TỔNG QUAN
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NƯỚC NGOÀI
Lịch sử pectinase bắt đầu từ việc nghiên cứu cấu trúc pectin và cơ chế hoạt động của enzym pectolytic trong việc phân hủy pectin Qua nhiều thập kỷ, sản xuất pectinase từ vi sinh vật đã trở thành một lĩnh vực nổi bật Đồng thời, nhiều báo cáo đã được công bố về việc ly trích các chủng vi sinh vật này.
Aspergillus spp từ nguồn phụ phẩm giàu pectin được tối ưu hóa để sản xuất enzyme pectinase Chủng A niger là nguồn pectinase phổ biến nhất, được ứng dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm nhờ vào các chất chuyển hóa an toàn mà nó tạo ra.
Một loài A niger hoang dã được phân lập từ vỏ quả cam hư đã được lên men trong môi trường rắn với chất nền là vỏ quả cam và bưởi để sản xuất pectinase Enzyme pectinase thu được được sử dụng để thủy phân pectin trong quá trình sản xuất nước ép táo, mang lại sự gia tăng đáng kể về năng suất, cải thiện độ trong, độ nhớt và hàm lượng đường hòa tan trong nước ép này Năm 2008, nhóm nghiên cứu của Evrim Taskin đã tiến hành sàng lọc các chủng.
Aspergillus spp được phân lập từ vườn nho để nghiên cứu khả năng sản xuất enzyme pectinase Các chủng nấm được đánh giá dựa trên đường kính vòng thủy phân pectin và kích thước khuẩn lạc trong môi trường nuôi cấy với pectin là nguồn carbon duy nhất Cuối cùng, 4 chủng nấm đã được lựa chọn cho các thí nghiệm lên men.
The results indicate that Aspergillus foetidus var pallidus Ege-K-730 and Aspergillus aculeatus Ege-K-355 exhibit the highest pectinase production capabilities Additionally, Aspergillus foetidus var pallidus K-635 and Aspergillus aculeatus K398 demonstrate the largest diameter in pectin hydrolysis Furthermore, Aspergillus carbonarius CFTRI also contributes to these findings.
1047 được sử dụng làm chủng tham chiếu.
Trong quá trình lên men chìm (SmF), các chủng Ege-K-730, Ege-K-355, Ege-K-635 và CFTRI 1047 đã sinh tổng hợp PG (polygalacturonase) và PMG
Ege-K-730 là chủng có khả năng sinh tổng hợp polymethylgalacturonase (PG) và pectinase (PMG) nhanh nhất so với các chủng khác Trong quá trình lên men ở trạng thái rắn (SSF), các chủng Ege-K-730, Ege-K-635, Ege-K-398 và CFTRI 1047 đều tạo ra mức PG và PMG cao nhất.
Aspergillus spp sinh tổng hợp pectinase trong điều kiện phòng thí nghiệm,
Nghiên cứu của Teshager Dagnachew đã chỉ ra rằng A niger sản xuất pectinase tối đa 1.776 U/ml trên vỏ cam sau 96 giờ ủ trong điều kiện lên men rắn Tác giả đã thử nghiệm với bốn chất nền từ vỏ quả cam và chanh, trong đó vỏ cam cho kết quả tốt nhất Điều kiện tối ưu để A niger sản xuất pectinase là nhiệt độ 30 °C, pH 5, độ ẩm 1,5%, sử dụng 1,5 ml huyền dịch chứa bào tử nấm, cùng với nguồn carbon từ lactose hoặc maltose và nguồn nitơ từ chiết xuất nấm men Hoạt động của enzym thô cũng được đánh giá, cho thấy pectinase đạt hiệu suất tối đa ở 50 °C và pH 5.
Nghiên cứu của nhóm tác giả Safia Koser đã khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sản xuất pectin lyase của nấm Aspergillus oryzae Kết quả cho thấy hoạt tính pectin lyase cao nhất xuất hiện vào ngày thứ 3 nuôi cấy trên chất nền vỏ chanh trong điều kiện lên men rắn Để tối ưu hóa khả năng tổng hợp pectin lyase, các điều kiện nuôi cấy, bao gồm các thông số vật lý và dinh dưỡng, đã được điều chỉnh Qua quá trình tối ưu hóa, nồng độ pectin lyase đạt 875 U/ml Các điều kiện tối ưu cho năng suất pectin lyase tối đa bao gồm: vỏ chanh với 5 ml huyền phù bào tử Aspergillus oryzae, pH 5, độ ẩm 70%, nhiệt độ 40 °C, 1% dung dịch glucose vô trùng và 0,2% chiết xuất men như chất bổ sung nitơ Kết quả cho thấy môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả năng sản xuất pectin lyase của Aspergillus oryzae.
Nhằm đánh giá sự ảnh hưởng của nguồn carbon đối với hoạt độ của pectinesterase, endo- và exo- polygalacturonase, nhóm nghiên cứu của Maria
F S Teixeira đã tiến hành nuôi cấy chủng Aspergillus japonicus 586 trong môi trường lỏng bổ sung nồng độ carbon từ các nguồn khác nhau trong 122 giờ với lượng bào tử được cấy vào môi trường 5.10 6 bào tử/ml và được nuôi cấy trong điều kiện khuấy trộn 140 vòng/phút, ở 30 °C Chiết xuất enzym thô từ môi trường nuôi cấy được đánh giá 24 giờ sau khi lọc cho thấy pectinesterease hoạt động tốt nhất khi được bổ sung 0,5% pectin; endopolygalacturonase là 0,2% pectin và 0,2% glycerol; exopolygalacturonase là 0,5% pectin và 0,5% glucose Pectin, glucose và saccharose khi được thêm vào môi trường nuôi cấy ở nồng độ cao thể hiện tác dụng ức chế trên tất cả các enzym được khảo sát [13].
Nghiên cứu của Sara Solis - Pereira so sánh sản xuất pectinase của A niger CH4 trong môi trường lên men rắn (SSF) và lên men chìm (SmF) Kết quả cho thấy, trong SSF, hoạt động của enzym endo- (endo-p) và exo-pectinase (exo-p) không giảm khi thêm glucose, sucrose hoặc axit galacturonic (lên đến 10%) vào môi trường nuôi cấy có pectin, và cả hai enzym đều tăng khi nồng độ carbon tăng Ngược lại, trong SmF, hoạt động enzym giảm mạnh khi thêm glucose hoặc sucrose (3%) vào môi trường nuôi cấy pectin Hoạt động enzym endo-p và exo-p trong SSF cao hơn lần lượt 3 và 11 lần so với SmF, với năng suất tổng thể của SSF cao hơn 18,8 lần đối với endo-p và 4,9 lần đối với exo-p so với SmF.
Những kết quả này chỉ ra rằng điều kiện nuôi cấy A niger CH4 sinh tổng hợp pectinase là khác nhau trong hai hình thức lên men [14].
A study by Vinod Kumar Joshi's team compared the production capabilities of pectin methylesterase (PME) by A niger using apple pomace under solid-state fermentation (SSF) and submerged fermentation (SmF) conditions.
Các kết quả của nhóm này cho thấy, ở cả SSF và SmF, điều kiện tối ưu để A. niger sinh pectinase tốt nhất là pH 4, nhiệt độ ủ 25 °C, thời gian ủ 96 giờ.
Ammonium sulphate trong quy trình lên men rắn (SSF) và diammonium hydro phosphate trong quy trình lên men lỏng (SmF) cung cấp nguồn nitơ tối ưu với tỷ lệ 0,2%, giúp đạt được năng suất PME cao nhất Ngoài ra, natri clorua với tỷ lệ 0,5% trong SSF và mangan sunfat với tỷ lệ 2% trong SmF cũng là các phụ gia quan trọng để tối ưu hóa năng suất PME Tổng quan, SSF cho thấy hiệu quả hoạt động PME cao gấp 2,3 lần so với SmF.
TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC
Trong những năm gần đây, các nhà khoa học Việt Nam đã chú trọng nghiên cứu về enzym pectinase và đã đạt được nhiều kết quả đáng kể trong lĩnh vực này.
Năm 2018, nhóm Phan Thị Thanh Diễm và cs nghiên cứu, phân lập và sàng lọc một số chủng A niger sinh pectinase từ một số vỏ củ, quả ở thành phố
Huế đã xác định được hai chủng nấm mốc M45 và M68 với hoạt tính pectinase mạnh, đạt lần lượt 110,2 U/ml và 98,5 U/ml Qua phương pháp giải trình tự vùng ITS, chủng M45 đã được định danh.
Aspergillus oryzae và Aspergillus flavus (chủng M68) đều có trình tự ITS đã được đăng ký trên GenBank với mã số MH746006 và MH746007.
Nghiên cứu của nhóm Trần Thị Thanh Thuần về enzym pectinase từ chủng A niger đã xác định điều kiện tối ưu cho sự sinh tổng hợp pectinase, bao gồm thời gian 2 ngày, độ ẩm 62% và hàm lượng giống 8%.
Nhóm Trần Ngọc Hùng và cộng sự đã nghiên cứu thu nhận pectinase từ nấm A niger nuôi cấy trên môi trường bán rắn chứa cùi bưởi nhằm nâng cao hiệu quả bóc vỏ tiêu Kết quả cho thấy trong số 9 chủng A niger được nghiên cứu, chủng A niger B2 là chủng sinh tổng hợp enzym pectinase tốt nhất khi nuôi trên môi trường có 12% bột cùi bưởi, với lượng nước bổ sung là 40% Thời gian thích hợp để thu nhận enzyme cũng đã được xác định.
5 ngày, hoạt độ pectinase đạt 4,82 UI/g Chế phẩm pectinase giúp rút ngắn thời gian bóc vỏ tiêu Hiệu suất bóc vỏ đạt 93% sau 28 giờ đối với tiêu đen và
76 giờ đối với tiêu xanh [5].
Vào năm 2011, Lê Thị Thu Trang đã tiến hành nghiên cứu và phân lập chủng nấm mốc A niger từ các loại trái cây giàu pectin Nghiên cứu này nhằm xác định các điều kiện tối ưu cho việc sản xuất enzym polygalacturonase (PG) với hoạt độ cao, cùng với pectinesterase (PE) có hoạt độ thấp.
Chủng A niger PL đã được phân lập thành công, với điều kiện nuôi cấy tối ưu để phát triển sinh tổng hợp enzym PG cao và PE thấp là bổ sung 30 g/l pectin vào môi trường, pH 4,5 và thời gian nuôi cấy 72 giờ Kết quả thu được hoạt độ enzym PG và PE lần lượt là 1,449 U/ml và 0,087 U/ml Tác giả đã tiến hành tinh sạch enzym bằng phương pháp sắc kí qua cột silicagel, dẫn đến việc hoạt độ của PG tăng 2,7 lần so với mẫu enzym thô Phân tích điện di SDS-PAGE xác định được khối lượng phân tử của enzym.
Năm 2008, nhóm tác giả Huỳnh Ngọc Oanh nghiên cứu thu nhận enzym pectinase từ A niger, tinh sạch bằng phương pháp lọc gel và lọc màng Kết quả cho thấy chế phẩm enzym đạt hoạt độ cao nhất 30,01 UI/g sau 48 giờ nuôi cấy bề mặt trên môi trường có pectin-bột cà rốt Phân tích bằng lọc gel với cột Bio Gel P 30 (0,8 x 30 cm) thu được 1 phân đoạn enzym pectinase, tách tạp chất hiệu quả hơn với tốc độ 15 ml/giờ so với 30 ml/giờ Phương pháp lọc màng với tốc độ bơm 150 rpm cho thấy khả năng tinh sạch enzym pectinase từ A niger và enzym nói chung một cách đơn giản và hiệu quả.
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Pectinase vi sinh vật là enzym quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm, chiếm 25% doanh thu enzym toàn cầu Chúng được sử dụng để gia tăng hiệu suất thu hồi dịch quả, cải thiện chất lượng và làm trong nước ép trái cây Pectinase cũng có ứng dụng trong chiết xuất dược liệu và tinh bột không chứa pectin Mặc dù nhiều nghiên cứu về pectinase từ Aspergillus spp đã được thực hiện trên thế giới, Việt Nam vẫn chưa có xưởng sản xuất chế phẩm pectinase và phải nhập khẩu một lượng lớn enzym này hàng năm Việc tìm kiếm các chủng nấm Aspergillus spp có khả năng sinh pectinase cao sẽ thúc đẩy sản xuất trong nước, giảm thiểu nhập khẩu, đồng thời giúp xử lý nguồn phụ phẩm giàu pectin từ ngành chế biến trái cây, rau củ, góp phần bảo vệ môi trường và tiết kiệm chi phí xử lý rác thải.
Khí hậu nhiệt đới ẩm của Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của nấm mốc, đặc biệt là Aspergillus spp., loài nấm có khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase.
Trước bối cảnh hiện tại, chúng tôi đã thực hiện nghiên cứu nhằm xác định các chủng nấm mốc có khả năng sản sinh pectinase với hiệu suất cao, đáp ứng nhu cầu thực tiễn trong ngành công nghiệp.
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Mục tiêu chung: Tìm kiếm các chủng Aspergillus spp có khả năng sinh tổng hợp pectinase cao và ổn định.
Mục tiêu cụ thể: Phân lập và sàng lọc các chủng vi nấm có khả năng sinh tổng hợp pectinase Khảo sát môi trường thích hợp để nuôi cấy
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU
2.1.1 Chủng vi sinh vật thử nghiệm
Các chi Aspergillus sp ly trích từ vỏ cam, bưởi thu thập được từ các sạp trái cây chợ Tân Quy, quận 7, Tp.HCM.
Nước cất vừa đủ 1 lít
Môi trường nuôi cấy lỏng Czapek – pectin
Nước cất vừa đủ 1 lít
Môi trường Czapek – pectin bổ sung agar
Nước cất vừa đủ 1 lít
Nước cất vừa đủ 1 lít
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất giàu pectin và lượng nước đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A niger được thể hiện trong Bảng 2.1 và 2.2.
Cách chuẩn bị môi trường bán rắn
Để chuẩn bị dung dịch nuôi cấy, cho pectin vào nước và đun sôi cho đến khi pectin hoàn toàn tan chảy Tiếp theo, thêm Czapek – dox và khuấy cho tan, sau đó bổ sung các thành phần còn lại cùng với đủ lượng nước để đạt 100 g Cuối cùng, cho hỗn hợp vào bình nuôi cấy và hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 121 °C trong 15 phút.
PHƯƠNG PHÁP
2.2.1 Phân lập các chủng nấm mốc
Gọt bỏ vỏ cam và bưởi để thu thập phần vỏ chứa tinh dầu, sau đó lấy phần vỏ màu trắng cho vào hộp nhựa sạch Đậy nắp hộp và để ở nhiệt độ phòng để quan sát sự phát triển của nấm mốc hàng ngày.
Sau khi ủ từ 3 đến 5 ngày, các khóm nấm mốc sẽ xuất hiện, và cần tiến hành cấy chuyển chúng sang môi trường SDA Theo dõi sự phát triển của các chủng nấm ở nhiệt độ phòng trong khoảng thời gian 3 đến 5 ngày Quá trình cấy chuyển này sẽ được thực hiện nhiều lần cho đến khi mẫu trở nên hoàn toàn thuần chủng, không còn lẫn sợi nấm lạ.
2.2.2 Sàng lọc và định danh chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase
Sau khi cấy các chủng nấm mốc trong 3 đến 5 ngày ở nhiệt độ phòng trên môi trường SDA, việc định danh các chủng nấm mốc được thực hiện bằng cách quan sát cấu trúc đại thể và vi thể Cụ thể, đặc điểm hình thái sợi nấm được quan sát bằng mắt thường, trong khi cấu tạo sợi tơ nấm và bào tử được phân tích qua tiêu bản nấm mốc ở vật kính 40x.
Kết quả từ khóa phân loại của Diba và cộng sự (2007) [20] đã được sử dụng kết hợp với một số khóa phân loại liên quan khác để xác định tên loài nấm mốc tương ứng.
Các chủng nấm mốc thuộc giống Aspergillus sp sẽ được cấy bằng phương pháp cấy điểm lên môi trường thạch Czapek – dox 0,5% có bổ sung 1,5% pectin Quá trình ủ sẽ diễn ra ở nhiệt độ phòng nhằm sàng lọc các chủng Aspergillus sp có khả năng sản sinh enzyme pectinase.
Sau 3 ngày, tiến hành nhuộm mẫu nấm mốc với dung dịch lugol 1% Đổ dung dịch lugol lên bề mặt đĩa thạch, sau khi thêm lugol khoảng 1 - 2 phút, đổ bỏ phần dung dịch lugol dư và đọc kết quả Đường kính vòng thủy phân pectin thể hiện khả năng phân giải pectin của pectinase.
2.2.3 Xác định hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Nuôi cấy các chủng nấm mốc trên môi trường lỏng Czapek – dox 0,5% với pectin 1,5% là một phương pháp hiệu quả Lượng bào tử nấm được sử dụng ban đầu là 2 ml cho mỗi bình nuôi chứa 100 ml môi trường, đạt mật độ 10^6 CFU/ml Quá trình nuôi cấy diễn ra ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày, giúp tối ưu hóa sự phát triển của nấm mốc.
Lọc thu dịch chứa enzym ngoại bào để xác định hoạt tính pectinase bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Czapek – dox 0,5% có bổ sung 1,5% pectin Sử dụng dung dịch lugol 1% để nhuộm màu cho đĩa thạch.
2.2.4 Xác định hoạt độ enzym bằng phương pháp Miller
Hoạt độ pectinase được xác định bằng cách đo lượng đường khử tạo thành sau phản ứng, theo phương pháp quang phổ của Miller (1959) Một đơn vị hoạt độ (UI) pectinase là lượng enzym tối thiểu cần thiết để thủy phân pectin trong 1 phút, tạo ra 1 µmol acid galacturonic, dưới điều kiện chuẩn như 40 °C và pH 5.
2.2.4.1 Xây dựng đồ thị chuẩn
Xây dựng đường chuẩn dựa trên 6 điểm thu được, trong đó trục tung là giá trị
OD540 là nồng độ axit galacturonic (àmol/ml) được đo bằng phương pháp quang phổ ở bước sóng 540 nm Mẫu đối chứng được thực hiện tương tự, chỉ khác ở việc thay dung dịch đường chuẩn bằng nước cất Giá trị OD540 của các mẫu được tính bằng cách lấy OD540 mẫu trừ đi OD540 của mẫu đối chứng.
Bảng 2.1 Chuẩn bị mẫu để xây dựng đồ thị chuẩn galacturonic acid Ống nghiệm
Dung dịch đệm Acetat pH 4.5 (ml)
Nồng độ cuối cùng (àmol/ml)
2.2.4.2 Xác định hoạt độ enzym
Chuẩn bị mẫu thử và mẫu đối chứng theo Bảng 2.4 Đo độ hấp thụ quang phổ của các hỗn hợp phản ứng ở bước sóng 540 nm và so sánh kết quả với đồ thị chuẩn galacturonic acid để xác định lượng đường khử tương đương được giải phóng.
Bảng 2.2 Chuẩn bị mẫu để xác định hoạt độ enzym
Cho vào ống nghiệm Mẫu thử Chứng
Pectin 0,5% (ml) 0,5 0,5 Đệm phosphat 0,01 M, pH 7 (ml) 0,5 0,5
Tổng cộng (ml) 2,5 2,5 Đun sôi cách thủy 5 phút, làm nguội về nhiệt độ phòng
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO ASPERGILLUS SP SINH PECTINASE CAO VÀ ỔN ĐỊNH
2.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất giàu pectin đến khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase
Chủng Aspergillus sp được nuôi cấy trên 5 công thức môi trường bán rắn với các hàm lượng cơ chất giàu pectin khác nhau: 4, 8, 12, 16 và 20% Sau 5 ngày nuôi cấy, hoạt tính pectinase trong canh trường được xác định để chọn công thức có hàm lượng cơ chất tối ưu cho việc sinh tổng hợp pectinase cao nhất Các công thức môi trường này được trình bày trong bảng 2.3, thể hiện sự ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A niger.
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
2.3.2 Ảnh hưởng của lượng nước bổ sung đến khả năng sinh tổng hợp enzym pectinase
Chủng Aspergillus sp được chọn lọc từ thí nghiệm trước đã được nuôi cấy trên 5 công thức môi trường bán rắn, trong đó có bổ sung lượng cơ chất giàu pectin Lượng nước bổ sung vào môi trường rắn thay đổi từ 35% đến 55%, dẫn đến sự thay đổi tương ứng của lượng trấu Sau 5 ngày nuôi cấy, hoạt tính pectinase trong canh trường được xác định nhằm chọn công thức với lượng nước bổ sung phù hợp để đạt được sinh tổng hợp pectinase cao nhất Các công thức môi trường được trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4 Môi trường khảo sát sự ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A niger
CT1 CT2 CT3 CT4 CT5
2.3.3 Xác định thời gian thu nhận enzym pectinase thích hợp nhất
Chủng Aspergillus sp được chọn lọc từ thí nghiệm trước đã được nuôi cấy trên môi trường bán rắn với thành phần và tỷ lệ cơ chất giàu pectin, cùng với lượng nước bổ sung đã được xác định Hoạt tính pectinase trong canh trường nuôi cấy được đo lường sau các khoảng thời gian 3, 4, 5, 6 và 7 ngày để xác định thời gian thu nhận pectinase có hoạt độ cao nhất.
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
PHÂN LẬP CÁC CHỦNG NẤM MỐC TỪ CÁC MẪU VỎ QUẢ
Từ 54 mẫu vỏ quả cam, bưởi để lên mốc tự nhiên ở nhiệt độ phòng đã phân lập được 54 chủng nấm mốc.Kết quảphân lập được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 Số lượng và đặc điểm nấm mốc phân lập từ mẫu vỏ quả cam, bưởi
Số lượng mẫu phân lập
Số chủng nấm mốc phân lập được
Thời gian xuất hiện bào tử (ngày)
4 Vỏ bưởi Tân Triều 24 24 Đen 2 - 3
Chúng tôi đã chọn lọc các chủng nấm A niger bằng cách chỉ lấy những chủng có màu đen và tốc độ mọc trung bình Từ 54 mẫu vỏ quả cam và bưởi, chúng tôi chỉ chọn 1 chủng nấm cho mỗi mẫu để tránh trùng lặp Kết quả là 54 chủng nấm được thu thập, với màu sắc chuyển từ nâu sang đen và thời gian xuất hiện bào tử từ 2 đến 3 ngày.
SÀNG LỌC VÀ ĐỊNH DANH CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH PECTINASE
Khả năng thủy phân pectin của Aspergillus sp được thể hiện trong môi trường thạch Czapek - dox 0,5% với pectin 1,5%, cho thấy rằng các chủng nấm mốc cần sử dụng pectin làm nguồn cơ chất để phát triển Đường kính vòng thủy phân pectin là chỉ số quan trọng để đánh giá khả năng sinh pectinase của các chủng nấm mốc Dựa trên tiêu chí này, quá trình sàng lọc đã được thực hiện để tìm ra các chủng Aspergillus sp có khả năng sinh pectinase từ tổng số 54 chủng nấm mốc đã được phân lập, với kết quả được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Đường kính vòng thủy phân pectin của 14 chủng nấm mốc
STT Mẫu phân lập Số chủng nấm mốc có khả năng sinh pectinase
Ký hiệu mẫu Đường kính vòng thủy phân pectin (mm)
3 Vỏ bưởi da xanh Bến Tre 2/6 BX1 31,0
Kết quả sàng lọc cho thấy có 14 chủng nấm mốc với đường kính vòng thủy phân pectin từ 16 đến 31 mm Trong số đó, chủng BX1 được phân lập từ vỏ bưởi da xanh Bến Tre có đường kính vòng thủy phân pectin lớn nhất là 31 mm Tiếp theo là hai chủng BT3 và BT2, được phân lập từ vỏ bưởi Tân Triều với đường kính lần lượt là 28,5 mm.
Hình 3.1 Vòng thủy phân pectin của 2 chủng BX1 và BT3
1 Khóm nấm; 2 Vòng thủy phân pectin
Theo khóa phân loại Diba và cs (2007) [20], A niger có các đặc điểm sau:
Sau 2 ngày cấy trên môi trường SDA, khóm nấm xuất hiện màu xám ở mặt phải, chuyển dần sang đen từ ngày thứ 3 Khóm nấm có dạng sợi với bề mặt bột rời và lấm tấm, tâm khóm nấm lồi và rìa có lớp tơ trắng Mặt trái khóm nấm cũng có màu xám, cho thấy tốc độ phát triển ở mức trung bình Không có giọt tiết và sắc tố lan ra môi trường.
- Sợi tơ nấm không màu, có vách ngăn.
- Cuống bào tử có vách nhẵn, trong suốt hoặc chuyển sang sẫm màu về phía bọng, kích thước 400 – 3.000 m.
- Bọng hình tròn, đường kính 45 – 70 m.
- Thể bình 2 lớp với đặc trưng là lớp 1 hình trụ dài, lớp 2 hình chai Thể bình đính hết bọng dạng tỏa tia.
- Bào tử cú hỡnh cầu (đường kớnh 3,5 – 5,0 àm), màu nõu sẫm đến đen và bề mặt có gai xù xì.
Kết quả quan sát của 14 chủng nấm mốc cho thấy chúng đều có đặc điểm phù hợp với phân loại của Diba và cs (2007) Tất cả các chủng nấm đều có tốc độ mọc trung bình, với mặt phải có dạng sợi màu nâu chuyển dần sang đen sau ngày thứ 3 Bề mặt nấm có dạng bột rời lấm tấm, tâm khóm nấm lồi và rìa có lớp tơ màu trắng Mặt trái của nấm có màu xám, không có giọt tiết và sắc tố.
Hình 3.2 Hình thái khóm nấm
Kết quả quan sát vi thể được trình bày trong Bảng 3.3 và 3.4.
Bảng 3.3 Các đặc điểm cấu trúc vi thể 14 chủng nấm mốc
Cấu trúc vi thể Sợi tơ nấm Cuống Bọng Thể bình Bào tử
Hình tròn Đường kính (àm)
Lớp 2 hình chai Đính trên bọng dạng tỏa tia
Bảng 3.4 Hình ảnh cấu trúc vi nấm quan sát bằng kính hiển vi
STT Chủng Cấu trúc vi nấm quan sát bằng kính hiển vi Kết luận
Chú thích: 1 Sợi tơ nấm; 2 Cuống bào tử; 3 Bọng; 4 Thể bình; 5 Bào tử.
Dựa trên quan sát cấu trúc đại thể và vi thể từ Bảng 3.3 và 3.4, cả 14 chủng đều thể hiện các đặc điểm đặc trưng của A niger theo phân loại của Diba và cộng sự (2007) [20].
Ví dụ khi quan sát vi thể chủng BX1 thấy có các đặc điểm sau:
- Sợi tơ nấm không màu, có vách ngăn.
- Cuống bào tử có vách nhẵn, trong suốt, kích thước 420 – 2.490m.
- Bọng hình tròn, đường kính 49 – 70 m.
- Thể bình 2 lớp với đặc trưng là lớp 1 hình trụ dài, lớp 2 hình chai Thể bình đính hết bọng dạng tỏa tia.
- Bào tử cú hỡnh cầu (đường kớnh 3,5 – 5,0 àm), màu nõu sẫm đến đen và bề mặt có gai xù xì.
Từ các kết quả trên, chúng tôi kết luận cả 14 chủng nấm mốc phân lập từ vỏ quả cam, bưởi đều là A niger.
XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM BẰNG PHƯƠNG PHÁP KHUẾCH TÁN TRÊN ĐĨA THẠCH
Chọn 3 chủng A niger (ký hiệu BX1, BT2, BT3) có đường kính vòng thủy phân pectin lớn nhất để nuôi cấy trên môi trường lỏng Czapek - dox 0,5% có bổ sung pectin 1,5%, lấy dịch sau nuôi cấy 5 ngày thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Czapek - dox 0,5% có bổ sung pectin 1,5% Kết quả được trình bày trong Bảng 3.5.
Bảng 3.5 Đường kính vòng thủy phân pectin của 3 chủng A niger
STT Mẫu Đường kính vòng thủy phân pectin (mm)
Kết quả trên cho thấy dịch nuôi cấy sau 5 ngày trên môi trường lỏng của chủng A niger BX1 cho đường kính vòng thủy phân lớn nhất (30 mm).
Hình 3.3 Vòng thủy phân pectin của 3 chủng BX1, BT3 và BT2
1 Giếng có đường kính 6 mm; 2 Đường kính vòng thủy phân pectin
XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZYM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ
Hoạt độ pectinase được xác định theo phương pháp của Miller (1959) thông qua việc đo đường khử Đầu tiên, chúng tôi đã xây dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ axit galacturonic chuẩn và giá trị OD540 (Đồ thị 3.1) Kết quả đo cho thấy mối liên hệ rõ ràng giữa các yếu tố này.
OD540 đem so với đồ thị chuẩn để tính ra hoạt độ enzym. Đồ thị 3.1 Đồ thị chuẩn galacturonic acid
Nuôi cấy ba chủng nấm BX1, BT2 và BT3 trên môi trường lỏng Czapek - dox 0,5% với 1,5% pectin, sử dụng 2 ml bào tử nấm cho mỗi bình chứa 100 ml môi trường, đạt mật độ 10^6 CFU/ml Quá trình nuôi cấy diễn ra trong 5 ngày ở nhiệt độ phòng, và hoạt độ enzym thu được được trình bày trong Bảng 3.6.
Bảng 3.6 Hoạt độ enzym của 3 chủng A niger
STT Mẫu Hoạt độ enzym (IU/ml)
Dựa trên các kết quả đạt được, chúng tôi đã chọn chủng A niger BX1 để tiến hành thử nghiệm khảo sát môi trường tối ưu cho vi nấm này trong việc sinh tổng hợp enzyme pectinase với hoạt độ cao.
KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO A NIGER
3.5.1 Ảnh hưởng của hàm lượng cơ chất đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger
Khả năng sinh tổng hợp enzyme pectinase của A niger BX1 bị ảnh hưởng đáng kể bởi hàm lượng cơ chất trong môi trường nuôi cấy nhân tạo, như thể hiện rõ trong Biểu đồ 3.2 Biểu đồ này minh họa mối quan hệ giữa hàm lượng cơ chất và khả năng sản xuất pectinase của vi khuẩn này.
Hàm lượng cơ chất từ 4 đến 20% ảnh hưởng đến hoạt tính enzym pectinase, với mức hoạt động cao nhất đạt 152,12 IU/ml ở 8% pectin, trong khi đó ở 4% pectin, hoạt độ chỉ đạt 120,31 IU/ml Sự gia tăng pectin từ 4% đến 8% làm tăng hoạt tính enzym, nhưng khi pectin vượt quá 8%, hoạt tính giảm do độ nhớt môi trường tăng, ảnh hưởng đến tốc độ phân chia tế bào và quá trình trao đổi chất, dẫn đến sản xuất pectinase thấp hơn.
Công thức 2 với hàm lượng pectin 8% trong môi trường nuôi cấy là tối ưu cho chủng A niger BX1, giúp sinh tổng hợp pectinase với hoạt độ cao nhất Do đó, chúng tôi đã chọn công thức môi trường số 2 để thực hiện các thử nghiệm tiếp theo.
3.5.2 Ảnh hưởng của lượng nước đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger
Chủng A niger BX1 được nuôi cấy trên môi trường có hàm lượng pectin là
8%, lượng nước bổ sung vào môi trường trong các thí nghiệm thay đổi: 35,
Trong quy trình nuôi cấy nấm mốc, tỷ lệ trấu từ 40% đến 55% cần điều chỉnh theo lượng nước để đảm bảo độ ẩm tối ưu cho sự phát triển của vi nấm Sau 5 ngày nuôi cấy, dịch nuôi cấy được thu và hoạt tính pectinase được xác định, như thể hiện trong Biểu đồ 3.3 Kết quả cho thấy, lượng nước có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng sinh tổng hợp pectinase, nhấn mạnh tầm quan trọng của độ ẩm trong môi trường nuôi cấy.
Kết quả thử nghiệm chỉ ra rằng hoạt tính enzym phụ thuộc vào lượng nước trong môi trường nuôi cấy, đạt cao nhất khi bổ sung 45% nước Phát hiện này hỗ trợ trong sản xuất, vì lượng nước ban đầu ít giúp tiết kiệm chi phí Do đó, chúng tôi quyết định chọn công thức 3 cho các thử nghiệm tiếp theo.
3.5.3 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp pectinase của A.niger
Nghiên cứu nuôi cấy chủng A niger BX1 trên môi trường bán rắn với hàm lượng pectin 8% và lượng nước bổ sung 45% cho thấy hoạt độ enzym pectinase có sự biến đổi rõ rệt theo thời gian nuôi cấy Cụ thể, từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6, hoạt độ enzym tăng dần và đạt giá trị cao nhất vào ngày thứ 6, sau đó giảm xuống vào ngày thứ 7, như thể hiện trong Biểu đồ 3.4.
Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và phát triển của vi nấm Khi thời gian nuôi cấy kéo dài, sự phát triển của vi nấm sẽ giảm, dẫn đến việc lượng enzym mà vi nấm tiết ra vào môi trường cũng giảm theo Kết quả là hoạt độ enzym sẽ suy giảm.
Qua thử nghiệm này, chúng tôi chọn thời gian nuôi cấy chủng A niger BX1 là
6 ngày trên công thức môi trường bán rắn số 3 đã được chọn ở thử nghiệm trước để thu được lượng enzym ổn định và có hoạt độ cao (152,12 IU/ml).