TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VẾ CHI GỪNG (ZINGIBER)
1.1.1 Họ gừng và chi gừng
Họ Gừng (Zingibeaceae) bao gồm nhiều chi và loài, chủ yếu phân bố ở Đông Nam Á, Trung Quốc, Ấn Độ và Nhật Bản Theo nghiên cứu của Võ Văn Chi và Dương Đức Tiến, họ Gừng có 45 chi với hơn 1300 loài, phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới Tại Việt Nam, họ Gừng có 12 chi và 61 loài, phân bố từ Bắc vào Nam.
Họ Gừng (Zingiberaceae) bao gồm các cây thân thảo lâu năm, thường mọc ở nơi đất ẩm và sáng, dưới tán rừng hoặc vách đá ẩm Thân cây được hình thành từ các bẹ lá ôm chặt, tạo thành thân giả cao từ 1 đến 5 mét, hoặc có thể thấp hơn Rễ cây nhỏ, hình sợi, đôi khi phình to thành củ, trong khi một số loài có rễ thẳng và cứng, đâm sâu xuống đất Thân rễ, thường gọi là củ, nằm ngang dưới mặt đất và có mùi thơm đặc trưng, đôi khi có mùi hắc như một số loài thuộc chi Gừng (Zingiber).
Chi Gừng (Zingiber) bao gồm khoảng 100 loài, chủ yếu phân bố ở các khu vực nhiệt đới Châu Á và Châu Úc Đông Nam Á là trung tâm phong phú và đa dạng nhất của chi Gừng, trong khi Trung Quốc đã ghi nhận hơn 100 loài.
Việt Nam sở hữu khí hậu nhiệt đới gió mùa với hệ thực vật phong phú, đặc biệt là các loại cây tinh dầu và cây thuốc Trong số đó, chi Gừng là một trong những nhóm cây quan trọng được nghiên cứu và phát triển.
(1993) đã thống kê gồm 12 loài [10] Trong những năm gần đây phát hiện thêm một loài Gừng nữa có tên Gừng môi tím đốm (Zingiber penisulare I Theilade)
Bảng 1.1 Các loại Gừng Việt Nam Stt Tên khoa học Tên Việt Nam Phân bố
1 Zingiber officinale Roscoe Gừng Phân bố rộng
2 Zingiber acuminatum Valeton Gừng nhọn Tây Nguyên, Trung
3 Zingiber cochinchinesis Gagn Gừng Nam Bộ Bà Rịa- Vũng Tàu
4 Zingiber eberhardtii Gagn Gừng Eberhardt Lâm Đồng
5 Zingiber gramineum Bl Gừng lúa, Ngải trặc Biên Hòa
6 Zingiber monophyllum Gagn Gừng một lá Ninh Bình
7 Zingiber pellitum Gagn Gừng bọc da Bà Rịa
8 Zingiber purpureum Roscoe Gừng tía (gừng dại) Phân bố rộng
9 Zingiber rubens Roxb Gừng đỏ Lâm Đồng
10 Zingiber rufopilosum Gagn Gừng lông hung Ba vì (Hà nôi), Vĩnh phúc
11 Zingiber zerumbet (L.) J.E Sm Gừng gió Phân bố rộng
12 Zingiber penisulare I Theilade Gừng môi tím đốm Sơ Pai, Kban, Gia lai, Đặc điểm thực vật của chi Gừng
Cây thảo, sống nhiều năm, cao 0,5-3,5 m Thân rễ mập phân nhánh nhiều, tạo thành “củ” nằm ngang trên mặt đất “Thịt củ” nạc thơm và có vị cay
Lá mọc đối xứng hai bên thân cây, có hình mác thuôn dài hoặc hình bầu dục Cuống lá ngắn hoặc gần như không có, trong khi bẹ lá có thể nguyên hoặc xẻ hai thùy Đặc biệt, lá phát ra mùi thơm nhẹ.
Cụm hoa bông thường phát triển từ thân rễ hoặc đôi khi từ ngọn “thân giả” Các bông hoa mọc sát nhau, mỗi bông được bao bọc bởi một lá bắc sắp xếp giống như vẩy cá từ dưới lên trên Ban đầu, lá bắc có màu xanh, sau đó chuyển dần sang các màu vàng, đỏ nhạt và vàng.
Cây có hoa 4 cánh, màu sáng hoặc đỏ, với cánh hoa hình ống mảnh mang màu trắng, vàng hoặc hồng Bao phấn thường có hình dạng ống bao quanh vòi nhụy, trong khi bầu hoa có 3 ô, có thể nhẵn hoặc có lông dày.
Quả nang 3 ô Hạt nhiều, hình trứng hay trái xoan, màu nâu đỏ, đen trắng hay vàng [10]
Các loài trong chi Gừng (Zingiber) thường phát triển mạnh ở những khu vực đất giàu dinh dưỡng và ẩm ướt, đặc biệt là dưới tán rừng thường xanh hoặc rừng rụng lá theo mùa Một số loài có khả năng sinh trưởng trên đất lẫn sỏi đá, ở những bãi đất trống hoặc trong rừng thứ sinh, thậm chí ở độ cao lên tới 3000m so với mực nước biển.
Thân rễ của các cây thuộc chi Gừng có khả năng phát triển nhanh chóng Chỉ từ một chồi giống ban đầu, chúng có thể phân nhánh, đâm chồi và tăng sinh khối, hình thành nên một bụi lớn chỉ trong vài năm.
Mùa ra hoa và chín quả của các loài trong chi Gừng rất đa dạng Tại Malaixia, Gừng đen (Z spectabile) thường ra hoa từ tháng 7 đến tháng 9 và quả chín vào tháng 11 Ngược lại, Gừng gió (Z zerumber) ra hoa sớm hơn, bắt đầu từ tháng 6, với mùa quả từ tháng 10 đến tháng giêng năm sau.
Hầu hết các loài cây thuộc chi Gừng (Zingiber) đều chứa tinh dầu quý giá, được sử dụng làm thuốc và gia vị Thân rễ của chúng không chỉ là nguyên liệu trong chế biến thực phẩm mà còn được dùng để sản xuất rượu bia và mứt gừng.
Trong dân gian, nhiều loại củ được xem như thuốc chữa cảm, kích thích tiêu hóa và điều trị các bệnh như đau dạ dày, ho, mụn, nhọt, đau đầu, nhức xương, và các triệu chứng liên quan đến lạnh Theo nghiên cứu của Nhật Bản đăng trên Huffington Post, gừng đỏ được sử dụng trong y học truyền thống Indonesia như một phương thuốc giảm đau cho bệnh viêm khớp Ngoài ra, gừng còn giúp tăng cường lưu thông máu, có lợi cho hệ tim mạch, giảm mỡ trong máu và hạn chế quá trình oxy hóa.
1.1.2 Nghiên cứu các loài của chi Gừng ( Zingiber)
Trong 12 loài thuộc chi Gừng (Zingiber), có những loài không chỉ là cây thuốc quí mà còn là nguồn nguyên liệu có giá trị trong chế biến thực phẩm Các sản phẩm được chế biến từ nguồn nguyên liệu này được sử dụng rộng rãi ở các nước Đông Nam Á nói riêng và trên toàn thế giới nói chung [10]
Các nghiên cứu về chi Gừng, đặc biệt là loài Zingiber officinale và Z Zerumbet, đã tập trung vào thành phần hóa học của tinh dầu Thành phần chính bao gồm các tecpen, tecpenoit, flavonoit, ancaloit và glicozit Từ dịch chiết CH2Cl2 của rễ cây gừng Z officinale Rose (Trung Quốc), các nhà khoa học đã tách được hai flavonoit, glucozit, hai flavonol, zerumbone, zerumbone epoxit, và curcumin Gần đây, nghiên cứu cũng mở rộng sang các loài khác như gừng môi tím đốm (Zingiber penisulare I Theilade) và gừng Eberhardt (Zingiber eberhardtii Gagn.).
1.1.2.1 Nghiên cứu về cây Gừng nhà (Zingiber officinale Roscoe )
Cây Gừng, có tên khoa học là Zingiber officinale Roscoe, thuộc chi Gừng (Zingiber) và họ Gừng (Zingiberaceae), còn được biết đến với tên đồng nghĩa Amomum Zingiber L (1753) Tùy theo từng quốc gia, cây Gừng được gọi bằng nhiều tên khác nhau.
KHÁI QUÁT VỀ CÂY GỪNG LÔNG HUNG (ZINGIBER
Cây Gừng lông hung, lần đầu tiên được phát hiện tại miền Bắc Việt Nam vào năm 1903 bởi nhà thực vật học Gagnep, đã được ông phân loại với tên gọi Zingiber rufopilosum Gagn và công bố trong tạp chí Bull Soc Bot Fr Đây là một trong 12 loại gừng có mặt tại Việt Nam và thuộc khoảng 150 loại gừng trên toàn cầu.
Gừng lông hung (Z.rufopilosum Gagn.), thuộc chi Gừng (Zingiber), họ
Gừng (Zingiberaceae) là một loài cây đặc hữu của Việt Nam, được công nhận là nguồn gen cây trồng quý hiếm cần bảo tồn theo quyết định số 80/2005/QĐ-BNN của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, ban hành ngày 05 tháng 12 năm 2005.
Cây thân thảo cao từ 1-1,3 m với thân rễ bò và lá sát nhau, phiến lá dạng dải kích thước 15-20 x 2-3 cm, có lông hung đỏ ở mép Cụm hoa hình nón ở ngọn thân có lá, kích thước 5-6 x 2,5-3 cm, đầu nhọn Các lá bắc gần tròn, lợp dày, với đường kính tới 2 cm, có lông ở gốc và mép, phần còn lại nhẵn Đài hoa dạng ống ở phần dưới và mở rộng thành mo ở phần trên, không có răng Tràng hoa màu vàng, với phần dưới dạng ống và phần trên chia thành 3 thùy bằng nhau Bao phấn có 2 ô, dài hơn phần phụ trung đới Cánh môi hình bầu dục dài, đầu xẻ 2, có vân màu nâu, dài gấp đôi nhị lép, trong khi nhị lép gần như hình dải và hẹp.
27 gắn sát gốc cánh môi Bầu nhẵn Vòi nhụy lép hình dùi Quả nang, vỏ mỏng, hạt 1-
4, hình gần tròn, đƣợc bao bằng áo hạt; áo hạt chia thùy [7]
1.2.3 phân bố và ứng dụng
Cho đến nay người ta đã nuôi trồng cây Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) ở miền Bắc Việt nam mà chủ yếu là các tỉnh ở Phú Thọ (Xuân
Sơn), Tuyên Quang (Na Hang), Hoà Bình (Mai Châu), Hà Nội (Ba Vì)
Gừng lông hung được nhân dân trồng chủ yếu để làm thuốc, với củ (thân rễ) cây được sử dụng để chữa trị các bệnh về đường ruột như đầy hơi, khó tiêu, tiêu chảy, và cảm cúm Ngoài ra, gừng lông hung còn được ngâm rượu để xoa bóp, giúp giảm đau nhức các khớp xương.
Hình 1.1 Thân rễ Gừng Lông Hung ( Zingiber rufopilosum Gagn.)
1.2.4 Các nghiên cứu hoá học và hoạt chất sinh học của cây gừng lông hung ( Z rufopilosum Gagn.)
Gừng lông hung là cây đặc hữu của Việt Nam, chưa được tìm thấy ở các quốc gia khác trên thế giới Sự độc đáo này có thể là nguyên nhân cho việc thiếu vắng các nghiên cứu về cây này được công bố trên các tạp chí quốc tế.
Gừng lông hung, mặc dù đã được phát hiện từ năm 1903, vẫn là một loại cây quý hiếm và khó tìm kiếm, dẫn đến việc chưa có nhiều công trình khoa học nào công bố kết quả nghiên cứu về cây này trên các tạp chí trong nước.
KHÁI QUÁT VỀ CÂY GỪNG ZINGIBER SP
Cây Zingiber sp là loài cây phổ biến ở các huyện phía tây tỉnh Lâm Đồng, được người dân địa phương gọi là Gừng gió Tuy nhiên, hình thái của củ, lá, hoa và quả không giống như cây Gừng gió (Zingiber zerumbet (L.) J.E Sm).
Hình 1.2.Thân rễ và hoa cây Gừng Zingiber sp
ĐỀ TÀI, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
ĐỀ TÀI
Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong một số loài cây thuộc chi gừng (Zingiber)
2.1.1 Xuất sứ và tiêu chí lựa chọn đề tài
Khí hậu Việt Nam thuộc vùng nhiệt đới gió mùa với thảm thực vật phong phú, trong đó có khoảng 3948 loài cây thuốc Các loài thuộc họ gừng, đặc biệt là Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) và cây Gừng Zingiber Sp., đóng vai trò quan trọng trong y dược dân tộc Tuy nhiên, hiện tại chưa có công trình khoa học nào công bố kết quả nghiên cứu về hai loài gừng này.
Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) là một loại cây thuốc dân tộc nổi tiếng, được sử dụng từ lâu đời Nhân dân thường ngâm thân rễ của cây này vào rượu để xoa bóp các khớp xương khi bị sưng đau, nhức mỏi do thời tiết thay đổi Ngoài ra, gừng lông hung cũng được sắc để uống nhằm giảm đau bụng, khó tiêu, đầy hơi và tiêu chảy.
Gừng lông hung, cây đặc hữu của Việt Nam thuộc họ Gừng (Zingiberaceae), đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn công nhận là cây trồng quý hiếm cần bảo tồn nguồn gen theo quyết định số 08/2005/QĐ-BNN, ký ngày 05/12/2005 Loại cây này cũng thuộc các nguồn gen trao đổi quốc tế trong trường hợp đặc biệt.
Từ những lí do trên chúng tôi chọn cây Gừng lông hung và cây Gừng
Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học trong một số loài thuộc chi Gừng (Zingiber) tập trung vào hai loài chính: Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) và Gừng Zingiber sp Mục tiêu của đề tài là khám phá và phân tích các hợp chất có lợi từ các loài gừng này.
2.1.2 Mục tiêu của đề tài
Xây dựng quy trình chiết chọn lọc các chất trong thân rễ cây Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.) và cây Gừng Zingiber sp
Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật của các cặn chiết thu đƣợc
Phân lập các chất tinh khiết trong các cặn chiết đƣợc
Xác định cấu trúc phân tử các chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý hiện đại.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Dụng cụ và hoá chất
Các dung môi hữu cơ sử dụng: Hexane, chlorofome, etylaxetat, acetone, methanol và ethanol
Để chiết mẫu thực vật và khảo sát sắc kí lớp mỏng cũng như sắc kí cột, cần sử dụng dung môi tinh khiết (PA) Nếu sử dụng dung môi công nghiệp, dung môi etylaxetat kỹ thuật phải được xử lý bằng cách rửa axit ba lần với dung dịch Na2CO3 5%, sau đó rửa bằng nước cất đến khi đạt pH=7 Tiếp theo, dung môi này được làm khô bằng Na2SO4 khan và CaCl2 khan, cuối cùng cất lấy etylaxetat ở phân đoạn có nhiệt độ sôi từ 76-78 độ C.
Dung môi n-hecxane kỹ thuật được xử lý bằng cách rửa với axit H2SO4 đậm đặc, tiếp theo là rửa bằng nước cất đến khi đạt pH=7 Sau đó, dung môi được làm khô bằng Na2SO4 khan và cuối cùng được cất ở nhiệt độ 67-68°C.
Sắc kí lớp mỏng (SKLM) đƣợc chạy trên những bản nhôm tráng sẵn silicagel 60F 254 độ dày 0,2mm của hãng Merck
Các sắc đồ lớp mỏng đƣợc nhận bằng:
Thuốc thử Vanilin/H2SO4 1% là một dung dịch hữu ích để nhận biết các nhóm chức như steroid, terpenoid, saponin, chất màu và chất sáp Để chế biến thuốc thử này, cần hòa tan 0,2g vanilin vào 10ml H2SO4 đặc 98%, khuấy đều cho đến khi vanilin hoàn toàn tan.
Thuốc thử Dragendorff để nhận biết các ankaloit, đƣợc điều chế nhƣ sau: Dung dịch 1: Lấy 0,85 gam NaHSO3 hoà tan trong 40ml nước cất và 10 ml axit
Để chuẩn bị thuốc thử Dragendorff, bạn cần hòa tan 8 gam KI trong 20ml nước cất Sau đó, trộn 2ml dung dịch 1 với 5ml dung dịch 2, thêm 20ml axit axetic và điều chỉnh thể tích bằng nước đến 100ml.
Thuốc thử FeCl3 được sử dụng để nhận biết các hợp chất flavonoid và axit cacboxylic Trong quá trình sắc kí cột, chất hấp thụ được sử dụng là silicagel với kích thước hạt từ 0.040 đến 0.063mm, được cung cấp bởi hãng Merck.
Sắc kí cột sử dụng 3 loại cột có kích thước khác nhau :
Cột 1: ỉ= 4cm; l= 100cm Cột 2: ỉ= 2.5cm; l`cm Cột 3: ỉ= 1.5 cm; l@ cm
Máy xác định điểm chảy Boetius
Phổ hồng ngoại (IR) đƣợc ghi trên máy Impac 410-Nicolet FT-IR
Phổ khối lƣợng ESI-MS, APCI-MS Ion Trap Agilent 1200 Series (USA) Máy sắc kí khí nối ghép khối phổ GC-MS Agilent 6890N
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1 H-NMR, 13 C-NMR, 13 C-NMR-DEP-
Phân tích 135, 13 C-NMR-DEP-90, HMBC và HSQC được thực hiện trên máy Brucker Advance-500 MHz Chuẩn nội được sử dụng là TMS (tetrametyl silan), trong đó độ chuyển dịch hóa học (δ) được biểu thị bằng ppm và hằng số J được tính theo Hz.
THỰC NGHIỆM
Nguyên liệu thực vật được nghiên cứu bao gồm thân rễ cây Gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.), thu thập vào tháng 4 năm 2011 tại Vĩnh Phúc, và thân rễ cây gừng Zingiber sp., thu thập vào tháng 10 năm 2011 tại Lâm Đồng Việc giám định và phân loại các mẫu này được thực hiện bởi TS Nguyễn Quốc Bình, thuộc phòng Sinh vật - Viện Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam, thuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Nguyên liệu được xử lý bao gồm thân rễ Gừng lông hung và Gừng Zingiber sp., được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, sau đó thái lát mỏng từ 2-3 mm Cuối cùng, chúng được nghiền nhỏ và bảo quản trong tủ lạnh để phục vụ cho nghiên cứu.
2.3.2.Chiết các hợp chất từ thân rễ cây gừng lông hung ( Zingiber rufopilosum Gagn.)
Cân 4,2 kg thân rễ tươi cây Gừng lông hung, rửa sạch và loại bỏ phần hư hỏng Sau đó, xay nhỏ và ngâm trong 5 lít ethanol 96° trong 3 ngày ở nhiệt độ phòng Lọc bằng phễu lọc Buchner để lấy dịch, tiếp tục ngâm thêm 2 lần nữa với mỗi lần 5 lít ethanol 96° Gộp dịch chiết lại và loại bỏ bớt ethanol bằng cách đun cách thủy đến khi dịch còn khoảng 3 lít Thêm nước cho đến khi dịch chiết còn 20% ethanol, rồi thêm 2 kg muối và chiết 3 lần bằng dung môi n-hecxane, mỗi lần 300 ml.
Dịch chiết nước cồn còn lại chiết tiếp 2 lần bằng cloroform, lần 1 chiết 300ml, lần 2 là 200ml
Dịch chiết nước cồn sau khi chiết bằng cloroform chiết tiếp bằng etyl axetat
Etyl axetat là một thành phần trong dịch chiết, do đó cần sử dụng một lượng dung môi lớn để tách lớp hiệu quả, và thêm muối để cải thiện khả năng tách lớp Quá trình chiết được thực hiện qua ba lần: lần đầu sử dụng 1000ml, lần hai 300ml, và lần ba 200ml.
Sử dụng Na2SO4 để làm khô các dịch chiết, sau đó loại bỏ hoàn toàn dung môi và thu được các cặn chiết tương ứng như đã chỉ ra trong bảng 3.1 (chương 3, kết quả và thảo luận).
2.3.2.1 Khảo sát hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các cặn chiết thu đƣợc
Hoạt tính vi sinh vật được kiểm định thông qua việc đánh giá khả năng kháng sinh của các mẫu chiết Quy trình này được thực hiện trên phiến vi lượng 96 giếng (96-well microtiter plate) theo phương pháp hiện đại của Vander Bergher và Vlietlinck.
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATC 25922)
Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)
Nấm men: Candida albicans (ATCC 1154)
Ampicilin cho vi khuẩn Gr (+) Tetracylin cho vi khuẩn Gr (-) Nystatin hoặc Amphotericin B cho nấm sợi và nấm men
Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: Ampixilin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0.04mM
Vi sinh vật kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử
Môi trường cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB)- Sigma cho nấm men và nấm mốc Vi khuẩn trong môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)- Sigma
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm
Các chủng kiểm định đƣợc hoạt hoá và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland rồi tiến hành thí nghiệm Đọc kết quả:
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37 0 C/24 giờ cho vi khuẩn và 30 0 C/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men
Kết quả dương tính chỉ ra nồng độ mà không có sự phát triển của vi sinh vật Khi nuôi cấy nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, giá trị CFU sẽ nhỏ hơn 5.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC-Minimum Inhibitory concentration) của chất có hoạt tính:
Các chất có hoạt tính được sàng lọc ban đầu sẽ được pha loãng theo nhiều thang nồng độ giảm dần, từ 5 đến 10 thang, nhằm xác định giá trị nồng độ tối thiểu có khả năng ức chế sự phát triển của vi sinh vật một cách gần như hoàn toàn.
Mẫu thô có MIC ≤ 200μg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50μg/ml/ml là có hoạt tính
Kết quả thu đƣợc: Mẫu cặn chiết Cloroform biểu hiện hoạt tính kháng 2 nấm men
S.cereviseae và C.albicans ( xem bảng 3.2, chương 3, kết quả và thảo luận)
2.3.2.2 Sắc kí lớp mỏng khảo sát cặn chiết của thân rễ cây gừng lông hung (Zingiber rufopilosum Gagn.)
Để chất lên bản sắc ký, cần hòa tan hoàn toàn cặn chiết bằng dung môi sao cho dịch thu được có độ loãng hợp lý Sử dụng capilla thủy tinh để chấm chất lên bản mỏng, đảm bảo vệt chấm tròn, nhỏ gọn và cách mép bên 0,5cm, cách chân bản 0,7cm Khoảng cách giữa các vệt chấm nên là 0,5cm và chiều dài của bản mỏng là 6,5cm.
Để tiến hành SKLM, trước tiên cần pha hệ dung môi với tỉ lệ thích hợp và cho vào bình sắc kí, sau đó lắc kỹ để các dung môi hòa tan hoàn toàn Lưu ý rằng lượng dung môi sử dụng phải đủ để sau khi triển khai SKLM, dung môi không được ngập vết chất.
Trong quá trình sắc kí lớp mỏng, bản mỏng được đặt nghiêng 15 độ và phải chấm vào bình sắc kí, giữ bình đứng yên trong suốt quá trình Khi dung môi chạy đến mép trên của bản mỏng 0,3 cm, bản mỏng sẽ được lấy ra và làm khô trước khi hiện sắc phổ bằng các thuốc thử vanillin/H2SO4, Dragendorff và FeCl3 1% (pH=3) Đối với cặn chiết H, hệ dung môi tối ưu được xác định là n-hexan: etylaxetat tỉ lệ 8:2 (v/v), và các vết chất được phát hiện bằng cách phun thuốc thử Kết quả được trình bày trong bảng 3.3 (Chương 3, kết quả và thảo luận) Đối với cặn C, hệ dung môi tối ưu là Cloroform: Acetone tỉ lệ 8:2 (v:v), với các vết chất cũng được phát hiện bằng phun thuốc thử.
Kết quả phân tích cặn E được trình bày trong bảng 3.4 và bảng 3.5 (chương 3, kết quả và thảo luận) cho thấy hiệu quả của hệ dung môi sắc kí tối ưu etylaxetat và cloroform với tỷ lệ 8:2 (v:v) Việc phát hiện vệt chất trên bản mỏng được thực hiện bằng cách phun thuốc thử vanillin/H2SO4 1%, Dragendorff và FeCl3 1%.
2.3.2.3.Phân lập các chất có trong các cặn chiết H, C và E a) Phân lập các chất trong cặn H
Chuẩn bị cột sắc kí có khóa kín ở dưới, dài 100cm và đường kính 4cm Đầu tiên, rửa sạch cột bằng hỗn hợp axit sunfocromic, sau đó rửa lại bằng nước cất và tráng bằng cồn trước khi sấy khô Để đảm bảo cột xoay chuyển dễ dàng, cần tra mỡ silicon vào khóa cột.
+ Nhồi cột theo phương pháp nhồi ướt: Cân lượng silicagel (cỡ hạt
Trộn đều silicagel của hãng Merck (kích thước 0.040-0.060 mm) với dung môi n-hexan trong cốc thuỷ tinh cho đến khi không còn bọt khí Sau đó, mở khoá cột và đổ hỗn hợp silicagel đã chuẩn bị lên cột Sử dụng quả bóp cao su để gõ nhẹ cột nhiều lần cho đến khi bọt khí biến mất Lưu ý không để cột khô và cần giữ cột ổn định sau khi nhồi.
Để tẩm chất, hòa tan 6 gam cặn chiết H bằng n-hexan trong cốc, sau đó từ từ thêm silicagel và lắc đều cho đến khi đạt được 7,2g silicagel Cuối cùng, loại bỏ dung môi để thu được bột silicagel đã tẩm cặn chiết.