i ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM DỈÅNG VIT PHặNG TUN Sặ DUNG KYẻ THUT PCR TRONG CHỉN ÂOẠN BÃÛNH TÄM CHÃÚT SÅÏM V ÂÃƯ XÚT BIÃÛN PHẠP PHNG TRË LÛN VÀN THẢC SÉ KHOA HC NÄNG NGHIÃÛP Chun ngnh: NI TRÄƯNG THY SN M säú: 60.62.03.01 62.03.01 NGỈÅÌI HỈÅÏNG DÁÙN KHOA HC PGS.TS NGUÙN QUANG LINH HUẾ - 2015 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa có cơng bố cơng trình nghiên cứu Tơi tin tưởng thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Thừa Thiên Huế, tháng năm 2015 Tác giả Dương Viết Phương Tuấn ii LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa học cao học K19 (niên khóa 2013-2015), luận văn tốt nghiệp, xin chân thành cảm ơn tạo điều kiên Trường đại học Nông Lâm, Đại Học Huế phịng Đào tạo sau đại học Trường đại học Nơng Lâm Đặc biệt xin chân thành cảm ơn thầy giáo, PGS.TS Nguyễn Quang Linh Người hướng dẫn khoa học tận tình hướng dẫn cho tơi suốt q trình thực đề tài hoạt động nghiên cứu Các thầy cô giáo giảng dạy suốt trình học tập khoa Thủy sản, Trường đại học Nông Lâm Qua đây, xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Chi cục Thú Y, tỉnh Quảng Bình Sở Nơng nghiệp Phát triển nơng thơn tỉnh, Cơ quan thú y vùng Trung tâm chẩn đốn Nam Khoa, Hồ Chí Minh tạo điều kiện giúp đỡ hỗ trợ nhiệt tình cho tơi hoàn thành luận văn thạc sỹ khoa học Xin cảm ơn gia đình, bạn bè, người thân ủng hộ động viên tơi suốt q trình học tập Tuy nhiên, kiến thức vô hạn nên chắn đề tài khơng tránh khỏi thiếu sót, mong nhận thơng cảm, chia góp ý để luận văn hồn thiện hơn! Trân trọng cảm ơn! Huế, ngày 12 tháng năm 2015 Học viên thực DƯƠNG VIẾT PHƯƠNG TUẤN iii MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn Chương TỔNG QUAN CÁC VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NUÔI TÔM CHÂN TRẮNG 1.1.1 Tình hinh nghề nuôi tôm thẻ chân trắng giới 1.1.2 Tại Việt Nam 1.1.3 Tình hình ni tơm thẻ chân trắng Quảng Bình 1.2 TỔNG QUAN VỀ DỊCH BỆNH EMS TRÊN TÔM 1.2.1 Tình hình dịch bệnh EMS giới 1.2.3 Tình hình dịch tể bệnh EMS Quảng Bình 1.3 ĐẶC ĐIỂM VÀ TÍNH CHẤT GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN 10 1.3.1 Nghiên cứu đặc điểm gây bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus 10 1.3.2 Dấu hiệu nhận biết triệu chứng tôm chết sớm 16 1.4 TỔNG QUAN VỀ KỸ THUẬT PCR ĐỂ CHẨN ĐỐN BỆNH TƠM CHẾT SỚM 18 1.4.1 Khái niệm nguyên lý hoạt động 18 1.4.2 Các bước biến tính chu kỳ 19 1.4.3 Trình tự DNA cần nhân 20 1.4.4 Đoạn mồi (Primer) 20 1.4.5 dNTP (deoxy nucleoside triphosphate) 21 1.4.6 Enzyme DNA polymerase chịu nhiệt 21 1.4.7 Dung dịch đệm cho phản ứng PCR 21 1.4.8 Ứng dụng PCR thủy sản 21 1.4.9 Các phương pháp giải trình tự gene 22 CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG, THỜI GIAN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Đối tượng khách thể 27 2.1.2 Thời gian nghiên cứu: 27 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 27 iv 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 27 2.2.1 Các nội dung nghiên cứu 27 2.2.2 Các tiêu nghiên cứu 27 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Sơ đồ nghiên cứu 28 2.3.2 Bố trí thí nghiệm 28 2.4 VẬT LIỆU, PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 29 2.4.1 Dụng cụ máy móc 29 2.4.2 Vật liệu làm thí nghiệm 29 2.4.3 Phương pháp thu mẫu 29 2.4.4 Phương pháp nuôi cấy định danh vi khuẩn 29 2.4.5 Quy trình PCR 31 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VÀ TÍNH NGUY HẠI CỦA BỆNH EMS TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG Ở QUẢNG BÌNH 34 3.2 ĐẶC ĐIỂM VI KHUẨN V PARAHAEMOLYTICUS 36 3.2.1 Dấu hiệu bệnh lý tôm thu từ ao nuôi 36 3.2.2 Kết nuôi cấy phân lập V.parahaemolyticus 37 3.2.3 Đặc điểm hình thái 38 3.2.4 Đặc điểm sinh hóa vi khuẩn V parahaemolyticus 38 3.2.5 Kết giám định PCR 40 3.3 Kết giải trình gen 16S 40 3.3 BIỆN PHÁP PHỊNG TRỊ BỆNH EMS TRÊN TƠM THẺ CHÂN TRẮNG Ở QUẢNG BÌNH 49 3.3.1 Kết điều tra kháng sinh chế phẩm sinh học 49 3.3.2 Các biện pháp kỹ thuật khác áp dụng 50 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 4.1 Kết luận 57 4.2 Kiến Nghị 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 PHỤ LỤC 60 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AHPNS : Hội chứng hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome) BTC : Bán thâm canh CP-QB : Giống cơng ty CP Quảng Bình CTV : Cộng tác viên ĐBSCL : Đồng sông Cửu Long EM : Effective microoganisms EMS : Hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome) FAO : Tổ chức Liên Hợp Quốc Thực phẩm Nông nghiệp IHHND MBV : Bệnh hoại tử quan tạo máu quan biểu mơ : Bệnh cịi cọc NN& PTNT : Nơng nghiệp Phát triển nông thôn NTTS : Nuôi trồng thủy sản OR : Tỷ suất chênh (Odd Ratio) PCR : Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction) RR : Nguy tương đối (Relative Rick) TNHH : Trách nhiệm hữu hạn TC : Thâm canh TCBS : Thiosunfate Citrate Bile Salts Sucrose TLC : Tỷ lệ chết Vibrio spp : Các loài khác thuộc giống Vibrio VP : Vibrio parahaemolyticus Vibrio spp : Các loài khác thuộc giống Vibrio VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm WSSV : Hội chứng vi rút đốm trắng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích, sản lượng suất tôm thẻ chân trắng qua năm Bảng 1.2 Tình hình dịch bệnh tơm ni tỉnh Quảng Bình qua năm 10 Bảng 1.3 Các số nhận biết trước bệnh EMS xảy 16 Bảng 1.4 Các dấu hiệu nhận biết trước bệnh EMS xảy 17 Bảng 2.1 Phân bố phiếu điều tra cấu lấy mẫu 28 Bảng 2.2 Chuẩn bị PCR mix: theo bảng 32 Bảng 2.3 Chương trình PCR 32 Bảng 2.4 Đọc kết 33 Bảng 3.1 Bệnh dịch tình hình bệnh diễn biến qua năm 2012 - 4/2015 35 Bảng 3.2 Tình hình nhiễm bệnh qua chẩn đoán PCR 36 Bảng 3.3 Kết phân lập, kiểm tra vi khuẩn V parahaemolyticus môi trường TCBS 38 Bảng 3.4 Kết thử phản ứng sinh hóa 38 Bảng 3.5 Kết xét nghiệm mẫu nhiễm vi khuẩn VP gây bệnh EMS 40 Bảng 3.6 So sánh trình tự đoạn gen V parahaemolyticus với trình tự tương đồng Genbank công cụ BLAST 49 Bảng 3.7 Hiệu trị bệnh tôm chết sớm kháng sinh vùng điều tra 50 Bảng 3.8 Thử nghiệm biện pháp nâng cao chất lượng giống 51 Bảng 3.9 Quy trình sử dụng EM thứ cấp để quản lý chất lượng nước 52 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Ảnh hưởng bệnh tơm chết sớm bốn tỉnh đồng Nam Bộ Hình 1.2 Cơ chế xâm nhập phage 12 Hình 1.3 Mơ bệnh học gan tụy tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) từ Thái Lan có biểu bệnh EMS/AHPNS (T.W.Flegel) 14 Hình 1.4 Tơm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) có dấu hiệu nhiễm bệnh 15 Hình 1.5 Cấu trúc mô gan tụy tôm khỏe (bên trái) mô gan tụy bị phá hủy AHPND/EMS (bên phải) phân tích kỹ thuật mơ bệnh học 18 Hình 1.6 Sơ đồ phản ứng PCR 19 Hình 1.7 Các mạch đơn có đánh dấu với 32P 23 Hình 1.8 Hình xạ ký tự ghi phim nhạy tia X gel polyacrylamide sau diện di 23 Hình 1.9 Phương pháp Enzyme giải trình tự DNA 24 Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống máy giải trình tự tự động 25 Hình 1.11 Trình tự gen sau điện di mao quản 25 Hình 3.1 Phân bố ổ dịch EMS Quảng Bình theo khơng gian thời gian từ năm 2012 – 2014 34 Hình 3.2 Tơm có dấu hiệu gan tụy teo ruột rỗng 36 Hình 3.3: Ni cấy mơi trường TCBS (trái); hình thái vi khuẩn (phải) 37 Hình 3.4 Kết PCR phát vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh EMS 40 Hình 3.5 Kết so sánh giải trình tự gen V parahaemolyticus với trình tự gen chuẩn.42 Hình 3.6 Kết so sánh giải trình tự gen V parahaemolyticus với trình tự gen chuẩn.44 Hình 3.7 Kết so sánh giải trình tự gen V parahaemolyticus với trình tự gen chuẩn.46 Hình 3.8 Kết so sánh giải trình tự gen V parahaemolyticus với trình tự gen chuẩn.48 PHẦN MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Hội chứng tôm chết sớm (Early Mortality Syndrome - EMS), hay gọi hội chứng hoại tử gan tuỵ cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome – AHPNS), theo báo cáo Hiệp hội nuôi trồng thủy sản giới (WAS), bệnh xuất lần đầu miền nam Trung Quốc vào năm 2009, đến năm 2012, bệnh bùng phát mạnh nước ASEAN Việt Nam, Thái Lan, Malaysia gây thiệt hại to lớn lượng lợi nhuận, thiệt hại cho ngành nuôi tôm giới hàng tỉ USD năm Cho đến nay, bệnh tôm chết sớm vấn đề nhức nhối không người nuôi tôm mà nhà nghiên cứu toàn giới Từ đầu năm 2011, bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến nghề nuôi tôm nước ta với thiệt hại 98.000 46.000 diện tích ni tơm năm 2012 tập trung số tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh, Cà Mau, Bạc Liêu Kiên Giang (Tổng cục Thủy sản, 2013) Đặc biệt, dịch bệnh EMS xuất tỉnh Quảng Bình từ năm 2012 gây chết tơm hàng loạt diện tích lớn Theo số liệu báo cáo tổng kết Chi cục Thú y Quảng Bình năm 2012 dịch bệnh EMS xảy với diện tích 13,6 ha/1.068,9 chiếm 1,27 % tổng diện tích ni tơm; năm 2013 21,97ha/1.068,9 chiếm 2,06 % tổng diện tích ni tơm năm 2014 2,4ha/1.068,9 Dịch bệnh chủ yếu xảy vùng nuôi huyện Quảng Ninh, Bố Trạch, Quảng Trạch TP Đồng Hới (Sở Nông Nghiệp Phát triển Nơng thơn Tỉnh Quảng Bình, 2014) [12] Phương pháp phổ biến dùng để định danh vi khuẩn gây bệnh đối tượng nuôi thủy sản phương pháp sinh hóa truyền thống sử dụng kit API20E/API20 Strep (BioMerieux) (Trần Thị Tuyết Hoa, 2014)[13] Tuy nhiên, phương pháp cần nhiều thời gian cho phân lập, nuôi cấy định danh vi khuẩn Thời gian sử dụng cho phương pháp thường kéo dài khoảng – ngày nên không đáp ứng cho yêu cầu chẩn đoán bệnh Gần đây, phương pháp sinh học phân tử giúp rút ngắn thời gian phát vi khuẩn phát triển; phổ biến dễ áp dụng phương pháp PCR Phương pháp PCR ứng dụng rộng rãi ngành nuôi trồng thủy sản nhằm kiểm tra chất lượng giống, chẩn đốn số bệnh tơm, cá (May Flor, 2013)[21] Phương pháp cho kết nhanh đáng tin cậy Xuất phát từ vấn đề đó, đồng ý giáo viên hướng dẫn Trường đại học Nông Lâm, tiến hành thực đề tài: “Sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đốn bệnh tơm chết sớm đề xuất biện pháp phòng trị” Mục tiêu nghiên cứu - Tìm hiểu đặc điểm gây bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus Hội chứng tôm chết sớm (EMS) tôm thẻ chân trắng (TCT) (Litopenaeus vannamei) Quảng Bình phương pháp chẩn đoán kỹ thuật PCR - Thử nghiệm đề xuất biện pháp phòng trị có hiệu cho người ni tơm Quảng Bình Ý nghĩa khoa học thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Cung cấp thông tin vi khuẩn V parahaemolyticus gây bệnh tôm chết sớm - Ý nghĩa thực tiễn: Sử dụng kỹ thuật PCR phân tích, phát nhanh tác nhân gây bệnh giúp cho có giải pháp phịng trị bệnh tơm nhằm giảm thiểu thiệt hại vi khuẩn gây 55 Bảng 3.10 Các loại thức ăn tôm ăn theo chế độ khác Địa phương Đồng Hới Quảng Ninh Quảng Trạch Bố Trạch Số ao Thức ăn Số lần cho ăn (lần/ngày) Thời gian quạt nước (h/ngày) Thành công Số ao Tỷ lệ % 10 UP1,CP2,3 3-4 12 90,0 Grobet1, CP2,3 3-4 15 66,6 UP1,CP2,3 3-4 16 85,7 10 UP1,CP2,3 3-4 12 80,0 10 Grobet1, CP2,3 3-4 12 80,0 10 UP1,CP2,3 3-4 16 70,0 15 UP1,CP2,3 3-4 16 10 66,6 10 Grobet1, CP2,3 3-4 16 50,0 15 UP1,CP2,3 3-4 12 12 80,0 10 UP1,CP2,3 3-4 12 70,0 10 UP1,CP2,3 3-4 16 70,0 10 UP1,CP2,3 3-4 15 50,0 Việc sử dụng loại thức ăn tùy theo kinh nghiệm người dân giá để họ đầu tư loại thức ăn nào, nhiên quan chun mơn cần có thơng báo khuyến cáo thức ăn phải đảm bảo thành phần bao bì; có giấy phép lưu hành Bộ NN & PTNT; phù hợp tuổi thời gian nuôi với mục tiêu hạ giá thành từ thức ăn nâng cao hiệu sinh trưởng Trong thực tế, chúng tơi theo dõi nhóm thức ăn công ty huyện cho thấy kết bảng 3.10 hộ nuôi sử dụng thức ăn UP giai đoạn từ thả đến tháng (No, N1 N2), sau sử dụng thức ăn CP tháng đến lúc kết thúc có hiệu 56 cao từ 70 - 90 % thành công, không bị dịch bệnh EMS sử dụng số lần ăn - lần/ngày, tháng cho ăn lần/ngày tháng - cho ăn lần/ngày tổng thời gian quạt nước 12 giờ, tháng nuôi từ - giờ, tháng nuôi (8 - 12 giờ) tháng nuôi (từ 12 - 24 giờ), với hộ áp dụng chế độ ăn có giới hạn, số lần ăn tổng số quạt nước trung bình 12 giờ/ngày có hiệu cao tránh dịch bệnh 57 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Tình hình dịch bệnh tơm chết sớm ngày nghiêm trọng có chiều hướng tăng Đồng Hới có số ao bị bệnh thấp Bố Trạch có số ao bị bệnh cao - Các đặc điểm hình thái, kích thước chung vi khuẩn Vibrio, lồi V parahaemolyticus có kích thước đường kính từ – mm, khuẩn lạc có màu xanh, bề mặt trơn nhẵn Lồi bắt màu gam âm, hình que, có uốn cong Chúng có mang gene sản sinh độc tố gây hoại tử gan tụy cấp chết dần - Nhiễm sắc thể V parahaemolyticus có sai khác trình tự gen hình ảnh thể khả gây bệnh gan tuỵ nguyên nhân gây Hội chứng tôm chết sớm - Tỷ lệ số hộ tham gia điều trị cao (84,8%), với loại kháng sinh thảo dược khác nhau, nhóm kháng sinh Oxytetracycline bột sử dụng cao nhất, nhóm loại baymet, Osamet Olimos kể Neomycine tất có hiệu thấp < 30%, hộ sử dụng thảo dược khả dụng hơn, Bokashi trầu áp dụng từ thả có tác dụng tốt (61%) hạn chế bệnh, nhiên có hộ sử dụng Bokashi giai đoạn nuôi tháng nên tỷ lệ không khả dụng mức cao khuyến cáo > 80% an tồn Các sở tơm phải có ao chứa lắng, cải tạo ao thật kỹ, khơng nên dùng hố chất mà dùng EM-vi sinh luân canh đối tượng khác để giảm rủi ro - Tơm giống có nguồn gốc rõ ràng, bệnh gièo trước thả từ 10 15 ngày cho tỷ lệ thành công cao từ 20 - 35%; sử dụng chế phẩm sinh học EM thứ cấp (EM2 EM5) có tác dụng trì tốt màu nước, hạn chế tảo vi khuẩn gây bệnh; chế độ ăn 3-4 lần/ngày giảm dần theo thời gian, kết hợp số quạt nước hợp lý từ - 18 giờ/ngày theo tuổi tơm có hiệu cao 4.2 Kiến Nghị - Trên sở yếu tố nguy chính, cần triển khai hoạt động nhằm ngăn chặn yếu tố nguy kịp thời hạn chế lây lan dịch EMS - Tiếp tục giám sát, lấy mẫu chủ động bệnh phẩm để xét nghiệm bệnh EMS vi khuẩn V Parahaemolyticus gây nên - Triển khai đạo, hướng dẫn biện pháp phịng bệnh, chủ động nguồn dự trử hóa chất Chlorin để dập dịch kịp thời tránh lây lan diện rộng có kết dương tính với bệnh EMS 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Bùi Quang Tề, Lê Ngọc Luân, Nguyễn Thị Biên Thùy, Bùi Quang Tâm, Hoàng Thị Yến, Nguyễn Thị Niên, Nguyễn Văn Thành, Phan Thị Hường (2010), Kết nghiên cứu bênh gan tụy tôm sú (P Monodon) ni Việt Nam biện pháp phịng ngừa [2] Châu Tài Tảo (2014), Tổng quan nuôi tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) giới việt nam, Khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ [3] Diệp Thị Diệu (2009), Ứng dụng kỹ thuật PCR Genotyping (ORF75) nghiên cứu tác nhân gây bệnh đồm trắng tôm sú (Peneaus Monodon), Luận văn tốt nghiệp ngành Bệnh học Thủy sản, Đại học Cần Thơ [4] Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương (2012), Các bệnh nguy hiểm tôm nuôi Đồng song Cửu Long, Tạp chí Khoa học 2012:22c 106-118, Trường Đại học Cần Thơ [5] Lê Hữu Thôi, Trương Quỳnh Như, Nguyễn Hà Giang Đặng Thị Hoàng Oanh (2014), Nghiên cứu ứng dụng qui trình mPCR chẩn đốn đồng thời vi khuẩn edwardsiella ictaluri aeromonas hydrophila thận cá tra (pangasianodon hypophthalmus), Tạp chí khoa học, chuyên san Thủy sản (2014)(2): 12-19, Đại học Cần Thơ [6] Lê Văn Phủng (2001), Một số ứng dụng PCR vi sinh vật y học, Trường Đại học y Hà Nội [7] Nguyễn Quang Linh Hố Thị Tùng (2012), Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus ức chế vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus gây bệnh tôm chết sớm tỉnh Thừa Thiên Huế, Luận văn Thạc sỹ, Đại học Nông Lâm Huế [8] Nguyễn Thị Bích Đào, Nguyễn Văn Khanh, Trần Quang Khánh Vân (2015), Phân lập tuyển chọn chủng Bacillus ức chế vi khuẩn Vibrio paraheamolyticus gây bệnh tôm chết sớm tỉnh Thừa Thiên Huế, 1-2015, 100-111 [9] Nguyễn Văn Công, Pattarawan Chanakul (2013), Mô tả kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) chuẩn đoán bệnh virus đốm trắng tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei, Boone 1931) giai đoạn giống, Tạp chí khoa học Đại học Vinh [10] Sở Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn Tỉnh Quảng Bình (2012), Báo cáo tổng kết 2012 Kế hoạch 2013 [11] Sở Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn Tỉnh Quảng Bình (2013) Báo cáo tổng kết 2013 Kế hoạch 2014 59 [12] Sở Nông Nghiệp Phát triển Nơng thơn Tỉnh Quảng Bình (2014) Báo cáo tổng kết 2014 Kế hoạch 2015 [13] Theo Trần Thị Tuyết Hoa (2014), Phát vi khuẩn vibrio harveyi streptococcus agalactiae phương pháp PCR khuẩn lạc Tạp chí khoa học, chuyên san Thủy sản (2014)(2): 1-6, Đại học Cần Thơ [14] Trần Hữu Lộc, Linda Nunan, Rita M.Redman, Kenvin Fitzsi mmons, Donald V.Lightner (2013), Hội chứng EMS/AHPNS: “Một bệnh gây vi khuẩn” Tạp chí The Global Aquaculture Alliance [15] Trần Nguyễn Diễm Tú Đặng Thị Hoàng Oanh (2012), Chuẩn hóa qui trình PCR phát vi khuẩn Edwardsiella ictaluri, Aeromonas hydrophila Flavobacterium columnare từ máu cá tra Pangasianodon hypophthalmus Tạp chí khoa học 2012:21b 179-187, Đại học Cần Thơ Tài liệu tiếng Anh [16] Richard Frothingham (1996) Applications of the polymerase chain reaction to infectious disease diagnosis Ann Saudi Med 1996, p 657 - 665 [17] FAO Fisheries and Aquaculture Report No 1053 (2013), “FAO/MARD Technical Workshop on Early Mortality Syndrome (EMS) or Acute epatopancreatic Necrosis Syndrome (AHPNS) of Cultured Shrimp (under TCP/VIE/3304)”, Hanoi, Viet Nam, 25–27 June [19] Johnson R., et al (2006), Drug resistance in Mycobacterium tuberculosis Issues Mol Biol p 97-112 [20] Lightner (2013), Chaleenge: Health Management program focuses on “ perfect killer” EMS, November/December 2013 global aquaculture advocate [21] May Flor S Muegue, Jane S Geduspan, Christopher Marlowe A Caipang (2013), Optimization of PCR protocols for the detection of viral pathogens in shrimp aquaculture in the Philippines, European Journal of Experimental Biology, 2013, 3(6):270-275 [22] Pattamarat rattanachuay, 2007 Inhibition of shrimp pathogenic vibrios by extracellular compounds from a proteolytic bacterium Pseudomonas sp W3 Teruhiko Nitoda Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717- 3458 [23] Tanil K., et al (1993) Detection of Mycobacterium tuberculosis in Sputum Samples by Polymerase Chain Reaction Using a Simplified Procedure Journal of clinical microbiology, June 1993, p 1435-1438 60 PHỤ LỤC 61 MỘT SỐ HÌNH ẢNH Thiết bị ly tâm Thiết bị PCR, điện di Mẫu tôm nghi bị bệnh EMS 62 Nuôi cấy môi trường TCBS (trái); hình thái vi khuẩn (phải) Kết PCR 63 Vibrio parahaemolyticus BB22OP chromosome 1, complete sequence Sequence ID: gb|CP003972.1|Length: 3297305Number of Matches: 10 Related Information Range 1: 3071236 to 3071775GenBankGraphicsNext Match Previous Match Alignment statistics for match #1 Score Expect Identities Gaps Strand 987 bits (534) 0.0 538/540(99%) 0/540(0%) Plus/Minus Features: rRNA-16S ribosomal RNA Query TTGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC 60 ||| ||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3071775 Query 61 TTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTC 3071716 GAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGGAGGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 120 64 Sbjct 3071715 GAGCGGAAACGAGTTATCTGAACCTTCGGGGGAGGATAACGGCGTCGAGCGGCGGACGGG 3071656 Query 121 TGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAAT 180 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3071655 TGAGTAATGCCTAGGAAATTGCCCTGATGTGGGGGATAACCATTGGAAACGATGGCTAAT 3071596 Query 181 ACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGC 240 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3071595 Query 241 ACCGCATGATGCCTACGGGCCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTCGCGTCAGGATATGC 3071536 CTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGG 300 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3071535 CTAGGTGGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAGGGCTCACCAAGGCGACGATCCCTAGCTGG 3071476 Query 301 TCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCA 360 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| Sbjct 3071475 TCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCA 3071416 Kết giải trình tự gen vi khuẩn V Parahaemolyticus Tôm chết bệnh EMS 65 Xử lý ao bị dịch bệnh EMS 66 BẢNG ĐIỀU TRA Tỉnh (TP) ……………… Huyện (Quận) …… Xã (Phường) …………… PHIẾU ĐIỀU TRA Tình hình bệnh tôm chết sớm tôm nuôi ………, ngày …… tháng……năm 2014 I Thông tin chung sở: Tên sở điều tra: ………………………………………………… Địa chỉ: …………………………………… Có sổ nhật ký ao ni tơm hay khơng? Có Khơng Khơng biết Diện tích ni tơm thẻ chân trắng: (ha) Tổng số ao: Mật độ thả ni trung bình con/m2 Có ao lắng hay khơng ? Có Khơng Dụng cụ (chài, vợt, thau/chậu, xơ……): Khử trùng dụng cụ q trình ni khơng? Khơng Có Khơng biết Nếu có, khử trùng gì: Xà phịng Iodine Formol KMnO4 (thuốc tím) Chlorine Khác (ghi hoạt chất chính) - Thời điểm khử trùng: Sau dùng dụng cụ - Dụng cụ dùng chung hay riêng cho ao? Trước dùng dụng cụ Chung Nguồn cấp thoát nước: Chung đường Riêng biệt Có hệ thống lưới lọc nước: Khơng Có Nước cấp vào ao loại đây: Nước từ hệ thống sông/kênh/rạch chung cho vùng nuôi Trực tiếp từ biển II Chuẩn bị ao: Cải tạo đáy ao Có Khơng Nếu có cải tạo, làm nào? Nạo vét toàn bùn đáy sau vụ ni: Riêng ao 67 Có Khơng Cày/xới đáy ao: Có Khơng Phơi đáy ao ni: có Khơng Dùng hóa chất để cải tạo đáy ao?: Vôi (ghi tên, liều lượng khoảng?) Khác (nếu khác đề nghị ghi chi tiết dây, ghi tên hoạt chất chính) Tên hóa chất khác: ………… .… 10 Gây màu nước (ni nước) nào? (tích vào thích hợp) Dùng chế phẩm vi sinh Dùng hữu cớ (phân chuồng, phân xanh): Đã ủ Chưa ủ Dùng bột cá/ Bột đậu nành Phân vơ cơ/hóa học (NPK, phân lân ) Khác: Tên……………… III Chọn giống thả giống 11 Mùa vụ thả giống có quyền địa phương thơng báo hay khơng? Có Khơng Khơng rõ 12 Nguồn gốc tơm giống ? ……………Cơ sở:…………………… 13 Có kiểm dịch hay khơng ? Có Khơng Khơng biết (khơng để ý) 14 Cơ sở có tự đem giống xét nghiệm trước mua hay khơng? Có Đốm trắng Taura Nếu có xét nghiệm bệnh đây? Khơng Hoại tử gan tụy cấp tính Đầu vàng IHHNV Bệnh khác (ghi tên bệnh): ……… …………………… … IV Chăm sóc, quản lý ao ni 15 Thức ăn sử dụng: Thức ăn công nghiệp Thức ăn tự chế nấu chín Thức ăn tự chế sơng 16 Các thuốc, hóa chất sử dụng q trình ni: Hóa chất dùng khử trùng nước: Vơi (CaO) Chlorine Formol TCCA Iodine KMnO4 (thuốc tím) BKC Khác: …………… Kháng sinh phòng bệnh: …………………………………….…… Tần suất dùng kháng sinh: ………………lần/tháng Sử dụng kháng sinh vòng ngày vụ nuôi? 17 Hoạt động quan trắc môi trường Cơ sở có tự đo số/chỉ số mơi trường ao ni khơng? 68 Có pH ; Khơng (Nếu có, quan trắc số/chỉ tiêu gì?) Độ ; Kiềm ; Khí độc (H2S, NH3); Độ mặn ; Vibrio; Ơ xy hịa tan (DO) Coliforms; Khác:………… V Tìm hiểu bệnh tơm chết sớm: 18 Trong q trình ni tôm 12 tháng trở lại đây, sở nuôi bị bệnh EMS/AHPNS khơng ? Có Khơng Nếu có mắc vào khoảng tháng … /201…….Tuổi tôm bệnh: ………… (ngày) 19 Triệu chứng tơm bị bệnh có dấu hiệu sau đây? Tôm yếu, lờ đờ, bơi dạt bờ Bỏ ăn Gan tụy có đốm nhỏ màu trắng Gan tụy có đốm nhỏ màu nâu/đen Gan tụy tơm sưng to Có màu ?Trắng đục xanh đenMàu vàng (gạch cua) Gan tụy tơm teo nhỏ có màu gì? Trắng đục xanh đen Màu vàng (gạch cua) Gan tụy bị nhũn/vỡ Gan tụy tơm bình thường Gan tụy có màu sắc khác ………………… Dấu hiệu khác: đốm trắng đầu vàng còi Miêu tả dấu hiệu khác: ……………… 20 Diễn biến bệnh sở nuôi nào? Sau ngày phát bệnh có khoảng % tôm chết Sau ngày phát bệnh có khoảng % tơm chết Sau ngày phát bệnh có khoảng % tôm chết 21 Tỷ lệ chết tích lũy % theo đợt bệnh 22 Mùa vụ bệnh: Mùa xuân (tháng 2-4) Mùa hạ (tháng 5-7) Mùa thu (tháng 8-10) Mùa đông (Tháng 11-01) Quang năm 23 Giai đoạn nuôi tôm bị bệnh: Tháng Tháng Tháng Tháng Bất kỳ 24 Mật độ thả giống tôm thẻ ảnh hưởng đến bệnh: 60-100 con/m2 > 100 con/m2 25 Trước xảy bệnh tơm chết sớm: - Tình trạng mơi trường: + Màu nước ni ……………….màu gì……………………… + DO: Thấp Cao + pH : Thấp Cao 69 + t0: Thấp + NH3: Thấp Cao …………………………………………… Cao - Có thay nước hay khơng ? Có Khơng - Có sử dụng thuốc hay hóa chất khơng ? Có Khơng Loại ? 26 Xử lý ao nuôi tôm bị bệnh: a Thu hoạch Sau tôm chết ngày? ……… ngày b Khơng thu hoạch Có xử lý Hóa chất gì……… Nồng độ…… Khơng xử lý c Điều trị Có Khơng Thuốc/hóa chất gì………………Nồng độ………….Thời gian……… Có hiệu hay khơng? Có Khơng Biện pháp khác: 27 Đánh giá người nuôi bệnh tôm chết sớm: - Là bệnh thường gặp gây hại lớn - Là bệnh không thường gặp, xảy gây hại lớn - Là bệnh khơng nguy hiểm - Khi bệnh xảy có khả chữa trị có hiệu khơng: Có Khơng 28 Theo ông (bà) vùng nuôi tôm, bệnh xảy phổ biến tôm thẻ chân trắng mà gây thiệt hại 40%? Đốm trắng; Hoại tử gan tụy cấp Đỏ thân IHHNV Bệnh khác (chỉ liệt kê bệnh gây thiệt hại 40% ao nuôi): …………… Trong đó: bệnh phổ biến nhất: …………………………………… Tuổi tơm bệnh trung bình: ………… Tháng bệnh nhiều …………… Đại diện sở Người vấn ... đáng tin cậy Xuất phát từ vấn đề đó, đồng ý giáo viên hướng dẫn Trường đại học Nông Lâm, tiến hành thực đề tài: ? ?Sử dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán bệnh tơm chết sớm đề xuất biện pháp phịng trị? ?? Mục... gây bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus Hội chứng tôm chết sớm (EMS) tôm thẻ chân trắng (TCT) (Litopenaeus vannamei) Quảng Bình phương pháp chẩn đoán kỹ thuật PCR 2 - Thử nghiệm đề xuất biện pháp. .. lý nuôi tôm Một số kỹ thuật chẩn đoán phát triển cho số bệnh bệnh việc sử dụng phương pháp phân tử chấp nhận rộng rãi Các nghiên cứu công bố tối ưu việc sử dụng PCR để phát số virus gây bệnh quan