BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRỊ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD.) OHWI ET OHASHI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRỊ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD.) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS BÙI TRANG VIỆT TS LÊ THỊ TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh - 2011 LỜI CẢM ƠN Đề tài thực phịng thí nghiệm mơn sinh lí thực vật trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Sư phạm- Tp Hồ Chí Minh, hướng dẫn giúp đỡ Q Thầy Cơ Để hồn thành luận văn này, em chân thành gởi lời cảm ơn đến: Thầy hướng dẫn PGS TS Bùi Trang Việt tận tình hướng dẫn, bảo, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt thời gian làm luận văn Cơ hướng dẫn TS Lê Thị Trung tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm tạo điều kiện thuận lợi để em thực thí nghiệm cho luận văn Em xin chân thành cảm ơn cô TS Dương Thị Bạch Tuyết, cô TS Trần Thị Thanh Thủy, cô TS Trần Thị Cúc, cô TS Nguyễn Thị Mong, thầy TS Phạm Văn Ngọt, thầy PGS TS Bùi Văn Lệ giảng dạy suốt thời gian em học tập trường Em xin chân thành cảm ơn thầy Bộ mơn sinh lí thực vật trường ĐHKHTN: cô TS Trần Thanh Hương, Thầy ThS Phan Ngô Hoang, cô ThS Trịnh Thị Cẩm Tú, cô ThS Trần Thanh Hiền em Hồ Thị Mỹ Linh quản lí phịng thí nghiệm trường ĐHSP cho em mượn dụng cụ hóa chất để thực thí nghiệm Cảm ơn BGH trường THPT Nguyễn Văn Linh dã giúp đỡ để tơi có thời gian hồn thành chương trình học Xin gởi lời cảm ơn đến bạn lớp sinh học thực nghiệm khóa 19, khóa 20, bạn bè đồng nghiệp em sinh viên phịng mơn sinh lí thực vật Cuối cùng, xin nói lời cảm ơn vơ hạn với bố mẹ, người cố gắng nuôi dưỡng dạy dỗ để học tập trưởng thành Chị Nhiên cho em bày tỏ lòng biết ơn tới hai người nhé, có hi sinh định để em thực ước mơ làm cô giáo Cảm ơn bé Trinh nấu cơm cho chị suốt năm qua Cảm ơn anh bên em, yêu thương chia với em sống Tp HCM, tháng năm 2011 Nguyễn Hồ Dịu Thắm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN 4T T MỤC LỤC 4T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4T 4T LỜI MỞ ĐẦU 4T T CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4T T 1 Giới thiệu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 4T T 1.1 Phân loại T 4T 1 Đặc điểm sinh học T 4T 1 Nguồn gốc, phân bố tình hình sản xuất giới T T 1 Thành phần hóa học T 4T 1 Giá trị thực phẩm giá trị dược liệu T T 1 Một số nghiên cứu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi T T 1.2 Sự phát sinh hình thái 4T 4T Định nghĩa T 4T 2 Phương pháp nghiên cứu T 4T Sự phát sinh rễ T 4T Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát sinh hình thái 4T T Vai trò auxin tăng trưởng thực vật T T 1 Sinh tổng hợp vận chuyển auxin T T Auxin phát triển rễ 10 T T 3 Auxin sinh trưởng, phân chia phân hóa tế bào 11 T T Vai trò giberelin tăng trưởng thực vật 11 T T Sự phát 11 T 4T 2 Nơi tổng hợp di chuyển 12 T 4T 3 Tác dụng sinh lí 12 T 4T 3 Vai trò Citokinin tăng trưởng thực vật 13 T T 3 Sự phát 13 T 4T 3 Nơi tổng hợp 13 T 4T 3 Tác dụng sinh lí 13 T 4T Vai trò axit abcisic (AAB) 14 T 4T Vai trò Etilen 15 T 4T CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU- PHƯƠNG PHÁP 16 4T T 2.1 Vật liệu 16 4T T 2 Phương pháp 16 4T 4T 2 Khử trùng mẫu 16 T 4T 2 Nuôi cấy hạt tạo in vitro 17 T 4T 2 Khảo sát ảnh hưởng IAA BA lên khả tạo rễ in vitro 17 T T 2 Khảo sát ảnh hưởng auxin phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp đậu Vigna angularis 17 T 4T 2 Ảnh hưởng auxin lên phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis 18 T 4T 2 Ảnh hưởng auxin nồng độ cao lên phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis 18 T 4T 2 Khảo sát phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp theo thời gian ảnh hưởng auxin 19 T T 2 Khảo sát di chuyển hữu cực auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp 19 T T 2 Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích Vigna angularis ngày tuổi 19 T T 2 10 Đo cường độ hô hấp 19 T 4T 2 11 Đo hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật 19 T T 2 12 Xử lý thống kết thu 20 T 4T CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 21 4T T 3.1 Kết 21 4T T 1 Khử trùng mẫu 21 T 4T Nuôi cấy hạt tạo in vitro 21 T 4T 3 Khảo sát ảnh hưởng IAA BA lên chiều cao khả tạo rễ in vitro 23 T T 4 Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn phát triễn rễ bất định từ khúc cắt trụ hạ diệp đậu Vigna angularis 25 T 4T Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis ngày tuổi 30 T 4T Ảnh hưởng auxin nồng độ cao lên phát sinh rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis ngày tuổi 35 T 4T Khảo sát hình thành rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis ngày tuổi theo thời gian ảnh hưởng nồng độ auxin 37 T T Khảo sát di chuyển hữu cực auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp 38 T T Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích đậu Vigna angularis 39 T T 10 Sự thay đổi cường độ hô hấp chất điều hòa tăng trưởng thực vật trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp Vigna angularis 40 T T Thảo luận 41 4T T Khử trùng mẫu 41 T 4T 2 Ảnh hưởng AIA BA lên khả tạo rễ in vitro 41 T T 3 Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn hình thành phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp 42 T T 4 Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp vị trí theo thời gian ảnh hưởng auxin 5mg/l 44 T T Khảo sát di chuyển hữu cực auxin 44 T T Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích 44 T T Sự thay đổi cường độ hơ hấp hoạt tính chất điều hịa tăng trưởng thực vật phát triển rễ bất định 45 T T CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 4T T 4.1 Kết luận 46 4T T 4 Đề nghị 46 4T T TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 4T 4T PHỤ LỤC 4T T PHỤ LỤC 4T T DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisic acid BA : Benzyl adenin CĐHTTTV : chất điều hòa tăng trưởng thực vật GA R : Gibberellin R IAA : Indole-3-acetic acid MS : Murashige Skoog TLT : trọng lượng tươi LỜI MỞ ĐẦU Ngay từ giai đoạn đầu người biết trồng trọt, họ có ý thức chọn lọc trồng mang đặc tính có lợi cho người Quá trình chọn lọc phải nhiều thời gian, hàng chục hàng trăm năm không mang lại hiệu cao Đến đầu kỉ XX, sinh học đạt nhiều thành tựu lớn khám phá định luật di truyền Mendel, tượng di truyền liên kết Morgan nghiên cứu khác nữa, nhờ tạo trồng mang biến dị tổ hợp nhiều gen có lợi Và kĩ thuật gây đột biến đời góp phần tạo nhiều giống có đặc tính quý Ngày chất lượng sống gia tăng, thị hiếu người phong phú, nhu cầu lương thực, thực phẩm lớn Làm nhân nhanh nhiều giống hay tạo nhiều giống nhằm đáp ứng thị hiếu nhu cầu người vấn đề lớn đặt cho nhà chọn lọc tạo giống vật ni trồng Phát sinh hình thái sở cho vi nhân giống thực vật nên giới nước ta quan tâm Việc phát auxin chất điều hòa tăng trưởng thực vật mở cho nghiên cứu trồng trọt đầy hấp dẫn Auxin kích thích khúc cắt hình thành rễ bất định bước đột phá lớn cho nhân giống thực vật ( Environ, 2007 ) Đề tài “Vai trò auxin phát phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi” thực nhằm tìm hiểu giai đoạn phát triển rễ bất định in vitro đậu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi ảnh hưởng auxin để bổ sung kiến thức phục vụ cho công tác nghiên cứu giảng dạy CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1 Giới thiệu Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 1.1 Phân loại Giới : Plantae Ngành : Angiospermae Lớp : Dicotiledoneae Bộ : Fabales Họ : Fabaceae Chi : Vigna Loài : Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi (Phạm Hoàng Hộ, 1999) 1 Đặc điểm sinh học Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi cỏ niên, thân đứng hay leo, cao 50 đến 80 cm, nhánh có cạnh, có lơng dài Bộ nhiễm sắc thể 2n = 22 Cuống 10 đến 12 cm, có lơng, phụ xoan, đầu trịn, có thùy, dài đến cm, gân phụ đến cặp, bẹ thon, hình lọng, cao mm Chùm nách lá, dài đến 10 cm, đài ngắn; vành vàng, cao 15 mm, lườn xoắn 360 ( Phạm Hồng Hộ, 1999 ) Hoa có màu vàng nhạt với cánh hoa màu vàng chanh xếp thành cặp Quả hình trụ, dài đến 8cm, rộng đến 10mm, khơng có lơng, chứa đến 10 hạt Hạt có hình thn, hai đầu vng, khơng có lơng, dài đến 7mm , đường kính 5mm, màu nâu sẫm ( Hu, 2005 ) Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi giữ năm độ ẩm hạt 13% độ ẩm khơng khí 15% Hạt nẩy mầm đất nhiệt độ đến 10 0C tốt 30 đến P P 34 0C Sau trỉa đến 20 ngày mầm nhô lên khỏi mặt đất So với đậu khác, Vigna P P angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi phát triển chậm nên cần làm cỏ giai đoạn nảy mầm hoa (Brink Belay, 2006) Hình 1.1 Một số phận : a nhánh; b hoa; c.đài; d nhụy; e nhị; f.quả; g hạt (Nguồn: Hu, 2005) Hoa kéo dài 30 đến 40 ngày Cây tự thụ phấn xảy thụ phấn chéo Thời gian sinh trưởng khoảng 60, 80, 90 hoặc120 ngày Rễ cộng sinh với vi khuẩn Bradyrhizobium nên có khả cố định N 100kg N/ ha, số phụ thuộc vào độ ẩm pH đất (Brink Belay, 2006) Vigna angularis sống tốt vùng có khí hậu ấm áp cận nhiệt đới với lượng mưa trung bình năm 500 đến 1750 mm, nhiệt độ từ 15 đến 300C Cây chịu nhiệt độ cao P P nhạy cảm với sương mù Ở nhiệt đới, Vigna angularis thích hợp vùng cao độ pH đất từ đến 7,5 (Brink Belay, 2006) Ở Trung Quốc, Vigna angularis thường trồng xen với ngô kê, cịn Nhật ln canh xen vụ với khoai tây, củ từ hay lúa mì Vigna angularis thường bị nhiễm bệnh nấm, vi khuẩn hay côn trùng công Erysiphe polygoni, Xanthomonas campestris, Matsumuraeses phaseoli … Quả đậu khơng dễ vỡ nên người ta thu hoạch máy gặt Thông thường, người ta cắt tay sau phơi nhiều ngày trước xếp thành đống khơ Khi độ ẩm hạt cịn 16% tiến hành đập Nhiều trái đậu có vỏ mỏng, hạt lại ẩm ướt nên nảy mầm bên vỏ Sản lượng 0,5cm 0,5cm Ảnh 32 Sự hình thành rễ bất định từ khúc Ảnh 33 Sự hình thành rễ bất định từ cắt trụ thượng diệp vị trí mơi trường khúc cắt trụ thượng diệp vị trí MS có bổ sung IAA mg/l sau ngày nuôi môi trường MS có bổ sung IAA mg/l sau 14 ngày nuôi cấy cấy Khảo sát di chuyển hữu cực auxin từ khúc cắt trụ thượng diệp Khi cấy khúc cắt trụ thượng diệp ngược chiều môi trường MS (đối chứng), sơ khởi rễ chưa xuất 60 giờ, rễ chưa xuất ngày nuôi cấy ( bảng 3.9 ) Qua ngày nuôi cấy, khúc cắt trụ thượng diệp môi trường với IAA 1mg/l mọc rễ, nhiên rễ không nằm bề mặt trường (ảnh 3.34 3.35) Bảng Khả phát sinh rễ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis cấy ngược chiều môi trường MS (đối chứng) mơi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l Chỉ tiêu so sánh Thời gian Sơ khởi rễ 60 Vị trí khúc cắt Đối chứng (MS) IAA mg/l 0,00 ± 0,00a 2,29 ± 0,52b1 0,00 ± 0,00 a 1,86 ± 0,47 b1 0,00 ± 0,00 a 1,29 ± 0,29 b1 Số lượng rễ trung bình ngày trung bình (cm) ngày có ý nghĩa mức p= 0,05 P P P P 0,00 ± 0,00 P hàng với mẫu kí tự khác P a bình b1 2,73 ± 0,37 P số trung 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 0,00 ± 0,00 a 1,85 ± 0,63 b1 khác 0,00 ± 0,00 a 1,62 ± 0,23 b1 khác biệt Chiều dài rễ P Các số trung P 2,00 ± 0,58 b1 cột với 2,13 ± 0,17 b1 số P P P P P P 2,53 ± 0,31 b1 P P P bình thứ tự 0,5cm Ảnh 34 Khúc cắt trụ thượng diệp cấy ngược chiều sau ngày môi trường MS 0,5cm Ảnh 35 Sự hình thành rễ bất định cấy khúc cắt trụ thượng diệp vị trí 1, cà ngược chiều mơi trường MS có bổ sung IAA 1mg/l Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích đậu Vigna angularis Vào ngày thứ thứ 12 nuôi cấy in vitro sau ngâm hạt môi trường MS môi trường MS với IAA 0,01; 0,1; 5mg/l, sinh trưởng sai biệt có ý nghĩa ( bảng 3.10 ) Bảng 3.10 Chiều cao diện tích đậu Vigna angularis sau 12 ngày nuôi cấy môi trường MS với IAA nồng độ khác Nồng độ ngày 12 ngày ( IAA mg/l ) Chiều cao Diện tích Chiều cao Diện tích (cm) (mm ) (cm) (mm2) P P P P 0,01 0,1 14,87± 0,85a 15,32 ± 2,02a 16,03 ± 0,7 a 15,09 ± 2,69a 15,00± 0,62a P P P P P 418,29± 40,43 a 379,49 ± 47,85 a 484,91± 66,08 a 338,83 ± 35,37 a 494,39± 52,71 a P P P P P 24,58±1,02 a 25,5 ± 1,5 a 25,27± 1,1 a 24,7 ± 1,16 a 26,4 ± 0,54 a P P P P P 65,07 ± 2,81 a 64,64 ± 5,52 a 69,09 ± 5,59 a 60,07 ± 4,74 a 63,3 ± 4,35 a P P P P P Các số trung bình hàng với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p= 0,05 10 Sự thay đổi cường độ hô hấp chất điều hịa tăng trưởng thực vật q trình phát triển rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp Vigna angularis  Sự thay đổi cường độ hô hấp Cường độ hô hấp vùng tạo rễ bất định từ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis gia tăng theo phát triển rễ, tăng vào ngày thứ sau đặt mẫu vào mơi trường có IAA mg/l, sau tăng mạnh vào ngày thứ (bảng 3.11) Bảng 3.11 Sự thay đổi cường độ hô hấp vùng phát sinh rễ khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis xử lí IAA mg/l theo thời gian Thời gian (ngày) Cường độ hơ hấp (µlO /g TLT /giờ) 187,00 ± 26,20a 231,13 ± 34,36b 307, 81 ± 43,14c R R P P P Các số trung bình hàng với mẫu kí tự khác khác biệt có ý nghĩa mức p= 0,05 Hình Sự thay đổi cường độ hô hấp theo thời gian khảo sát  Sự thay đổi hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh Thời gian Hoạt tính (ng/g) IAA ABA GA R Zeatin Không phát 96,7 Không phát Không phát 391,3 20,3 Không phát Không phát 416,3 24 Không phát Không phát Tại vùng phát sinh rễ khúc cắt trụ thượng diệp cách vị trí đỉnh mm đậu Vigna angularis, xử lý với IAA 5mg/l, hoạt tính IAA tăng lên đạt giá trị 391,3 ng/g vào ngày thứ Sau đó, tiếp tục tăng vào ngày thứ (từ 391,3 ng/g lên đến 416,3 ng/g) Ngược lại, hoạt tính ABA giảm theo thời gian Hoạt tính GA3 zeatin không phát mẫu ( bảng R R 3.12 ) Bảng 3.12 Sự thay đổi hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật theo thời gian khúc cắt trụ thượng diệp Vigna angularis xử lí IAA 5mg/l Thảo luận Khử trùng mẫu Khi đưa mẫu trồng vào ni cấy in vitro cần phải khử trùng mẫu Trong trình thu hoạch cất giữ, hạt dễ bị nhiễm nấm vi khuẩn Hơn nữa, rửa nước hạt bị trương lên, hóa chất khử trùng thấm vào mẫu gây tổn thương mô sống gây ảnh hưởng đến tỉ lệ nảy mầm tạo Vì thế, việc khử trùng mẫu không dễ dàng Kết khử trùng cho thấy, thủy ngân clorua nồng độ 0,1% thích hợp để khử trùng hạt Vigna angularis (Willd.) Ohwi et Ohashi 2 Ảnh hưởng AIA BA lên khả tạo rễ in vitro Trên mơi trường đối chứng, rễ dài, mảnh có nhiều rễ nhánh Nếu bổ sung BA 1mg/l vào môi trường nuôi cấy, rễ ngắn mập Theo Bùi Trang Việt, citokinin giúp gia tăng kích thước tế bào sinh tổng hợp protein Trong thân rễ, citokinin cản kéo dài, kích thích tăng rộng tế bào Như vậy, BA mg/l ức chế tạo rễ in vitro, làm cho rễ ngắn to so với đối chứng Nếu cố định nồng độ BA mg/l đồng thời gia tăng nồng độ IAA ( 0,1; 1; mg/l ) số rễ tăng lên so với mơi trường BA 1mg/l Tỷ lệ auxin citokinin (A/C) có vai trị quan trọng phát triển rễ bất định Do đó, mơi trường với bổ sung IAA mg/l BA mg/l (nghiêng tác động auxin) cho số rễ nhiều hẳn Nồng độ citokinin cao cản tăng trưởng rễ cản hiệu kích thích tạo rễ auxin, nên ni cấy mơ, citokinin coi chất ức chế hình thành rễ (Humphries, 1960) Nếu bổ sung IAA ( 0,1; mg/l ) vào môi trường nuôi cấy, mang nhiều rễ so với mơi trường có kết hợp với BA 1mg/l Rõ ràng, IAA chất điều hòa tăng trưởng thực vật có khả kích thích tạo rễ Tuy vậy, mơi trường có IAA mg/l riêng rẽ hay kết hợp với BA 1mg/l ức chế kéo dài rễ Khi mơi trường ni cấy có kết hợp BA mg/l IAA ( 0,1; mg/l ) có IAA ( mg/l ) hình thành mơ sẹo rễ xảy Mô sẹo khối tế bào khơng phân hóa, phân chia mạnh, thường tạo xáo trộn trình tạo quan, tác động auxin riêng rẽ hay phối hợp với citokinin (Bùi Trang Việt, 2000) 3 Ảnh hưởng auxin lên giai đoạn hình thành phát triễn rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp Cơ thể thực vật trưởng thành thể thống gồm nhiều quan có chức khác bắt nguồn từ tế bào hợp tử ban đầu Tế bào phân chia thành khối tế bào chưa chuyên hóa biến đổi thành tế bào chuyên hóa đặc trưng cho mô quan với chức khác Đây tượng phân hóa tế bào Tuy nhiên, tế bào chun hóa khơng hồn tồn biến đổi Trong điều kiện thích hợp, tế bào chun hóa trở thành tế bào chưa chuyên hóa Đây hiên tượng phản phân hóa tế bào (Trịnh Đình Đạt, 2009) Để tạo rễ, khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp cần đặt vào mơi trường có bổ sung IAA với nồng độ khác Theo Mai Trần Ngọc Tiếng cộng (1980), rễ gồm hai giai đoạn: thành lập sơ khởi rễ kéo dài Gần hơn, số tác giả cho tạo rễ khởi phát phân chia tế bào nhu mô (Nag cs, 2001) Ở giai đoạn hoạt hóa mơ, tế bào trải qua biến đổi nhằm tái lập lại trạng thái có tính chất giống tế bào mô phân sinh cấp một: tế bào chất đậm đặc, nhân tiểu hạch lớn Các khúc cắt trụ hạ diệp tất nghiệm thức thí nghiệm có sơ khởi rễ xuất sau 48 ni cấy, ngoại trừ khúc cắt vị trí thứ mơi trường MS MS có bổ sung IAA 0,1mg/l Có lẽ vị trí xa cỗ rễ hơn, hàm lượng auxin nội sinh khơng đủ ngưỡng kích thích tạo sơ khởi rễ sớm Như vậy, khả hình thành sơ khởi rễ trụ hạ diệp phụ thuộc vào vị trí khúc cắt Một hiệu ứng rõ nét auxin phân hóa tế bào chứng thực từ năm 1934 (Went, Skoog, Thimann), khả phát sinh rễ (Nguyễn Như Khanh, 2007) Trong phát sinh rễ in vitro, auxin xem có vai trò quan trọng tạo rễ (Ahloowalia, 1991; Comanin cộng sự, 1992; Zimmerman, 1993) Trong nuôi cấy, auxin thường tạo bướu mơ quan, kích thích phân chia tế bào, kích thích tạo rễ bất định ( Pierik, 1987) So với trụ hạ diệp, khúc cắt trụ thượng diệp khó hình thành sơ khởi rễ Sau ngày, mẫu cấy nghiệm thức có bổ sung IAA 5mg/l cho sơ khởi rễ Đến ngày thứ 3, sơ khởi rễ tìm thấy khúc cắt mơi trường có nồng độ IAA 1mg/l Kết phù hợp với lí thuyết, auxin nồng độ cao kích thích tạo sơ khởi rễ ( phát thể non rễ ) Vậy IAA chất điều hòa tăng trưởng thực vật có khả kích thích trụ thượng diệp hình thành rễ, nồng độ cao 5mg/l, IAA giúp tạo rễ sớm Ở song tử diệp, auxin gây tình trạng rối loạn tổ chức sinh mơ rễ, kích thích hoạt động chu luân nội bì tạo vùng tế bào phân sinh xuất nhiều mô phân sinh rễ (Bùi Trang Việt, 2000) Rễ từ khúc cắt trụ hạ diệp thựợng diệp đậu Vigna angularis phát sinh rễ từ mô nội sinh Sau ngày nuôi cấy, phần khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp nằm mặt thạch xuất nhiều rễ có kích thước lớn Đối với trụ hạ diệp, rễ hình thành mơi trường đối chứng Điều giải thích, auxin tổng hợp thân, non sau di chuyển tới rễ tích tụ rễ (Bùi Trang Việt, 2000) để kích thích rễ Vì thế, số ba vị trí khúc cắt, vị trí thứ có chiều dài rễ số rễ cao vị trí thứ Khúc cắt trụ thượng diệp Vigna angularis không tạo rễ môi trường đối chứng Rễ bất định hình thành mơi trường có bổ sung IAA IAA môi trường nuôi cấy cảm ứng sản sinh IAA nội sinh kích thích tạo rễ Ngồi ra, có mặt IAA ngoại sinh hoạt hóa bơm proton H+ màng nguyên sinh chất hoạt động, acid hóa vách tế bào, làm vách tế bào trở P P nên lỏng lẻo, kích thích q trình phân chia hấp thu nước từ mơi trường giúp cho tăng trưởng tế bào (Bùi Trang Việt 2000) Mặc dù số lượng rễ trung bình tạo từ khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp xử lý IAA 0,1 mg/l so với xử lý IAA mg/l, chiều dài rễ trung bình mẫu cấy lớn Điều cho thấy hàm lượng IAA thấp (0,1 mg/l) kích thích kéo dài rễ, hàm lượng IAA cao (1 mg/l) ức chế kéo dài rễ Đối với nuôi cấy trụ thượng diệp, IAA 5mg/l làm tăng mạnh số lượng rễ trung bình mẫu cấy vị trí 1, khúc cắt gần nên có hàm lượng auxin lớn hai vị trí cịn lại Khi di chuyển từ đỉnh xuống quan, auxin bị phân hủy enzym auxin- oxydase, nên nồng độ auxin giảm dần nơi xa với nơi tổng hợp (Dương Công Kiên, 2003) Sự phát triển rễ từ khúc cắt trụ thượng diệp vị trí theo thời gian ảnh hưởng auxin 5mg/l Số lượng trung bình rễ ngày 7, 14 sau cấy không sai khác mặt thống kê, có khác biệt với ngày thứ Kết cho phép kết luận, sau cấy ngày rễ tiếp tục phát sinh ngày Ngược lại, chiều dài rễ tăng tuần Có lẽ hàm lượng auxin ngoại sinh giảm dần theo thời gian khảo sát nhu cầu phát sinh quan kích thích rễ kéo dài Khảo sát di chuyển hữu cực auxin Sự di chuyển auxin có vai trị đặc biệt tăng trưởng phân hóa Auxin di chuyển chủ yếu libe, theo cách thụ động, khơng có tính hữu cực Tuy nhiên, tế bào sống có khả vận chuyển auxin, di chuyển hữu cực (Bùi Trang Việt, 2000) Để chứng minh di chuyển hữu cực auxin, khúc cắt trụ thượng diệp nuôi cấy môi trường MS MS có bổ sung IAA 1mg/l Khi đặt cực gốc mẫu cấy quay lên trên, cực cắm vào thạch môi trường Sau tuần, khúc cắt trụ thượng diệp không mọc rễ môi trường MS, ngược lại, mẫu cấy mơi trường có bổ sung IAA 1mg/l cho phép hình thành rễ Rễ bất định không xuất môi trường thạch mà mọc cực gốc Kết thí nghiệm cho thấy, auxin ngoại sinh di chuyển hữu cực từ đến gốc tín hiệu hóa học để kích thích mọc rễ Sự di chuyển hữu cực giải thích theo mơ hình hóa thẩm thấu (Goldsmith, 1977 ) sau: Trong môi trường vách tế bào, pH ≤ 5, auxin dạng AIAH ( thích lipit ) xuyên qua lớp kép lipit vào cytosol Tại đây, pH= 7, auxin trở thành dạng AIA- ( thích nước ) tích tụ cytosol P P Trong màng nguyên sinh chất tế bào, chất vận chuyển AIA- mặt gốc nhiều mặt P P nên đưa AIA- qua màng vào vách tế bào Và thế, trình lặp lại, từ tế bào qua tế P P bào khác để đưa auxin gốc ( Bùi Trang Việt, 2000 ) Khảo sát ảnh hưởng auxin lên chiều cao diện tích IAA nồng độ 0,1; 5mg/l tác động rõ rệt lên hình thành rễ bất định khúc cắt trụ hạ diệp trụ thượng diệp, khơng có hiệu ứng hạt nên chiều cao diện tích nghiệm thức khơng có khác biệt Như vậy, nồng độ, auxin thể hiệu ứng khác tùy vào mơ đích Sự thay đổi cường độ hơ hấp hoạt tính chất điều hòa tăng trưởng thực vật phát triển rễ bất định Khúc cắt trụ thượng diệp đậu Vigna angularis nuôi cấy môi trường MS với IAA 5mg/l có cường độ hơ hấp gia tăng theo thời gian, cần nhiều lượng cho hoạt động trình tạo rễ bất định Mẫu cấy có cường độ hơ hấp tăng lên vào ngày thứ ứng với giai đoạn hình thành sơ khởi rễ Sau đó, tiếp tục tăng cao ngày thứ tương ứng với giai đoạn kéo dài rễ Như vậy, cường độ hô hấp đạt giá trị cao vào giai đoạn kéo dài rễ, cao giai đoạn tạo sơ khởi rễ ngày cần nhiều lượng cho hoạt động kéo dài tạo rễ Hàm lượng chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh biến đổi theo thời gian tương ứng với giai đoạn hình thành phát triển rễ bất định Hoạt tính IAA tăng lên rõ rệt so với ngày 0, vào giai đoạn tạo sơ khởi rễ ngày thứ Giai đoạn đầu tạo rễ cần có hàm lượng auxin cao để khởi xướng phân hóa tế bào mạnh mẽ (Võ Thị Bạch Mai 2004) Hoạt tính IAA tiếp tục tăng ngày thứ 5, tương ứng với giai đoạn rễ kéo, từ 391,3 ng/g lên đến 416,3 ng/g Do IAA nồng độ cao ức chế kéo dài rễ CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận - Rễ bất định từ thân Vigna angularis có nguồn gốc nội sinh, phát triễn rễ gồm ba giai đoạn: giai đoạn tế bào vùng nhu mơ phân chia mạnh, giai đoạn hình thành sơ khởi rễ, giai đoạn sơ khởi rễ kéo dài lú khỏi vỏ - Trụ hạ diệp dễ hình thành rễ bất định trụ thượng diệp, IAA có khả kích thích tạo rễ bất định từ trụ thượng diệp đậu Vigna angularis - Cường độ hô hấp hàm lượng IAA nội sinh thay đổi theo giai đoạn phát triển rễ - Đối với trụ thượng diệp, IAA mg/l cần cho tạo rễ ức chế kéo dài rễ (tác động auxin thay đổi theo bước phát sinh hình thái) - Dưới tác dụng IAA ngoại sinh, vị trí thứ trụ thượng diệp cho rễ nhiều vị trí bên (tác động auxin thay đổi theo vị trí mơ thân) - Auxin di chuyển hữu cực rễ mọc cực gốc trụ thượng diệp Đề nghị Trong tương lai, có điều kiện, chúng tơi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng auxin chất điều hòa tăng trưởng thực vật khác phát triển rễ nói riêng phát triển nói chung, bao gồm tăng trưởng, hoa đậu trái, đậu Vigna angularis TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trịnh Đình Đạt (2009) Công nghệ di truyền NXB giáo dục Nguyễn Đình Giậu (2000) Sinh học đại cương NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM Phạm Hoàng Hộ (1999) Cây cỏ Việt Nam, NXB trẻ Dương Công Kiên (2002) Nuôi cấy mô thực vật NXB giáo dục Nguyễn Như Khanh (2007) Sinh học phát triển thực vật NXB giáo dục Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002) Công nghệ tế bào NXB Đại học quốc gia Tp.HCM Võ Thị Bạch Mai (2004) Sự phát triển chồi rễ NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM Mai Trần Ngọc Tiếng (2001) Thực vật cấp cao NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM Bùi Trang Việt (1998) Sinh lí thực vật đại cương Phần III – Phát triển NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 10 Bùi Trang Việt (2000) Sinh lí thực vật đại cương Phần II – Phát triển NXB Đại học Quốc gia Tp.HCM 11 Bùi Trang Việt (2003) Sinh phôi thể hệ thực vật Giáo trình cao học sinh lí thực vật 12 Vũ Văn Vụ (1999) Sinh lí thực vật ứng dụng NXB giáo dục 13 Vũ Văn Vụ (chủ biên), Vũ Thành Tâm Hoàng Minh Tấn (2008) Sinh lí học thực vật NXB giáo dục TÀI LIỆU TIẾNG ANH 14 Berleth T and Sachs T., 2001 “Plant morphogenesis: long-distance coordination and local patterning”, Plant Biology, 57 - 62 15 Blythe E.K., Sibley J.L., Tilt K.M., and Ruter J.M (2007) Methods of auxin application in cutting propagation: A review of 70 years of scientific discovery and commercial practice, 25, 166 – 185 16 Brink M., Belay G., 2006 Cereals and pulse, Backhuys, p.204-206 17 Chen C.M., Jin G., Anderson B.R., and Etral J., 1993 “ Modulation of plant gene expression by cytokinin”, Plant physiol., 20, 609 - 619 18 Crowell D.N and Amasino R M., 1994 “ Cytokinin and plant gene regulation”, In: Mok D.W.S, Mok M.C., ed, Cytokinin: Chemistry, Activity and Function, CRC Press, Boca Raton, FL, 233 – 242 19 Gutierrez L., Bussell J.D., Păcurar D.I., Schwambach J., Păcurar M., and Bellini C., 2009 Phenotypic plasticity Of adventisous rooting in Arabidopsis controlled by complex regulation of auxin response factor transcript and micro RNA abundance The Plant Cell, 21, 3119 – 3132 20 Humphries E C., 1960 Inhibition of root development on petioles and hypocotyl of dwarf bean (phaseolus vulgaris) by citokinin Phyciol Plantarum, 13, 659-663 21 Hu S., 2005 Food plants of China, The Chinese University Press, 344-346 22 Khalafalla M., El-Shemy H., Mizanur R., Teraishi M., Teraishi M., and Ishimoto M., 2004 Recovery of herbicide-resistant Azuki bean [Vigna angularis (Wild.), Ohwi & Ohashi] plants via Agrobacterium- mediated transformation, (1), 61-67 23 Lund S.T., Smith A.G., Hackeet W.P., 2008 Cuttings of tobacco mutant, rae, undergo cell but not initiate adventitious root in respone exogenous auxin Physiologia Plantarum, 97, 372 380 24 Mironova V.V , Omelyanchuk N.A., Yosiphon G., Fedeev S.I., Kolchanov N A., Mjolsness E., and Likhoshvai V.A., 2010 A plausible mechanism for auxinpatterning along the developing root BMC Systems Biology, 4, 34-36 25 Ohashi H and Tahashahi H., 1981 Pollen Morphology of Vigna angularis, 94, 177 – 184 26 Overvoorde P., Fukaki H., and Beeckman T., 2010 Auxin control of root development Cold Spring Harbor Laboratory Press, 20, 541-553 27 Phillips G.C, 2008 In vitro morphogenesis in plant- recent advances In vitro cellular and developmental biology – plant, 40, 342-345 28 Pop T.I., Pameil D., and Bell C., 2011 Auxin Control in the Formation of Adventitious Roots, Not 0T T T 0T Bot Hor Agrobot Cluj, 39, 307-316 29 Sachs T 1993 The role of auxin in the polar organization of apical meristems Aust J Plant Physiol, 20, 541-553 30 Sato S., Yuuka M., and Yamate J 2009 Beneficial Effects of Azuki Bean (Vigna angularis) Extract: Anti-Oxidant, Anti-Hypertension and Treatment for Renal Damage 5, 217-222 31 Singh R and Jauhar P 2005 Genetic Resources, Chromosome Engineering, and Crop Improvement, Taylor and Francis, 238-241 32 Sorin C., Bussell J.D., Camus I., Liung K., Kowalczyk M., Geiss G., McKhann H., Garcion C.,Vaucheret H., Sandberg G., and Bellini C., 2005 Auxin and light control of adventitious rooting in Arabidopsis require argonaute The Plant Cell, 17, 1343-1359 33 Yousif A., Deeth H., and Caffin N., 2002 Effect of storage time and condition on the hardness and cooking quality of adzuki (Vigna angularis), LWT- Food Sciene and Technology, 35, 388 – 353 TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 34 http://www.ingentaconnect.com/content/ben/cnf/2009/00000005/00000003/art 4T T 35 http://www.mendeley.com/research/structure-of-novel-glyceroglycolipids-in-adzuki-bean4T vigna-angularis-seeds/ 4T 36 http://www.highbeam.com/doc/1G1-194811474.html 4T 37 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19157815 4T T T 38 http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2621.2009.02117.x/abstract 4T 39 http://cat.inist.fr/?aModele=afficheN&cpsidt=16743415 4T T T 40.http://resources.metapress.com/pdfpreview.axd?code=g6uu5u082144wk50&size PHỤ LỤC PHỤ LỤC THÀNH PHẦN MƠI TRƯỜNG MURASHIGE & SKOOG (1962) Khống đa lượng Nồng độ (mg/l) NH NO 1650 KNO 1900 R R R R CaCl2 2H O 440 MgSO 7H O 370 KH PO 170 R R R R R R R R R R R 170 NaH PO R R R Khoáng vi lượng H BO R R Nồng độ (mg/l) 6,2 R MnSO 2H O 22,3 ZnSO 4H O 8,6 KI 0,83 R R R R R R R R Na MoO 2H O 0,25 CuSO 5H O 0,025 CoCl2 6H O 0,025 R R R R R R R R R R R R R R Dung dịch Fe-EDTA Nồng độ (mg/l) FeSO 7H O 27,8 Na EDTA 37,3 R R R R R R Vitamin MS Glycine Nồng độ (mg/l) Myo-inositol 100 Thiamin 0,1 pH 5,7 ± 0,1 ... TP HỒ CHÍ MINH Nguyễn Hồ Dịu Thắm VAI TRỊ CỦA AUXIN TRONG SỰ PHÁT SINH HÌNH THÁI RỄ BẤT ĐỊNH IN VITRO TỪ KHÚC CẮT THÂN CÂY ĐẬU VIGNA ANGULARIS ( WILLD. ) OHWI ET OHASHI Chuyên ngành : Sinh học thực... cắt hình thành rễ bất định bước đột phá lớn cho nhân giống thực vật ( Environ, 2007 ) Đề tài ? ?Vai trò auxin phát phát sinh hình thái rễ bất định in vitro từ khúc cắt thân đậu Vigna angularis (Willd. )... áp dụng hormon thực vật ngoại sinh cách hữu hiệu phát sinh hình thái ( Bùi Trang Việt, 2000 ) 1 Sự phát sinh rễ Rễ mầm phát triển từ sinh mơ chóp (tiền sinh mơ) Sinh mơ có hoạt tính đặc biệt