Mục tiêu đề tài
Xác định được các điều kiện ươm trồng phù hợp để sản xuất loài lan Gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) nuôi cấy mô tại Đà Nẵng
Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Nghiên cứu này cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về điều kiện ươm trồng tối ưu cho loài lan Gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) trong môi trường nuôi cấy mô tại Đà Nẵng Những phát hiện này sẽ hỗ trợ trong việc phát triển kỹ thuật trồng lan hiệu quả và bền vững, góp phần bảo tồn và phát triển loài lan quý hiếm này.
Kết quả nghiên cứu sẽ tạo nền tảng cho việc sản xuất nhanh chóng và ổn định nguồn nguyên liệu thuốc từ loài lan quý, từ đó thúc đẩy sản xuất dược liệu phục vụ cho việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu là cây lan Gấm nuôi cấy mô sau 8 tuần tuổi.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học thực vật và Trại thực nghiệm thuộc khoa Sinh - Môi trường, trường Đại học Sư phạm - Đại học Đà Nẵng trong khoảng thời gian từ tháng 8 năm 2015 đến tháng 4 năm 2016.
2.2.1 Phương pháp tạo rễ in vitro cây lan Gấm
Các đoạn chồi đỉnh lan Gấm dài khoảng 3cm và có từ 1 đến 3 lá được tách ra từ môi trường nhân nhanh Chúng được nuôi cấy trên môi trường MS có 3% saccharose, 0,8% agar và bổ sung NAA với nồng độ từ 0,1 đến 0,5 mg/L Sau 8 tuần nuôi cấy, khả năng tạo rễ in vitro được đánh giá dựa trên tỷ lệ chồi tạo rễ (%), số lượng rễ trên mỗi chồi và chiều dài của rễ.
Chồi lan Gấm nuôi cấy in vitro Đưa cây ra vườn ươm Tạo rễ cây in vitro
Khảo sát giá thể Khảo sát phân bón Ánh sáng
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH 5,8 và khử trùng ở 121 o C trong 20 phút Sau đó, mẫu được nuôi trong điều kiện nhiệt độ 25 ± 2 o C, với cường độ chiếu sáng 2000 lux và thời gian chiếu sáng 12 giờ mỗi ngày.
2.2.2 Phương pháp ươm trồng cây lan Gấm nuôi cấy mô ngoài vườn ươm
2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của các loại giá thể lên khả năng sống sót và sinh trưởng của lan Gấm
Cây in vitro 8 tuần tuổi cần được làm quen với nhiệt độ phòng trong khoảng 1 tuần Sau thời gian này, cây sẽ được chuyển ra nhà lưới, nơi chúng được lấy ra khỏi chai và rửa sạch agar dưới vòi nước, sau đó để ráo trong bóng râm khoảng 1-2 giờ.
- Cơ chất: mùn cưa, xơ dừa, đất
(Các giá thể phối phội tổng hợp được phối trộn với tỉ lệ 1:1)
- Các loại giá thể gồm: mùn cưa, xơ dừa, đất + mùn cưa (1:1), đất + xơ dừa (1:1), mùn cưa + xơ dừa (1:1)
Cây in vitro được trồng trên năm loại giá thể khác nhau, bao gồm mùn cưa, xơ dừa, hỗn hợp đất và mùn cưa (1:1), hỗn hợp đất và xơ dừa (1:1), cùng với hỗn hợp mùn cưa và xơ dừa (1:1) Cây con được tưới phun giữ ẩm hai lần mỗi ngày Sau hai tháng chăm sóc trong nhà lưới, việc theo dõi và đánh giá khả năng sống sót cũng như sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro được thực hiện dưới điều kiện nhiệt độ thích hợp.
29 - 34 o C, độ ẩm trong khoảng 60 – 75% thông qua: tỉ lệ sống sót, chiều cao, số lá của cây lan Gấm
2.2.2.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của dinh dưỡng lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm
Sau khi khảo sát để chọn loại giá thể tốt nhất cho sự sinh trưởng của cây lan Gấm, cây in vitro được đưa ra vườn ươm và trồng trên giá thể đã chọn Tiến hành thử nghiệm các loại phân bón N:P:K với các tỷ lệ (30:10:10), (30:15:10), (20:20:20) ở các nồng độ (0,5g/L, 1g/L, 1,5g/L) Phun phân bón định kỳ mỗi 2 tuần và theo dõi sự phát triển của cây qua chiều cao và số lá sau 2 tháng bón phân.
2.2.2.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm
Sau khi khảo sát chế độ dinh dưỡng và xác định chế độ phân bón tối ưu cho sự phát triển của cây lan Gấm, chúng tôi tiếp tục chuyển cây in vitro ra ngoài nhà lưới Mục tiêu là nghiên cứu tác động của ánh sáng đến sự sinh trưởng của cây lan Gấm.
Cây lan con in vitro được trồng trên giá thể và chế độ dinh dưỡng tối ưu, trong điều kiện có và không có che chắn bằng lưới cản quang (1 lớp) Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của ánh sáng đến sự sinh trưởng của cây lan Gấm trong suốt 2 tháng khảo sát.
2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu
Mỗi thí nghiệm được thực hiện ba lần với 10 mẫu, và dữ liệu thu thập được đã được phân tích bằng phần mềm SPSS 16.0 thông qua phép thử Duncan’s test.
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan Gấm
3.2 Ảnh hưởng của giá thể đến khả năng sống sót và sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro ở giai đoạn cây con 20
3.3 Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:10:10) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm 23
3.4 Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:15:10) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm 25
3.5 Ảnh hưởng của phân N:P:K (20:20:20) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm 27
3.6 Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm 29
Hình Tên hình Trang 3.1 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro cây lan Gấm 19
3.2 Khảo sát khả năng sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro 22
3.3 Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:10:10) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro 24
3.4 Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:15:10) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro 26
3.5 Ảnh hưởng của phân N:P:K (20:20:20) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro 27
3.6 Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm in vitro 30
Họ Lan Orchidaceae hiện nay là một trong những họ thực vật đa dạng và phong phú nhất tại Việt Nam, với khoảng 865 loài khác nhau.
Hoa lan, đặc biệt là lan Hài (Paphiopedilinae), nổi bật với vẻ đẹp và sự đa dạng về màu sắc, hình dáng Loài hoa này không chỉ thu hút bởi sắc thái quyến rũ mà còn mang lại giá trị kinh tế cao.
Hồ Điệp (Phalaenopsis Blume), Thanh đạm tuyết ngọc (Coelogyne mooreana) và Thanh lan (Cymbidium ensifolium) không chỉ là những loài lan đẹp mà còn có giá trị dược liệu trong việc chữa bệnh Tuy nhiên, do bị khai thác triệt để, các loài lan này đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng trong môi trường tự nhiên, khiến chúng trở thành nguồn gen quý hiếm cần được bảo vệ.
Chi lan Gấm Anoectochilus, với hơn 40 loài, phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới như Indonesia, Malaysia, Thái Lan, Miến Điện, Việt Nam, Trung Quốc và Philippines Tại Việt Nam, hiện có 12 loài lan Gấm được ghi nhận, chủ yếu tập trung ở Lào Cai, Vĩnh Phúc, Hà Tây, Đà Nẵng, Quảng Nam và Khánh Hòa Cây lan Gấm (Ludisia discolor) là một trong những thảo dược quý có giá trị dược liệu cao, được biết đến tại Châu Á với khả năng điều trị các bệnh về phổi, hỗ trợ hệ thần kinh và chữa vết thương do côn trùng cắn Tuy nhiên, trong những năm gần đây, loài lan Gấm đang bị khai thác quá mức, dẫn đến nguy cơ cạn kiệt nguồn dược liệu và có thể biến mất nếu không có kế hoạch bảo tồn và phát triển hợp lý.
Việt Nam sở hữu hệ sinh thái phong phú và đa dạng, mang lại tiềm năng lớn về tài nguyên cây thuốc, nhưng vẫn phụ thuộc nhiều vào nguyên liệu nhập khẩu cho ngành dược Để phát triển nguồn dược liệu trong nước, cần nghiên cứu và bảo vệ nguồn gen quý như cây lan Gấm, với nhiều thành công trong kỹ thuật nhân giống in vitro Các nghiên cứu như của Chou và cộng sự (2001) về sự nảy mầm của hạt và Shiau cùng cộng sự (2005) trong việc nhân giống cây lan Gấm đã mở ra hướng đi mới Tuy nhiên, bên cạnh việc bảo vệ nguồn gen, cần tìm ra các điều kiện nuôi trồng và mô hình sản xuất phù hợp để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng về dược liệu trong điều trị và sản xuất sản phẩm chức năng.
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu về các điều kiện ươm trồng nhằm sản xuất loài lan Gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) thông qua phương pháp nuôi cấy mô tại Đà Nẵng.
Xác định được các điều kiện ươm trồng phù hợp để sản xuất loài lan Gấm (Ludisia discolor (Ker Gawler) Blume) nuôi cấy mô tại Đà Nẵng
3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn
Nghiên cứu cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về điều kiện ươm trồng tối ưu cho loài lan Gấm (Ludisia discolor) trong quy trình nuôi cấy mô tại Đà Nẵng, nhằm nâng cao hiệu quả sản xuất và bảo tồn loài lan quý hiếm này.
Kết quả của đề tài cung cấp nền tảng cho việc sản xuất nhanh chóng và ổn định nguồn nguyên liệu từ loài lan quý, góp phần vào sự phát triển của ngành dược liệu nhằm phục vụ cho việc chăm sóc và bảo vệ sức khỏe cộng đồng.
Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khái quát sự đa dạng và giá trị dược liệu của các loài lan
1.1.1 Sơ lược về sự đa dạng của các loài lan
Cây hoa Lan (Orchidaceae) là một loài thực vật có hoa, thuộc họ phong lan (Orchidaceae), bộ lan (Orchidales), lớp thực vật một lá mầm (Monocotyledoneae)
[55] Đây là một họ lớn nhất trong giới thực vật có hoa, ước tính khoảng từ 20.000 đến 35.000 loài với hơn 850 chi và phân bổ nhiều nơi trên thế giới [25] [40] [60]
Họ Lan là một nhóm thực vật phân bố rộng rãi, xuất hiện hầu hết trong các môi trường sống, ngoại trừ sông băng và sa mạc Đặc biệt, nhiều loài lan được tìm thấy ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới, chủ yếu tại châu Á, châu Phi và châu Mỹ, những điểm nóng về đa dạng loài Hầu hết các loài lan phát triển như thực vật biểu sinh, bám trên cây khác, đá hoặc vật thể tĩnh để hấp thu chất dinh dưỡng và nước từ không khí, nhưng cũng có nhiều loài sống trong đất ở rừng và đồng cỏ Một số loài lan quý hiếm tồn tại trong các môi trường sống đặc biệt, với quá trình thụ phấn khó khăn và khả năng nảy mầm hạn chế.
Theo Helmut Bechtel (1982), hiện nay lan rừng phân bố trên thế giới gồm
- Châu Á nhiệt đới gồm các chi: Bulbophyllum, Calanthe, Ceologyne, Cymbidium,
Dendrobium, Paphiopedilum, Phaius, Phalaenopsis, Vanda, Anoectochillus
- Châu Mỹ nhiệt đới gồm các chi: Brassavola, Catasetum, Cattleya, Cynoches, Pleurothaillis, Stanhopea, Zygopetalum, Spathoglottis
- Châu Phi gồm các chi: Lissochilus, Polystachiya, Ansellia, Disa
- Châu Úc gồm các chi: Bulbophyllum, Calanthe, Cymbidium, Dendrobium, Eria,
- Vùng ôn đới của Châu Âu, Bắc Mỹ và Đông Bắc Á Châu gồm các chi:
Việt Nam nổi bật với sự đa dạng và phong phú của loài lan, với hơn 1.000 loài hoa khác nhau, đặc biệt là những loài đẹp và có giá trị kinh tế cao Chúng thường sinh sống tại các vùng rừng núi như Cao Bằng, Lào Cai, Huế, Quy Nhơn, Đà Lạt và Pleiku Một số loài lan đặc hữu của Việt Nam thuộc các chi khác nhau, góp phần làm phong phú thêm hệ sinh thái thực vật của đất nước.
Anoectochillus, Bulbophyllum, Calanthe, Cheirostylis, Cleisostoma, Coelogyne, Cymbidium, Dendrobium, Eria, Liparis, Oberonia, Paphiopedilum, Pholidota, Taeniophyllum [49]
Sự khai thác bừa bãi và thiếu chính sách bảo tồn hiệu quả đang đe dọa sự tồn tại của nhiều loài lan trong tự nhiên.
Hiện nay, việc áp dụng thực phẩm và hợp chất tự nhiên từ thực vật trong phòng ngừa và điều trị bệnh, cũng như trong sản xuất thực phẩm chức năng, đang thu hút sự chú ý lớn từ các quốc gia trên toàn thế giới, đặc biệt là tại Việt Nam.
Họ lan (Orchidaceae) không chỉ nổi bật với giá trị kinh tế mà còn có nhiều loài mang giá trị dược liệu, đóng góp quan trọng cho y học cổ truyền toàn cầu Một số loài như Campestris Eulophia, Orchis latifolia và Vanda roxburgii đã thu hút sự chú ý của giới khoa học Các chi lan chủ yếu được sử dụng làm thuốc bao gồm Calanthe, Coelogyne, Cymbidium, Cypipedium và Dendrobium.
Ephemerantha, ERIA, galeola, Gastrodia, gymnadenia, habenaria, ludisia, luisia, Nevilia và thunia chứa nhiều hợp chất dược liệu quý giá như alkaloid và flavonoid Alkaloid, với 214 loài trong 64 chi hoa lan có chứa từ 0,1% trở lên, có tác dụng dược lý đối với con người và động vật Các hợp chất này được sử dụng trong kháng khuẩn, kháng viêm, kháng virus và ức chế khối u Chiết xuất từ Dendrobium pulchellum đã cô lập được bốn loại bibenzyl có khả năng ức chế sự tăng trưởng của tế bào ung thư phổi Bulbophyllum neilgherrense cho thấy hoạt tính kháng khuẩn đối với nhiều loại vi khuẩn Rễ cây Orchis mascula L được sử dụng để điều trị tiêu chảy mãn tính, bệnh lỵ và kiểm soát bệnh tiểu đường Hoạt chất kinsenoside trong A roxburghii có khả năng điều chỉnh hoạt động enzyme chống oxi hóa và tăng cường tế bào β sản sinh insulin Denbinobin từ Ephemerantha lonchophylla cho thấy khả năng chống di căn tế bào ung thư vú Alloxan chiết xuất từ A roxburghii giúp giảm lượng đường trong máu và cholesterol ở chuột tiểu đường Cuối cùng, dịch chiết xuất từ Vanda coerulea và V teres có khả năng trì hoãn quá trình lão hóa do oxy hóa.
ROS, hay còn gọi là các gốc tự do, có thể được kiểm soát thông qua chất chống oxy hóa và các hoạt động chống viêm Năm 2015, Yau và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu về các dược lý sinh học của loài này.
Ảnh hưởng của dinh dưỡng lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm
Cây trồng cần nguồn thức ăn cung cấp dinh dưỡng thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển Chúng hấp thụ khoáng chất từ môi trường và phân bón, đồng thời thực hiện quá trình quang hợp từ nước và carbon dioxide dưới ánh sáng mặt trời Do đó, bên cạnh việc chọn giá thể phù hợp cho lan Gấm, dinh dưỡng cũng là yếu tố quan trọng giúp cây phát triển khỏe mạnh.
Mỗi loại cây và giai đoạn sinh trưởng đều cần loại phân bón và hàm lượng phù hợp để phát triển tốt Cây lan con in vitro được trồng trong nhà lưới trên giá thể đất và xơ dừa theo tỷ lệ 1:1 nhằm khảo sát khả năng sinh trưởng dưới tác động của các loại phân bón và nồng độ tưới khác nhau trong vòng 2 tháng.
3.3.1 Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:10:10) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:10:10) lên sự sinh trưởng của cây lan Gấm được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của phân N:P:K (30:10:10) lên sự sinh trưởng của cây lan
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng 1 cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p