Mục đích
Ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem để tạo cây tỏi trắng Hải dương sạch virus.
Nghiên cứu đã hoàn thiện quy trình nhân giống cây tỏi trắng Hải Dương bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, tạo nền tảng cho việc sản xuất giống chất lượng cao nhằm đáp ứng nhu cầu của ngành sản xuất.
Yêu cầu
-Tạo được cây sạch virus từ nuôi cấy meristem
-Xác định được môi trường phù hợp để nâng cao hệ số nhân in vitro.
-Xác định môi trường thích hợp cho tạo củ tỏi in vitro.
- Xác định điều kiện nuôi trồng ex vitro thích hợp (chế độ chăm sóc, bón phân, thời vụ, kích cỡ củ…) cho củ tỏi in vitro
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Phòng Công nghệ Sinh học Thực vật thuộc Viện Sinh học Nông nghiệp - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Trung tâm Ứng dụng Khoa học Công nghệ Hải Dương.
Thời gian nghiên cứu
Đối tượng/Vật liệu nghiên cứu
-Củ, nhánh (tép) (của giống tỏi trắng được thu thập tại Hải Dương) Hình 3.1.
-Chồi in vitro 4 tuần tuổi của giống tỏi trắng được thu thập tại Hải Dương
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Tạo mẫu tỏi in vitro sạch virus:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của kích thước meristem đến khả năng sạch virrus của chồi tái sinh
Môi trường nuôi cấymeristem: MS + 30g sucrose + 1mg BA/l (Nguyễn Thị Thanh Phương và Nguyễn Thị Lý Anh, 2012)
3.4.2 Giai đoạn nhân nhanh: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân nhanh chồi
Lựa chọn công thức cho hiệu quả nhân chồi tốt nhất (X)
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và IBA đến khả năng nhân nhanh chồi
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của tổ hợp BA và NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
X: nồng độ BA tốt nhất 1,0 mg/l
3.4.3 Giai đoạn tạo củ in vitro :
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường đến khả năng tạo củ từ chồi tỏi
Tìm ra nồng độ đường tốt nhất
Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng của tuổi cây in vitro đến khả năng tạo củ in vitro
: Cây 4 tuần tuổi: Cây 1 tuần tuổi: Cây 2 tuần tuổi: Cây 3 tuần tuổi
Thí nghiệm 7: Nghiên cứu ảnh hưởng của kích cỡ củ in vitro khác nhau đến khả năng sống và sinh trưởng ngoài vườn ươm
Kích cỡ củ in vitro ra ươm tốt nhất
Giá thể trồng cây: Giá thể + đất sạch giàu dinh dưỡng Tribat (trong đó có đất phù sa + mùn dừa+ trấu hun) , tuổi củ in vitro: củ 3 tháng tuổi.
Thí nghiệm 8: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời vụ trồng tỏi khác nhau đến khả năng sống và sinh trưởng của củ in vitro ngoài vườn ươm
Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật
* Cách bố trí thí nghiệm:
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức bố trí 10 mẫu và nhắc lại 3 lần.
Các thí nghiệm in vitro được tiến hành theo phương pháp nuôi cấy mô hiện hành.
- Điều kiện thí nghiệm: các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:
+ Cường độ ánh sáng: 2000-2500 Lux
+ Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối
Môi trường nuôi cấy nền sử dụng môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) với các thành phần gồm agar 5g/l, đường saccarose 30g/l và pH được điều chỉnh ở mức 5,8 Các chất điều tiết sinh trưởng sẽ được bổ sung vào môi trường tùy thuộc vào từng thí nghiệm cụ thể Để đảm bảo vô trùng, môi trường này được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 độ C trong 20 phút với áp suất 1 atm.
Cắt bỏ phần thân và đế củ tỏi, sau đó tách vỏ bao bên ngoài và chia thành từng tép Tiếp theo, rửa sạch các tép tỏi dưới vòi nước chảy nhiều lần.
- Khử trùng bằng NaDCC 5g/l : Mẫu trước khi tách đỉnh sinh trưởng được khử trùng 1 lần bằng cồn 70% trong 1 phút, rồi tráng lại bằng nước cất vô trùng 1 -
2 lần, tiếp đó sử dụng Sodium Dichloroisocyanurate (NaDCC) (C3Cl2N3NaO3) pha trong nước cất vô trùng với nồng độ 5g/lít trong 5 - 20 phút rồi chắt bỏ nước, để khô mẫu.
Khử trùng mẫu bằng HgCl 2 0,1% là quy trình quan trọng trước khi tách đỉnh sinh trưởng Đầu tiên, mẫu được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó rửa lại bằng nước cất vô trùng 1 - 2 lần Tiếp theo, mẫu được xử lý bằng dung dịch HgCl 2 0,1% trong khoảng thời gian từ 5 đến 15 phút Cuối cùng, mẫu cần được rửa sạch 3 lần bằng nước cất vô trùng để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong quá trình nghiên cứu.
Các thao tác khử trùng được thực hiện trong box cấy vô trùng.
Bước 3: Tách meristem (đỉnh sinh trưởng) bằng cách đặt các tép tỏi đã khử trùng vào đĩa petri vô trùng trong box cấy Sử dụng dao mũi mác và panh đã khử trùng để loại bỏ phần thịt củ bên ngoài, chỉ giữ lại từ 1 đến 3 lá bao nguyên thủy, sau đó chuyển mẫu lên kính hiển vi soi nổi.
Kính hiển vi với độ phóng đại 30 lần đã được vệ sinh bằng cồn 70 độ Sau đó, đặt mẫu dưới kính và sử dụng dao phẫu thuật cùng dao mũi mác để tiến hành thao tác cần thiết.
+ Dùng dao mũi mác tách bỏ các lá bao còn lại, đỉnh sinh trưởng lộ ra là phần lồi, hình cầu trong, rất bé tận cùng phía trong.
Sử dụng dao phẫu thuật để cắt phần hình cầu từ trên xuống dưới với kích thước từ 0,1 đến 1,0 mm, sau đó đưa vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo đã được chuẩn bị sẵn.
Phương pháp đánh giá mức độ sạch virus của chồi tái sinh bằng kỹ thuật RT-PCR:
Mỗi đỉnh sinh trưởng được cấy vào bình nuôi độc lập và đánh số để phân dòng, nhằm đánh giá và chọn dòng sạch virus Sau khi nuôi cấy tái sinh, chồi tỏi được chuyển sang môi trường MS với 30g saccarose và 5g agarose/l, pH 5,8, giúp chồi phát triển khỏe mạnh và cứng cáp Lá từ chồi này sẽ được sử dụng để kiểm tra độ sạch virus, trong khi mẫu chồi vẫn được đánh số theo dòng của đỉnh sinh trưởng ban đầu.
Mẫu meristem được chọn ngẫu nhiên theo từng công thức kích thước và sau đó được kiểm tra tại Trung tâm Nghiên cứu Bảo vệ Sức khỏe Cây trồng và Vật nuôi thuộc Học viện Nông nghiệp Việt Nam bằng phương pháp chuyên môn.
RT - PCR đối với họ potyvirus gây bệnh phổ biến nhất trên cây tỏi.
Sau khi xác định các dòng tỏi tái sinh sạch bệnh virus, chúng sẽ được lưu trữ và nhân nhanh để làm vật liệu cho các thí nghiệm tiếp theo, trong khi các dòng không sạch virus sẽ bị loại bỏ.
Chiết RNA tổng số: Quy trình chiết tách RNA tổng số bằng phương pháp LiCl của Chang et al (1993).
-Ủ đệm CTAB + β-ME (10 àl/ ml đệm) ở 60 o C trong 30 phỳt bằng bể nhiệt.
- Lấy 0,2 g mô lá bệnh, nghiền trong 1ml đệm CTAB bằng chày cối sứ Cho dịch nghiền vào tube 1,5ml, ủ 60 o C 30 phút.
-Li tâm 13000g trong vòng 5 phút để loại bỏ tàn dư, thu dịch trên
- Cho Chloroform/Isoamyl (24:1) vào tube với thể tích tương đương, trộn đều.
-Li tâm 13000g trong vòng 10-15 phút, thu dịch trên.
- Cho Chloroform/Isoamyl (24:1) lần 2 vào tube với thể tích tương đương, trộn đều.
-Li tâm 13000g trong vòng 10-15 phút, thu dịch trên.
-Li tâm 13 000 g trong thời gian 15 phút, thu cặn RNA.
-Rửa cặn 2 lần bằng Ethanol 70%.
-Để khô tự nhiên trong không khí tối thiểu là 30 phút.
- Hoà tan cặn RNA trong 50 àl nước cất vụ trựng (hoặc nước DEPC) và bảo quản - 80 o C.
The RT-PCR reaction is conducted using two enzymes, MMuLV and Dreamtaq from Fermentas This reaction takes place in a 0.5 ml Eppendorf tube and includes specific components essential for the process.
Mồi xuôi dòng Mồi ngược dòng ReverseAid Dream Taq RNA Tổng thể tích
Phản ứng RT-PCR được thực hiện trên máy PCR PTC-100 (MJ Research Inc.) với quy trình bao gồm tổng hợp sợi cDNA trong 30 phút ở nhiệt độ 45 oC hoặc 48 oC, sau đó là bước biến tính ở 94 oC trong 4 phút Tiếp theo, quy trình trải qua 35 chu trình PCR, bao gồm biến tính ở 94 oC trong 40 giây, gắn mồi ở 52 oC trong 35 giây và tổng hợp sợi ở 72 oC trong 1 phút 30 giây Cuối cùng, phản ứng được kết thúc bằng cách duy trì ở 72 oC trong 5 phút Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1% bằng đệm.
TAE X 0.5 và chứa 0.5 mg/mL ethidium bromide Gel được chạy trên thiết bị điện di là Mini-Sub Cell (Biorad) với đệm TAE 0.5X ở điện thế 100 V trong 25 - 30 phút Bản gel được kiểm tra dưới ánh sáng tử ngoại và được chup ảnh.
Phương pháp trồng củ in vitro tại vườn ươm
Giá thể trồng cây bao gồm giá thể và đất sạch giàu dinh dưỡng, như Tribat với thành phần đất phù sa, mùn dừa và trấu hun Để đạt hiệu quả tối ưu, nên sử dụng củ 3 tháng tuổi trong phương pháp in vitro Phân bón phù hợp là phân đầu trâu 502 và atonik để cung cấp dinh dưỡng cần thiết cho cây trồng.
Các chỉ tiêu theo dõi
Các chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ một tuần một lần:
-Tỷ lệ mẫu sạch (%) = (Số mẫu sạch/Tổng số mẫu thí nghiệm) x 100.
-Tỷ lệ mẫu sống (%) = (Số mẫu sống/Tổng số mẫu thí nghiệm) x 100.
-Tỷ lệ mẫu bật chồi (%) = (Số mẫu bật chồi/Số mẫu sống) x 100.
-Tỷ lệ mẫu tạo rễ (%) = (Số mẫu tạo rễ/Số mẫu sống) x 100.
-Số chồi /mẫu = Tổng số chồi thu được/ Tổng số mẫu bật chồi.
-Chiều cao trung bình chồi (cm) = Tổng chiều cao chồi/ tổng số chồi
-Số lá trung bình (lá) = Tổng số lá/Tổng số chồi tạo thành.
-Hệ số nhân (chồi/mẫu) = Tổng số chồi tạo thành/Tổng số mẫu bật chồi.
- Số rễ TB của chồi = Tổng số rễ / Tổng số chồi ra rễ.
-Chiều dài TB rễ (cm) = Tổng chiều dài rễ dài nhất / Tổng số mẫu ra rễ.
Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu được tính toán trên máy tính theo chương trình Microsoft Excel và chương trình IRRISTAT5.0.