-1- ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA HÓA -   - NGHIÊN CỨU CHIẾT TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÁC HỢP CHẤT TRONG VỎ QUẢ CAM SÀNH (Citrus Sinensis Osbeck L.) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP CỬ NHÂN KHOA HỌC GVHD SVTH Lớp : ThS Đỗ Thị Thúy Vân : Nguyễn Vũ Vịnh : 08CHD -2- MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Với người Việt Nam, cam sành loại quen thuộc, có quanh năm, trồng khắp nơi nước ta Cam sành giống ăn xuất nguồn từ Ấn Độ, miền nam Trung Quốc Việt Nam Trái cam sành dễ nhận ra, nhờ vào lớp vỏ dày, sần sùi, giống bề mặt mảnh sành, thường có màu lục nhạt đến chín màu vàng cam Cam sành có nhiều chất đạm, béo, acid tannic, beta-caroten chất phospho, sắt, calci, kali, magie Ngồi cam sành cịn chứa nhiều vitamin (B1, B2, C), hàm lượng vitamin C cao, gấp khoảng 10 lần so với trái khác Theo nhà khoa học, cam loại trái có chứa tinh dầu mang mùi thơm chứa nhiều vitamin C, vitamin A, canxi chất xơ, bổ dưỡng cho thể.Vitamin B9 (acid folic) có cam giúp ngăn ngừa bệnh tim mạch, phòng bệnh ung thư (đặc biệt ung thư dày quản) chúng giàu chất chống oxy hóa Chất Limonoid cam giúp ngăn ngừa bệnh ung thư có tác dụng giải độc, lợi tiểu Những người thường ăn cam, loại trái có họ hàng với cam quýt, bưởi, chanh có tỉ lệ nhiễm bệnh ung thư (phổi dày) thấp Nước cam chứa nhiều canxi vitamin sản phẩm từ sữa Kết nghiên cứu nhà khoa học Trường Đại học Texas A&M (Mỹ) cho thấy -3- thường xuyên uống nước cam nước bưởi giúp ngăn ngừa lỗng xương chứng bệnh khác Chất canxi tập trung nhiều vỏ cam Vỏ cam cịn có tác dụng chữa bệnh ho có đàm giã rượu hiệu Để tận dụng tối đa lượng canxi có vỏ cam, nên ăn thêm vỏ cam với nước cam cam cắt miếng Nhận thấy ứng dụng to lớn công nghệ thực phẩm, công nghệ dược phẩm, đặc biệt loại chế phẩm có tác dụng có tác dụng kháng viêm, chống ơxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư, kháng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, vi rút, ), giảm đau, hạ sốt, chống độc, chống lỗng xương việc nghiên cứu để xây dựng qui trình chiết tách từ vỏ cam sành, từ xác định thành phần hoạt tính sinh học vấn đề cần thiết Vì lý tơi thực đề tài “Nghiên cứu chiết tách xác định thành phần hóa học hợp chất vỏ cam sành (Citrus Sinensis (L) Osbeck” Mục tiêu nghiên cứu - Xây dựng qui trình chiết tách thành phần hóa học vỏ cam sành - Xác định thành phần hoá học, cấu trúc hợp chất vỏ cam sành hoạt tính sinh học Đối tượng nghiên cứu Vỏ cam sành địa bàn Quảng Nam dịch chiết từ vỏ cam sành phương pháp chiết Soxhlet Phương pháp nghiên cứu -4- 4.1 Nghiên cứu lý thuyết - Thu thập, tổng hợp tài liệu, tư liệu, sách báo nước - Trao đổi kinh nghiệm với chuyên gia, thầy cô giáo đồng nghiệp 4.2 Phương pháp thực nghiệm - Phương pháp lấy mẫu: Quả cam sành mua về, lấy ruột, rửa vỏ thật nước sau phơi khơ, nghiền thành bột mịn - Phương pháp trọng lượng để xác định độ ẩm, hàm lượng tro vỏ cam sành - Phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử AAS để xác định hàm lượng kim loại nặng vỏ cam sành - Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – VIS xác định mật độ quang dịch chiết để chọn dung môi chiết, thời gian, tỉ lệ rắn lỏng thích hợp - Chiết phương pháp chiết soxhlet với dung môi lựa chọn - Phương pháp sắc ký khí ghép phổ khối (GC - MS) nhằm phân tách xác định thành phần hợp chất có dịch chiết - Phương pháp thử hoạt tính sinh học: Hoạt tính kháng sinh hoạt tính chống oxi hóa DPPH Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 5.1 Ý nghĩa khoa học - Cung cấp thông tin khoa học quy trình chiết tách xác định thành phần hóa học hợp chất có vỏ cam sành -5- - Cung cấp vài tư liệu thành phần hóa học có vỏ cam sành làm sở cho nghiên cứu 5.2 Ý nghĩa thực tiễn - Giải thích cách khoa học số kinh nghiệm, thuốc dân gian, ứng dụng vỏ cam sành - Tổng hợp kiến thức hợp chất thiên nhiên mơn hóa dược Bố cục đề tài Đề tài gồm 46 trang có bảng 15 hình Phần mở đầu (4 trang), kết luận kiến nghị (2 trang), tài liệu tham khảo (2 trang) phần phụ lục Nội dung đề tài chia làm chương: Chương 1- Tổng quan (13 trang ) Chương 2- Những nghiên cứu thực nghiệm (3 trang) Chương 3- Kết bàn luận (22 trang) -6- CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 GIỚI THIỆU CÂY CAM SÀNH 1.1.1 Đặc tính sinh thái [1], [2], [3], [4], [6], [14], [15] a Tên gọi - Tên thường gọi : Cam Sành - Tên khoa học : Citrus Sinensis (L) Osbeck b Phân loại khoa học Giới Plantae Ngành Angiospermae Bộ Sapindales Họ Rutaceae Chi Citrus Lớp Eudicots Loài C Reticulata maxima c Phân bố thu hái - Cam sành giống ăn có nguồn gốc từ Ấn Độ, miền nam Trung Quốc Việt Nam -7- - Cam sành trồng khắp nơi Việt Nam, nhiều chủ yếu tỉnh phía Bắc Việt Nam, miền Nam Việt Nam cam sành trồng Tam Bình, Trà Ơn (Vĩnh Long); Cái Bè, Châu Thành, Chợ Gạo (Tiền Giang); Mỹ Khánh, Ơ Mơn (Cần Thơ) Loài đưa vào Mỹ năm 1880, Đại sứ Hoa Kỳ Nhật Bản John A Bingham chuyển sáu cam sành đường tàu từ Sài Gòn tới Dr H S Magee, người phụ trách vườn ươm giống Riverside, California Năm 1882, Magee gửi hai trồng từ hạt chồi tới J C Stovin Winter Park, Florida - Cam Sành phổ biến Âu Châu vào đầu kỷ thứ 15, nhà thương gia Bồ Đào Nha mang từ Ấn Độ Trung Hoa để thay Cam Ba tư trồng vào kỷ 11 Ý qúa đắng Sau họ đem giống Cam Sành phát triễn miền Tây Phi Châu - Đến năm 1493 ông Christophe Colomb đem hạt giống cam tới Haiti để trồng, từ việc trồng cam lan dần đến đão chung quanh Vào năm 1513 nhà thăm hiễm Juan Ponce de Leon người Tây ban nha mang hạt giống cam vào Florida Tiếp theo đó, Cam sành đặt chân đến mãnh đất Anh quốc vào kỷ 16, Hawaii gần cuối kỷ 17 Louisiana kỷ 18 1.1.2 Đặc tính thực vật [3], [5], [7], [11] Cây cam sành giống lai bưởi (Citrus maxima) quít (Citrus reticulata) hồi xưa Thân nhỏ, cao đến khoảng từ - 15 m, cành có gai, thường xanh bóng, dài khoảng 4-10 cm, hình bầu dục, có khía dài, nhỏ, mịn -8- Hoa cam nhỏ có cánh dài 1,3 - 2,2 cm, sáp vàng lợt pha với màu trắng xanh thơm ngát thuộc loại lưỡng tính Trái cam sành dễ nhận ra, nhờ vào lớp vỏ dày, sần sùi, giống bề mặt mảnh sành, thường có màu lục nhạt đến chín màu vàng cam Trái dạng hình trịn có đường kính từ - 12 cm, bên chứa khoảng - 11 múi, với phần thịt mềm nhiều sơ chặt chẽ với nhiều hột có hạch cứng bao xung quanh Bên bao thêm màng mỏng dầy khoảng mm để bảo vệ phần nước bên múi cam Cam trồng từ đến năm bắt đầu hoa cho Thời kỳ phát triễn từ trái non trái chín khoảng đến 12 tháng, tùy theo khí hậu cách trồng quốc gia (hình 1.1) Hình 1.1: Hình ảnh cam sành -9- 1.1.3 Công dụng cam sành [3], [4], [9], [12], [13], [16] a Công dụng phận cam sành - Cam sành có nhiều chất đạm, béo, acid tannic, beta-caroten chất phospho, sắt, calci, kali, magie Ngồi cam sành cịn chứa nhiều vitamin (B1, B2, C), hàm lượng vitamin C cao, gấp khoảng 10 lần so với trái khác - Thân dùng làm gỗ nhiên liệu đốt - Vỏ dùng vị ngọt, the, tính mát; có tác dụng hạ khí đầy, điều hồ tỳ vị dùng làm thuốc trị gan - Lá hoa có chứa tinh dầu dùng việc sản xuất mỹ phẩm ứng dụng dược liệu để trị chứng bịnh đường tiêu hóa, rối loạn thần kinh, sốt, hen suyễn, huyết áp, mệt mỏi nói chung nôn mửa, - Nước cam chứa nhiều canxi vitamin sản phẩm từ sữa nên không dùng làm nước giải khát, mà đặc biệt loại thuốc giữ gìn nhan sắc - Vỏ cam sành có chứa Flavonoit, l-stachydrin, hesperdin, aurantin, acid aurantinic,canxi, Vitamin B9 (acid folic) , tinh dầu ,d-limonen (90%), decyclicaldehyd, alcol linalool, dl-terpineol, alcol nonylic, acid butyric, authranilat metyl este caprylic, Isoflavonoids, Phytoestrogens, Isothiocyanates, Diallylsulffide, Tea polyphenol, antioxidants, chất polymethoxylated flavones, axit citric,vitamin E có tác dụng kháng viêm, chống ơxy hóa, chống dị ứng, chống ung thư, kháng vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, vi rút ), giảm đau, hạ sốt, chống độc, chống loãng xương b Công dụng vỏ cam sành -10- Trong Đông y vỏ cam sành gọi “ trần bì ” Vỏ cam cịn có tác dụng chữa bệnh ho có đàm giã rượu hiệu Cam sành không dùng làm nước giải khát, mà đặc biệt cam cịn loại thuốc giữ gìn nhan sắc Mỗi ngày uống từ đến hai ly nước cam bạn có da căng bóng, không xuất nếp nhăn khuôn mặt  Một số đơn thuốc sử dụng vỏ cam sành [3], [4], [9], [10], [14], [15] Chữa nôn mửa, ợ hơi, đau bụng, tiêu buồn nơn: Trần bì, Hoắc hương 8g Gừng sống miếng, sắc uống (Nam dược thần hiệu) Chữa ho suyễn: Trần bì, Nam tinh, Ðình lịch, vỏ rễ dâu, vị 12g sắc uống (Nam dược thần hiệu) Chữa ho tiếng: Trần bì 12g sắc với 200ml nước, cịn 100ml; thêm đường để vừa ngọt, uống dần ngày (Dược liệu Việt Nam) Chữa ăn không tiêu, đầy bụng, ợ hơi, lỏng: củ Sả 12g, Trần bì 16g, Sơn tra (sao cháy) 12g, sắc với 500ml nước, 200ml Người lớn chia lần uống ngày, trẻ em tuỳ tuổi chia 3-4 lần uống (Dược liệu Việt Nam) Chữa đau sưng tinh hoàn: Hột cam 12-20g sắc lên, pha thêm chút rượu vào uống (Nam dược thần hiệu) Chữa viêm tuyến vú, tắc tia sữa: Hột cam 16g sắc uống (Lê Trần Ðức) Chữa hơng sườn đau tức hay vú sưng đau: Trần bì tán nhỏ, uống lần 4g, ngày uống 2-3 lần, sắc cam 20g, dùng uống (Lê Trần Ðức) -33- chiết có độ hấp thụ lớn (D=1.0795) với màu vàng đậm Vậy tỷ lệ rắn lỏng tối ưu 15g/180ml 3.4 Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng 3.4.1 Ảnh hưởng môi trường Lấy mẫu dịch chiết dung mơi chloroform pha lỗng lần, cho vào ống nghiệm: ống để đối chứng, ống cho HCl, ống cho NaOH vào Màu sắc dịch chiết thay đổi trình bày bảng 3.7 hình 3.7; 3.8 Bảng 3.7 Kết màu sắc dịch chiết môi trường khác Mẫu Mơi trường Hiện tượng Trung tính Màu vàng nhạt Axit Màu không đổi phân lớp Bazơ Màu khơng đổi phân lớp Hình 3.8: Mẫu sau thêm HCl Hình 3.9: Mẫu sau thêm NaOH -34- Nhận xét: Như môi trường không ảnh hưởng đến dịch chiết vỏ cam sành chiết dung môi chloroform 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Lấy mẫu dịch chiết dung môi chloroform bảo quản điều kiện nhiệt độ khác vừa chiết, nhiệt độ phòng để tủ lạnh, sau ngày lấy quan sát màu sắc dịch chiết thu kết thể hình 3.10 bảng 3.8 Hình 3.10: Khảo sát nhiệt độ Bảng 3.8 Kết màu sắc dịch chiết nhiệt độ bảo quản khác Mẫu Điều kiện bảo quản Hiện tượng Vừa chiết Màu vàng Để nhiệt độ phịng Màu thay đổi, Để tủ lạnh Màu thay đổi, -35- Như nhiệt độ không ảnh hưởng đến dịch chiết từ vỏ cam sành chiết dung mơi chloroform 3.5 Xác định thành phần hóa học hợp chất có dịch chiết vỏ cam sành Tiến hành chiết soxhlet bột vỏ cam sành dung môi chloroform nhiệt độ 610C thời gian 6h Thu nhận toàn dịch chiết Đem dịch chiết đo GCMS thu kết thể hình 3.11, hình 3.12 Hình 3.11 Phổ GC-MS dịch chiết vỏ cam sành -36- -37- Hình 3.12 Kết định danh thành phần hóa học hợp chất dịch chiết vỏ cam sành Qua phân tích liệu phổ GC-MS đối chiếu thư viện phổ chuẩn ta thu kết bảng 3.9 Bảng 3.9 Định danh thành phần hóa học hợp chất vỏ cam sành Thời gian Phần lưu (tR) trăm (%) 3.760 0.38 Định danh STT CTPT 4H-Pyran- 41 C6H8O4 one CTCT -38- 2- Methoxy2 5.528 0.22 4- C9H10O2 vinylphenol Alpha3 7.685 0.03 C15H24 Farnesene Tetradecanoi 10.402 0.22 C14H28O2 c acid 12.252 0.14 Aspidinol C12H16O4 13.914 1.34 Phytol C20H40O n7 12.465 0.21 hexadecanoi C16H32O2 c acid 9,12,158 14.157 0.79 Octadecatrie noic acid C18H30O2 -39- 17.121 1.38 Heptadecane C17H36 10 17.881 1.70 Tetracosane H(CH 2) 24H 11 18.653 1.61 Octadecane CH3(CH 2) 16 CH 12 19.532 2.14 Octacosane C28H58 Hexadecane, 13 20.559 1.52 C16H33 1-iodo- 14 21.783 1.52 15 22.741 0.44 Tricosane C23H48 GammaC28H48O2 tocopherol Hentriaconta 16 23.275 1.56 CH3(CH2) 29CH3 ne -40- Stigmastan17 23.619 0.49 C29H48 3-5-diene 18 24.106 1.45 Vitamin E C29H50O2 4H-1benzopyran4-one,2-(3,419 25.095 4.99 dime C9H6O2 thoxyphenyl) -5,6,7trimethoxy 20 25.550 0.80 Campesterol C28H48O 21 26.013 0.68 Stigmasterol C29H 48O -41- C 29H50O Gamma 22 26.713 1.14 sitosterol ,2,3,4tetrachloro9,10dihydro23 28.074 2.39 C19H14Cl 4O3 9,11,12trimethoxy9,10ethenoanthra cene Như : Bằng phương pháp GC-MS định danh dịch chiết vỏ cam sành có 23 cấu tử 4H-1-benzopyran-4-one,2-(3,4-dime thoxyphenyl) -5,6,7-trimethoxy cấu tử chiếm tỉ lệ phần trăm nhiều (4,99%) 3.6 Thử hoạt tính sinh học Lấy mẫu dịch chiết đem cô quay chân không thu cắn gửi mẫu đo hoạt tính sinh học Viện Hóa Học – 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà Nội để thử hoạt tính kháng sinh hoạt tính chống oxy hóa DPPH -42- 3.6.1 Thử hoạt tính kháng sinh Kết thử hoạt tính kháng sinh thể hình 3.13 Hình 3.13 Phiếu kết thử hoạt tính kháng sinh Như mẫu thử khơng thể hoạt tính kháng chủng vi sinh vật kiểm định nồng độ 3.6.2 Thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH Kết thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH thể hình 3.14 -43- Hình 3.14 Phiếu kết thử hoạt tính chống oxy hóa DPPH Như mẫu thử khơng có hoạt tính chống oxy hóa DPPH với nồng độ