mẫu, giá để ống eppendorf, kẹp, kéo Các dụng cụ đều đạt tiêu chuẩn phân tích 2.2 Nội dung, phương pháp nghiên cứu Để thực hiện các mục tiêu nghiên cứu của đề tài, quá trình nghiên cứu bao gồm các nội dung chính được trình bày ở sơ đồ hình 2.1 22 Mục tiêu 1: Khảo sát một Mục tiêu 2: Sử dụng Western blot số thông số quá trình của để sơ bộ đánh giá mức độ biểu Western blot hiện AMPK ở mô gan chuột sát... đề ở bước phát hiện tín hiệu [55] Nhiễu là tín hiệu mang tính chất hệ thống, gây ra bởi bản chất của phương pháp phát hiện [21] 1.1.6 Ứng dụng của Western blot để đánh giá biểu hiện gen Biểu hiện gen là quá trình chuyển thông tin di truyền từ gen trong nhân tế bào thành protein trong tế bào, từ kiểu gen sang kiểu hình của cơ thể [2] Đã có nhiều nghiên cứu trên thế giới sử dụng kỹ thuật Western blot. .. tục được nghiên cứu [27,33,64] Kỹ thuật Western blot cũng thường được sử dụng để đánh giá biểu hiện AMPK Ví dụ như các nghiên cứu về chức năng điều hòa của AMPK trong đái tháo đường [18], nghiên cứu về tác dụng của AMPK lên điều hòa giãn cơ trơn thể hang [9]… Ở Việt Nam, đã có nghiên cứu chứng minh tác dụng của dược liệu trong điều trị đái tháo đường thông qua đích AMPK Trong đó có nghiên cứu về tác... sát phương ảnh hưởng ảnh hưởng khoảng tuyến mức độ pháp chiết của của tính của phương biểu hiện tách protein gian gian ngâm pháp AMPK ở từ mô gan phim phim trong blot các lô thuốc hiện AMPKα1 ép chuột sát sát Khảo thời Khảo Khảo Khảo sát thời Western đối với So sánh chuột Hình 2.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu 2.2.1 Khảo sát phương pháp tách chiết protein ra khỏi mô gan chuột - Cân 3 g mẫu gan trên cân phân... máu Nam Bộ, ứng dụng kỹ thuật Western blot với dòng tế bào C2C12 (tế bào cơ vân nguyên phát chuột nhắt) [6] 20 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tượng nghiên cứu 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu Mô gan chuột cống trắng, giống đực, gồm 3 lô: lô chuột bình thường (lô sinh lý), lô chuột gây đái tháo đường typ 2 thực nghiệm (lô bệnh lý) và lô chuột đái tháo đường... nhiều nghiên cứu trên thế giới sử dụng kỹ thuật Western blot trong đánh giá biểu hiện gen Đó là các nghiên cứu đánh giá sự thay đổi biểu hiện gen giữa các mô, các tế bào khác nhau, giữa các cá thể khác nhau, giữa tế bào bệnh và tế bào lành để chẩn đoán 1 số bệnh (ví dụ như Lyms, HIV1), giữa các tế bào được dùng thuốc với những tế bào khác để chứng minh cơ chế tác dụng của thuốc… 1.2 Đại cương về AMPK 1.2.1... giới thiệu bởi Towbin năm 1979 [57] Tuy nhiên đến năm 1981, cái tên Western blot mới được chính thức thừa nhận và sử dụng rộng rãi [14,35] Kể từ lúc được phát hiện đến nay, kỹ thuật đã không ngừng được phát triển để tối ưu hóa cũng như tăng tính ứng dụng 1.1.3 Vai trò, ứng dụng Western blot có thể được dùng để xác định sự có mặt của protein, xác định trọng lượng phân tử của protein hoặc để xác định... sự thay đổi mức độ biểu hiện gen [16,21] Kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử, miễn dịch di truyền học và một số ngành khác Trong lĩnh vực y tế, kỹ thuật đã được sử dụng để chẩn đoán HIV, một số thể bệnh Lyms, viêm gan B [52] 1.1.4 Nguyên tắc Western blot hoạt động dựa trên nguyên tắc tách các protein từ một hỗn hợp bằng điện di trên gel, sau đó chuyển protein lên màng, phát hiện protein bằng