TRƢỜNG ĐẠI HỌC LÂM NGHIỆP VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÂM NGHIỆP - - KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: “TÁCH DỊNG ĐOẠN GEN MÃ HĨA KHÁNG NGUYÊN HEMAGGLUTININ CỦA CHỦNG VI-RÚT CÚM A/H5N1 TẠO NGUỒN NGUYÊN LIỆU SẢN XUẤT VẮC-XIN CÚM GIA CẦM” NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH: D420201 Giảng viên hƣớng dẫn : TS Nguyễn Trung Nam Th.S Nguyễn Hùng Chí Sinh viên thực : Đỗ Thị Tƣơi Mã sinh viên : 1453070008 Khóa học : 2014 - 2018 HÀ NỘI, 2018 LỜI CẢM ƠN Để có đƣợc điều kiện thực hồn thành tốt Khóa Luận Tốt Nghiệp trƣớc hết em xin gửi đến thầy TS Nguyễn Trung Nam - Trƣởng phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng, Viện Cơng nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam; Th.S Nguyễn Hùng Chí – phịng Cơng nghệ ADN ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam lời cảm ơn chân thành lịng biết ơn sâu sắc tận tình hƣớng dẫn giúp đỡ em suốt q trình hồn thiện đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến anh chị phịng cơng nghệ ADN ứng dụng, với ban lãnh đạo viện Công nghệ Sinh học, viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo môi trƣờng trƣờng nghiên cứu học tập tốt cho sinh viên chúng em Em xin gửi đến quý thầy, cô giáo Viện Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Lâm Nghiệp lời cảm ơn chân thành Đặc biệt, em xin gởi đến cô Th.S Nguyễn Thị Thu Hằng – trƣởng môn Vi Sinh - Hóa sinh ngƣời nhiệt tình giúp đỡ giải đáp khúc mắc khó khăn cho em trình thực đề tài Em xin gửi lời cảm ơn đến Ban lãnh đạo Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp tạo tạo điều kiện cho em hoàn thành trình học tập rèn luyện sau năm học Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ngƣời thân gia đình bạn bè, ngƣời bên em, chăm sóc, động viên em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Trong q trình thực đề tài em không ngừng cố gắng phấn đấu nỗ lực Nhƣng kiến thức thân cịn hạn chế, q trình học tập, hồn thiện đề tài khó tránh khỏi sai sót, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp từ thầy để khóa luận em đƣợc hồn thành tốt Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 09 tháng 02 năm 2018 Sinh viên thực Tƣơi Đỗ Thị Tƣơi MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Cúm A/H5N1 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Thực trạng dịch bệnh cúm A/H5N1 1.2 Vi-rút cúm A/H5N1 1.2.1 Nguồn gốc phát sinh 1.2.2 Đặc điểm hình thái, cấu trúc gen vi-rút cúm 1.2.4 Cấu trúc, đặc tính vai trò gen HA-H5 xâm nhiễm tái vi-rút cúm A/H5N1 10 1.3 Tách dòng gen kỹ thuật di truyền ngƣợc sản xuất vắc-xin 13 1.4 Tình hình nghiên cứu sử dụng vắc-xin cúm gia cầm Việt Nam 14 1.5 Ứng dụng công nghệ gen nghiên cứu tách dòng gen vi-rút cúm A/H5N1 15 1.5.1 Tin sinh phân tích di truyền 15 1.5.2 Vector sử dụng kỹ thuật di truyền 17 1.5.3 Một số phƣơng pháp giải trình tự gen 18 CHƢƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Mục tiêu 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 20 2.3 Đối tƣợng vật liệu nghiên cứu 20 2.4 Địa điểm thời gian nghiên cứu 21 2.5 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.5.1 Phƣơng pháp thiết kế sinh tổng hợp gen HA-H5 vi-rút cúm A/H5N1 23 2.5.2 Phƣơng pháp tách dòng đoạn gen HA loại bỏ đoạn độc vào vector pHW2000 24 2.5.3 Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào Escherichia coli 25 2.5.4 Phƣơng pháp chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc 26 2.5.5 Phƣơng pháp tách chiết tinh ADN tái tổ hợp 27 2.5.6 Phƣơng pháp kiểm tra kết tách dòng gen HA-H5 phản ứng cắt với enzyme giới hạn 27 2.5.7 Phƣơng pháp giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 29 3.1 Kết sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gen HA-H5 không chứa đoạn độc vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 C 29 3.2 Kết tách dòng đoạn gen HA-H5 không chứa đoạn độc chủng vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 31 3.2.1 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α 31 3.2.2 Kết kiểm tra có mặt gen HA-H5 phản ứng PCR với mồi đặc hiệu 32 3.2.3 Kết kiểm tra có mặt gen HA-H5 phản ứng cắt với enzyme giới hạn 33 3.4 Kết giải trình tự đoạn gen HA-H5 vector tách dòng 34 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36 4.1 Kết luận 36 4.2 Kiến nghị 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 Tài liệu tham khảo Tiếng Việt 37 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bản đồ bùng phát dịch cúm H5N1 gia cầm giai đoạn 2004-2013 Hình 1.2: Hình thái vi-rút cúm A/H5N1 dƣới kính hiển vi (A); mơ hình (B) Hình 1.3: Các phân đoạn gen protein vi-rút cúm A Hình 1.4: Cơ chế xâm nhiễm, tổng hợp, nhân lên vi-rút cúm Hình 1.5: Cấu trúc hemagglutinin glycoprotein vi-rút cúm 11 Hình 1.6: Sự tách dòng biểu vector 17 Hình 1.7: Vector pHW2000 18 Hình 2.1: Trình tự nucleotide amino acid gen HA clade 2.3.2.1C trƣớc sau xử lý loại vùng độc tránh lại độc 23 Hình 3.1: Trình tự nucleotide (a) amino acid (b) gen HA clade 1.1 clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc 30 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp nuôi cấy môi trƣờng LB 31 Hình 3.3: Kết tách dịng kiểm tra có mặt gen đích vector pHW2000 PCR 32 Hình 3.4 Kết kiểm tra cắt với cặp enzyme NheI SmaI 33 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.2: Bảng thống kê thiệt hại ngƣời bệnh cúm A/H5N1 gây nƣớc giới Bảng 2.1 Trình tự mồi đặc hiệu gen HA trình tự mồi đặc hiệu vector pHW2000 24 Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR với mồi đặc hiệu gen HA-H5 24 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR với mồi đặc hiệu vector pHW2000 25 Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt với enzyme giới hạn 28 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic ARN : Acid Ribonucleic cDNA : Complementary DNA Bp : Base pair Cs : Cộng E coli : Escherichia coli Gen HA : Hemagglutinin gene Gen M : Matrix gene Gen NA : Neuraminidase gene Gen NP : Nucleoprotein gene Gen NS : Non-structural gene Gen PA : Polymerase A gene Gen PB1 : Polymerase B1 gene Gen PB2 : Polymerase B2 gene IPTG : Isopropyl – β- D Thiogalactoside Kb : Kilo base LB : Luria Bertami mM : Minimol mRNA : Messenger RNA (RNA thơng tin) ng/ µl : Nanogram/ Microlit PCR : Polymerase Chain Reaction Pfu : Pyrococus furiosis Protein HA : Hemagglutinin Protein M : Matrix protein Protein NA : Neuraminidase Protein NP : Nucleocapsid protein Protein NS : Non- structural protein Protein PA : Polymerase A protein Protein PB1 : Polymerase B1 protein Protein PB2 : Polymerase B2 protein RE : Restriction endonuclease (Enzyme cắt giới hạn) RNP : Ribonucleoprotein ssRNA : Negative single trand RNA (RNA sợi đơn âm) Taq : Thermus Aquaticus WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) µg/l : Microgram/lit µl : Microlit ĐẶT VẤN ĐỀ Vi-rút cúm A/H5N1 chủng vi-rút động lực cao, thƣờng gây chết gia cầm với tỷ lệ lớn Từ xuất Việt Nam có 59.829 dịch cúm gây gia cầm 127 ca bệnh ngƣời làm 64 ngƣời tử vong Dịch cúm gia cầm gây thiệt hại khơng ngƣời, kinh tế xã hội Tuy từ năm 2015 trở lại cúm A/H5N1 không xuất Việt Nam, nhƣng lại lƣu hành rộng rãi Châu Á Cho tới vi-rút cúm A/H5N1 khơng ngừng tiến hóa, mà mang tính đe dọa lớn đến nơng nghiệp Việt Nam tính mạng ngƣời Điều trị ca nhiễm cúm A/H5N1 ngƣời biện pháp thụ động thực chất không đem lại hiệu việc tiêm vắc-xin phòng bệnh Vắc-xin sử dụng phòng chống cúm A/H5N1 đƣợc sản xuất phƣơng pháp truyền thống có tác dụng yếu chủng vi-rút động lực cao Thêm vào số loại vắc-xin cúm chƣa đƣợc bảo hộ nên khả gây độc thể khó kiểm sốt, thƣờng mang tính chất gây bệnh cao Mặt khác, vi-rút cúm A/H5N1 có mức độ hoạt động lây nhiễm lớn nhất, khả tiến hóa nhanh, tạo nhiều biến chủng mới, nên việc nghiên cứu sản xuất vắc-xin có hiệu phịng vệ cao với chủng vi-rút lƣu hành đáng quan tâm Hiện nay, với phát triển công nghệ ADN ứng dụng, vắc-xin hệ đƣợc tạo kỹ thuật di truyền ngƣợc mang tính an tồn hiệu cao Theo quy trình chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới (World Health OrganizationWHO) sản xuất vắc-xin dựa kỹ thuật di truyền ngƣợc với tính chất kháng ngun đặc trƣng vi-rút cúm việc thiết kế, tách dịng thành cơng gen mã hóa cho kháng nguyên bề mặt chủng vi-rút cúm A/H5N1 thuộc clade 2.3.2.1C lƣu hành phía Bắc Việt Nam cần thiết Dựa vấn đề đặt ra, đề tài: “Tách dịng đoạn gen mã hóa kháng nguyên hemagglutinin chủng vi-rút cúm A/H5N1 tạo nguồn nguyên liệu sản xuất vắc-xin cúm gia cầm” đƣợc đƣa để đáp ứng nhu cầu sử dụng vắc-xin nhƣ có tính bảo hộ cao với chủng vi-rút lƣu hành Việt Nam Khóa luận đƣợc thực Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, hồn thành phần từ nguồn kinh phí từ đề tài: “Nghiên cứu tạo giống gốc để sản xuất vắc-xin cúm A/H5N1” Mã số: SPQG.05b.03 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1 Cúm A/H5N1 1.1.1 Giới thiệu chung Bệnh cúm gia cầm (avian influenza) bệnh truyền nhiễm đƣợc gây vi-rút có gen ARN, thuộc họ Othomyxoviridae, Mononegavirales hệ thống phân loại chung (Basic Taxomomy) (Murphy, Webster, 1996) Họ vi-rút tác nhân chủ yếu gây bệnh đƣờng hô hấp ngƣời, động vật, gia cầm chim Bệnh lúc đầu có tên dịch tả gà (Fowl plague) (Stubb, 1965) Từ Hội nghị Quốc tế lần thứ bệnh cúm gia cầm Beltsville, Mỹ năm 1981 tên bệnh đƣợc gọi bệnh cúm truyền nhiễm cao gia cầm (Highly Pathogenic Avian Influenza viết tắt HPAI: vi-rút cúm type A có độc lực cao) (Beard C.W., 1998) Bệnh cúm A/H5N1 xuất từ nhiều năm trƣớc Ngay từ tái xuất ngỗng vùng Quảng Đông, Trung Quốc năm 1996 lan 60 nƣớc giới Châu Á, Châu Âu, Châu Phi đặc biệt phổ biến khu vực Đông Nam Á (Hình 1.1) Hình 1.1: Bản đồ bùng phát dịch cúm H5N1 gia cầm giai đoạn 2004-2013 *Chú thích: Vùng màu đen biểu thị quốc gia đưa báo cáo có tới 97% tất ca bệnh nhiễm virút cúm A/H5N1 người 90% số dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng nổ Bangladesh, Campuchia, Trung Quốc, Ai Cập, Thái Lan, Thổ Nhĩ Kỳ Việt Nam 1.1.2 Thực trạng dịch bệnh cúm A/H5N1 Từ năm 2003 trở lại đây, dịch cúm gia cầm Việt Nam có diễn biến ngày phức tạp nguồn tàng trữ lây lan bệnh chim di cƣ, vịt, gà khó kiểm sốt khống chế Đáng lƣu ý dịch cúm A/H5N1 thƣờng xuyên bùng phát hàng năm nƣớc ta Mặc dù khơng có thay đổi cấu trúc, nhƣng xét độc lực, vật chủ nhiễm bệnh, mức độ lây truyền có nhiều nét đặc trƣng khác nhiều so với biến chủng vi-rút cúm A/H5N1 đƣợc phát trƣớc Theo thống kê tổ chức Y tế giới (World Health Organization- WHO) từ năm 2003 đến năm 2017 có 860 trƣờng hợp mắc bệnh cúm gia cầm ngƣời 16 quốc gia, có tổng số 454 trƣờng hợp tử vong, chiếm 52,7% (Bảng 1.2) Trong tổng số ca nhiễm chết dịch cúm A/H5N1 tiếp xúc với gia cầm thấy Ai cập, Indonesia Việt Nam nƣớc có thiệt hại nặng nề Bảng 1.2: Bảng thống kê thiệt hại người bệnh cúm A/H5N1 gây nước giới 2003-2009* 2010-2014** 2015 2016 2017 Tổng Quốc Gia Nhiễm Chết Nhiễm Chết Nhiễm Chết Nhiễm Chết Nhiễm Chết Nhiễm Chết Azerbaijan 0 0 0 0 Bangladesh 1 0 0 Cambodia 47 30 0 0 0 56 37 Canada 0 1 0 0 0 1 38 25 0 0 53 31 Djibouti 0 0 0 0 Ai Cập 90 27 120 50 136 39 10 3 359 120 162 134 35 31 2 0 1 200 168 Iraq 0 0 0 0 Lào 2 0 0 0 0 2 Myanmar 0 0 0 0 Nigeria 1 0 0 0 0 1 Pakistan 0 0 0 0 Thái Lan 25 17 0 0 0 0 25 17 Turkey 12 0 0 0 0 12 Việt Nam 112 57 15 0 0 0 127 64 Tổng 468 282 233 125 145 42 10 860 454 Trung Quốc Indonesia Bảng 2.3: Thành phần phản ứng PCR với mồi đặc hiệu vector pHW2000 STT Thành phần Thể tích (µl) 2x Master mix 10 pHW2000F pHW2000R Template ADN Nƣớc Deion Tổng thể tích 20 Phản ứng PCR với chu trình nhiệt: Tm 94oC o 94 C 58oC 72oC 72oC 30 giây phút 30 giây 10 phút 30 giây phút (30 chu kỳ) 4oC ∞ 2.5.3 Phƣơng pháp biến nạp ADN plasmid vào tế bào Escherichia coli Biến nạp trình đƣa ADN tinh vào tế bào vi khuẩn Quá trình biến nạp ADN plasmid vào tế bào E.coli chủng DH5α gồm hai giai đoạn: Tạo tế bào khả biến biến nạp  Tạo tế bào khả biến: - Tế bào E.coli đƣợc nuôi qua đêm 5ml môi trƣờng LB lỏng; - Pha loãng huyền dịch tế bào nuôi cấy theo tỉ lệ 1:100 5ml môi trƣờng LB; - Ni lắc 37oC, 200 vịng/phút (v/p), sau kiểm tra mật độ tế bào, giá trị OD600nm khoảng 0,6-1 đạt yêu cầu; - Chuyển 1ml dịch tế bào sang ống eppendorf vô trùng, để đá 10 phút; - Ly tâm thu sinh khối 4oC, tốc độ 5.000 v/p 10 phút; 25 - Rửa cặn tế bào 1ml CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:10) 4oC; - Rửa lại CaCl2 100mM (tỷ lệ 1:20) 4°C 30 phút; ly tâm thu cặn; - Hòa cặn tế bào thành huyền dịch 50 µl CaCl2 100mM, giữ đá trƣớc biến nạp  Biến nạp: - Bổ sung µl vector tái tổ hợp vào ống chứa tế bào khả biến, cắm đá phút; - Sốc nhiệt 42oC 90 giây, cắm lên đá để phút; - Bổ sung 200 µl môi trƣờng LB lỏng, lắc tốc độ 200v/p, 37oC, giờ; 2.5.4 Phƣơng pháp chọn lọc, nuôi cấy khuẩn lạc Nguyên tắc: Chỉ vi khuẩn mang vector pW2000 có chứa gen chọn lọc sống đƣợc mơi trƣờng có bổ sung chất chọn lọc Các tế bào vi khuẩn E.coli đƣợc biến nạp đƣợc ni cấy mơi trƣờng có bổ sung kháng sinh Amp X-gal Các bƣớc nuôi cấy, chọn lọc: - Chuẩn bị mơi trƣờng B đặc có bổ sung kháng sinh Amp (100µg/ml) Xgal (40µg/ml); - Cấy trải dịch tế bào sau nuôi lắc sang đĩa thạch LB - Nuôi cấy khuẩn lạc 37oC qua đêm Phƣơng pháp chọn lọc: - Dựa vào khả sống sót mơi trƣờng có bổ sung kháng sinh: chọn khuẩn lạc sống (đây khuẩn lạc đƣợc biến nạp thành cơng plasmid có chứa gen kháng kháng sinh, nên sống mơi trƣờng có chất kháng sinh đó); - Dựa vào màu sắc khuẩn lạc: chọn khuẩn lạc màu trắng, loại bỏ khuẩn lạc màu xanh (Do khuẩn lạc mang vector chứa gen HA đƣợc chèn vào vị trí gen lacZ bị cắt bỏ) 26 2.5.5 Phƣơng pháp tách chiết tinh ADN tái tổ hợp Quá trình tách chiết tinh ADN tái tổ hợp đƣợc tiến hành theo bƣớc sau: - Lựa chọn khuẩn lạc màu trắng tiến hành nuôi cấy lọ penicillin chứa 2ml mơi trƣờng LB lỏng có chứa Amp (nồng độ 100µg/ml) Ni lắc qua đêm 37oC, 200v/p; - Lấy 1,5ml dịch nuôi vào ống Eppendorf; - Ly tâm 12000v/p, phút loại dịch, thu tế bào; - Bổ sung 150µl Sol I (Tris - HCl 50mM, pH 8,0 + EDTA 10mM, pH 8,0), trộn máy vortex; - Bổ sung 150µl Sol II (200mM NaOH + SDS 1%), đảo nh ; - Bổ sung 150µl Sol III (Kac - Potasium Acetat 3M, pH 5,5), đảo nh ; - Bổ sung 450µl chloroform: isoamylalcohol (24:1), đảo nh ; - Ly tâm 12000v/p, 20 phút; - Hút dịch chuyển sang Eppendorf mới, bổ sung 40µl NaOAc 3M, pH 5,2 1000µl ethanol 100% Để ADN tủa -20oC giờ; - Ly tâm 12000v/p, 30 phút, loại dịch thu cặn; - Rửa cặn 500µl ethanol 70%; - Ly tâm 12000v/p, 15 phút; - Làm khơ ADN; - Hịa cặn ADN 40 µl TE - RNAase (100µg/ml); - Ủ bể ổn nhiệt 37oC 1h loại ARN; - Điện di kiểm tra gel agarose 1%; 2.5.6 Phƣơng pháp kiểm tra kết tách dòng gen HA-H5 phản ứng cắt với enzyme giới hạn Enzyme giới hạn thuộc nhóm enzyme endonuclease có khả nhận biết trình tự nucleotide đặc hiệu phân tử ADN khoảng (4 - nu), cắt đặc hiệu phân tử ADN vị trí định tạo thành đoạn ngắn 27 Phản ứng cắt vector tái tổ hợp có chứa đoạn gen HA enzyme giới hạn NheI SmaI Enzyme NheI SmaI đƣợc sử dụng có khả cắt ADN vị trí hai đầu đoạn gen lacZ ( vùng đƣợc cắt bỏ phần trình tự nucleotid để cài đoạn gen HA-H5 clade 2.3.2.1C vào giữa) Hỗn hợp phản ứng bao gồm: Bảng 2.4: Thành phần phản ứng cắt với enzyme giới hạn Thành phần Thể tích (µl) Nƣớc deion Buffer 5x Nhe I (1U/µl) Smal I (1U/µl) Vector Tổng thể tích 10 Hỗn hợp phản ứng đƣợc trộn đều, ủ nhiệt độ 37oC Sản phẩm phản ứng cắt đƣợc kiểm tra điện di gel agarose 1% 2.5.7 Phƣơng pháp giải trình tự gen máy giải trình tự gen tự động Qui trình xác định trình tự gen máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100- Avant™ Genetic Analyzer (Applied Biosystems), sử dụng kit BigDye® Terminater v3.1 Cycle Sequencing Kit hãng Applied Biosystems 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết sử dụng phần mềm tin sinh học thiết kế gen HA-H5 không chứa đoạn độc vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1 C Kết thiết kế gen HA clade 2.3.2.1C để tổng hợp nhân tạo đƣợc so sánh với trình tự gen HA clade 1.1 (vi-rút A/duck/Vietnam/ST0970/2009(H5N1) hình 3.1 Gen HA clade 2.3.2.1C có kích thƣớc 1822 bp có đặc điểm: đoạn nucleotide đầu khơng mã hóa, vị trí gắn mồi đặc hiệu chứa điểm nhận biết enzyme BsmBI; vùng mã hóa amino acid tạo protein HA: clade 2.3.2.1C - 1695 bp (1692 bp mã hóa 564 amino acid bp tƣơng ứng với ba kết thúc) Với trình tự gen HA thiết kế, khuếch đại gen phản ứng PCR tạo sản phẩm có kích thƣớc 1796 bp (1695 bp + 101 bp) tƣơng ứng với gen HA clade 2.3.2.1C Trình tự amino acid protein H5 đƣợc mã hóa gen HA clade 2.3.2.1C đƣợc thiết kế thành công, loại bỏ vùng độc (loại bớt amino acid kiềm vị trí nhận biết protease) đƣợc tránh tƣợng lại độc Cụ thể, trình tự amino acid mã hóa gen HA clade 2.3.2.1C loại vùng độc thiết kế, vị trí 338343 QRET-RG, chủng gốc A/duck/VietNam/HT-02/2014(H5N1), vị trí 338-346 QRERRRK-RG (chứa amino acid kiềm -RRRK- vị trí vùng độc) So với chủng vi-rút gốc, gen HA clade 2.3.2.1C đƣợc loại vùng độc: loại arginine (R) thay lysine (K) threonine (T); tránh lại độc: arginine (R) hai đầu sát vùng độc đƣợc thay đổi nucleotide từ AGA thành CGA 29 (a) (b) Hình 3.1: Trình tự nucleotide (a) amino acid (b) gen HA clade 1.1 clade 2.3.2.1c không chứa vùng độc 30 3.2 Kết tách dòng đoạn gen HA-H5 không chứa đoạn độc chủng virút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 3.2.1 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E coli chủng DH5α Sản phẩm nhân đoạn gen HA-H5 không chứa đoạn độc clade 2.3.2.1 C sau đƣợc gắn vào vector pHW2000 đƣợc biến nạp vào tế bào E.Coli DH5α, đƣợc ni cấy mơi trƣờng có bổ sung kháng sinh Amp, X- gal nuôi 16 điều kiện 37oC Kết thu đƣợc dạng khuẩn lạc xanh trắng nhƣ hình 3.2 Hình 3.2: Hình thái khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp nuôi cấy môi trường LB Gen HA-H5 clade 2.3.2.1 C đƣợc cài vào trình tự gen lacZ, làm gen lacZ bị hỏng không tổng hợp đƣợc β-galactosidase, enzyme phân hủy Xgal tạo màu xanh (5,5 dibrom-4,4 dichloro indigo) Do khuẩn lạc màu trắng cho thấy vi khuẩn đƣợc biến nạp thành cơng vector pHW2000 có chứa đoạn gen HA; khuẩn lạc màu xanh thể vi khuẩn không biến nạp đƣợc vector pHW2000 hay vi khuẩn mang vector không chứa gen HA 31 3.2.2 Kết kiểm tra có mặt gen HA-H5 phản ứng PCR với mồi đặc hiệu Kết tách dịng kiểm tra có mặt gen đích vector pHW2000 PCR khẳng định gen HA clade 2.3.2.1C đƣợc biến nạp thành công vào vector pHW2000 (Hình 3.3) Cụ thể, kết kiểm tra có mặt gen đích PCR với hai loại mồi mồi đặc hiệu gen HA mồi đặc hiệu vector xuất băng đặc hiệu có kích thƣớc theo lý thuyết: sản phẩm nhân mồi đặc hiệu gen kích thƣớc khoảng 1800 bp (tƣơng ứng với kích thƣớc gen HA), nhân mồi vector kích thƣớc khoảng 1950 bp (tƣơng ứng với kích thƣớc gen HA phần trình tự nucleotide vector pHW2000 hai đầu gen HA) (Hình 3.3) Hình 3.3: Kết tách dịng kiểm tra có mặt gen đích vector pHW2000 PCR Giếng 1: PCR nhân gen HA clade 2.3.2.1C mồi đặc hiệu gen HA; Giếng 2: PCR nhân gen HA clade 2.3.2.1C mồi đặc hiệu vector; M: Marker 1kb 32 3.2.3 Kết kiểm tra có mặt gen HA-H5 phản ứng cắt với enzyme giới hạn Kết kiểm tra cắt với cặp enzyme NheI SmaI cho thấy: sản phẩm cắt tƣơng ứng với vector tái tổ hợp xuất băng vạch: băng có kích thƣớc lớn tƣơng ứng với kích thƣớc vector pHW2000 băng kích thƣớc nhỏ tƣơng ứng với kích thƣớc gen HA (khoảng 1800 bp) (Hình 3.4) Điều cho gen HA đƣợc gắn thành cơng vào vector pHW2000 Hình 3.4 Kết kiểm tra cắt với cặp enzyme NheI SmaI Giếng 1: sản phẩm cắt pHW2000-HA clade 2.3.2.1C, M: marker 1kb 33 3.4 Kết giải trình tự đoạn gen HA-H5 vector tách dòng Kết xác định trình tự nucleotide gen đích chứng minh gen HA clade clade 2.3.2.1 C đƣợc tạo dòng thành cơng vào vector pHW2000 với kích thƣớc trình tự nucleotide xác 100% so với trình tự thiết kế TAGTACTAAGCATATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGGTCTA ATCTGTCAAAATGGAGAAAATAGTGCTTCTTTTTGCGATAGTCAGTCTT GTTAAAAGTGATCAGATTTGCATTGGTTACCATGCAAACAACTCGACA GAGCAGGTTGACACGATAATGGAAAAGAACGTTACTGTTACACATGCC CAAGACATACTAGAAAAGACACATAACGGGAAGCTCTGTGACCTAGAT GGAGTTAGGCCTCTAATTTTGAGAGATTGTAGTGTAGCTGGATGGCTTC TCGGAAACCCAATGTGTGACGAATTCATCAATGTGCCAGAATGGTCTTA TATAGTGGAGAAGGCCAATCCAGTCAATGACCTCTGTTACCCAGGAGT TTTCAATGACTATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGAATAAACCA TTTTGAGAAAATTCAGATCATCCCAAAGAGTTCTTGGCCCAGTCATGAA GCATCATTGGGGGTGAGCGCAGCATGTCCATACCTGGGAAAGTCCTCTT TTTTCCGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAAC AATAAAGAGGAGTTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTAAT GTGGGGGATCCACCATCCTAATGATGCTGCAGAGCAGATAAAGCTCTA TCAAAATCCAACCACCTATATCTCCGTTGGGACATCAACGCTAAACCAG AGATTGACACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGT GGGAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATCTTAAAACCGAATAATGCAATC AACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAA ATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATAT GGTAACTGCAACACCAAATGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCT AGTATGCCATTCCACAATATACATCCTCTCACTATTGGAGAATGCCCCA AATATGTGAAATCAACCAGATTAGTCCTTGCGACTGGGCTCAGAAATA GCCCTCAACGAGAGGGAACGCGAGGATTATTTGGAGCTATAGCAGGGT TTATAGAGGGAGGATGGCAGGGGATGGTAGATGGTTGGTATGGGTACC ATCATAGCAATGAGCAGGGAAGCGGTTACGCTGCAGACAAAGAATCCA 34 CTCAAAAGGCTATAGATGGAGTCACCAATAAGGTCAACTCGATCATTG ACAAAATGAACACTCAGTTTGAGGCCGTTGGAAGGGAATTTAACAACT TAGAAAGAAGAATAGAGAATTTAAACAAGAAGATGGAAGACGGGTTC CTAGATGTCTGGACTTATAATGCTGAACTTCTGGTTCTCATGGAAAATG AGAGAACTCTAGACTTCCATGACTCAAATGTAAAGAACCTTTACGACA AGGTCCGATTACAGCTTAAGGATAATGCAAAGGAGCTGGGTAACGGTT GTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTGAG AAACGGGACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAA AAGAGAGGAAATAAGTGGAGTGAAATTGGAATCGATAGGAGTTTACCA AATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATC ATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAAT GCAGAATTTGCATTTAAATTTGTGAATTCAGATTGTAGTTAAAAACACC CTTGTTTCTACTAATACGAGACGATATTAGTACTAAGCATA 35 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận - Đã thiết kế thành công gen HA-H5 vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C - Đã nhân dịng thành cơng đoạn gen HA-H5 khơng chứa đoạn độc chủng vi-rút cúm A/H5N1 clade 2.3.2.1C vào vector pHW2000 4.2 Kiến nghị - Cần thêm thời gian để tách chiết tinh lƣợng lớn vector pHW2000-HA clade 2.3.2.1C làm gen kháng nguyên cho mục đích sản xuất vắc-xin tái tổ hợp kĩ thuật di truyền ngƣợc 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tham khảo Tiếng Việt Bộ y tế Cúm A/H5N1 (07/2016) Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng (1997) Sinh học phân tử, NXB Giáo dục, Hà Nội Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Trung Nam, Nguyễn Thị Bích Nga, Đinh Duy Kháng, Lê Thanh Hịa, Lê Trần Bình (2008) Áp dụng phƣơng pháp đột biến điểm định hƣớng Phoenix để loại bỏ đoạn độc gen Hemagglutinin (HA) virus cúm A/H5N1 Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 6: 555 Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Hồng Thị Thu Hằng, Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam (2017) Tách dòng sáu gen khung virus cúm vào vector pHW2000 phục vụ tạo chủng gốc vaccine cúm A/H5N1 kỹ thuật di truyền ngƣợc Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 2: tr 9-16 Nguyễn Thị Thu Hằng, Nguyễn Hùng Chí, Hồng Thị Thu Hằng, Vũ Huyền Trang, Chu Hoàng Hà, Nguyễn Trung Nam (2017) Nhân dòng vector pHW2000 tái tổ hợp mang gen HA làm nguyên liệu tạo chủng gốc ứng dụng sản xuất vaccine cúm A/H5N1 Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Tập 33, Số 1S: tr 159-167 Nguyễn Thi Bích Nga, Lê Thanh Hịa (2012) Xác định nhóm kháng ngun 1.1 2.3.2.1 virut cúm A/H5N1 xuất Việt Nam qua phân tích đặc điểm di truyền phả hệ gen hemagglutinin (H5) giai đoạn 2004-2011 Khoa học Kỹ thuật Thú y 2012, số 2: tr 16-23 Nguyễn Thị an Phƣơng, ê Văn Hiệp (2006) Nghiên cứu sản xuất vacxin phòng chống cúm A/H5N1 cho ngƣời phôi gà từ chủng NIBRG-14 Viện vacxin sinh phẩm y tế, Nha Trang Tạp chí Y học dự phịng 16 (5): tr 5-10 Phan Chí Tạo, Trần Ngọc Bích (2016) Khảo sát khả đáp ứng miễn dịch loại vaccine cúm gia cầm H5N1 vịt Hậu Giang Tạp ch Khoa hoc Trƣờng Đai học Cần Thơ, 44b: tr 127-131 37 Đậu Huy Tùng (2012) Đánh giá hiệu lực vacxin cúm H5N1 (chủng NIBRG14) số clade lƣu hành Việt Nam năm 2011 phân tích đặc tính di truyền virut H5N1 clade 2.3.2.1b Khoa học Kỹ thuật Thú y 2012, số 6: tr.1-11 Tài liệu tham khảo Tiếng Anh 10.Dau Huy Tung, Dong Van Quyen, Nguyen Tung, Tran Xuan Hanh, Kim Young Bong, Dinh Duy Khang (2015) Evaluation of efficacy of nibrg-14 vaccine against highly pathogenic H5N1 viruses isolated during 2011 influenza outbreaks in vietnam Journal of Science and Technology 50 (1): 73-81 11.Dau Huy Tung, Dong Van Quyen, Tung Nguyen, Hanh Tran Xuan,Thang Nguyen Nam, Khang Dinh Duy (2013) Molecular characterization of a H5N1 highly pathogenic avian influenza virus clade 2.3.2.1b circulating in Vietnam in 2011 SciVerse ScienceDirect, VETMIC-6194: 12.Hoffmann E et al (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids Proc Natl Acad Sci USA 97(11): 6108–6113 13.Hoffmann E et al (2001) Universal primer set for the full-length amplification of all influenza A viruses Arch Virol 146(12): 2275–2289 14.Erich Hoffmann, Gabriele Neumann, Gerd Hobom, Robert G Webster, and Yoshihiro Kawaoka (2000) "Ambisense" approach for the generation of influenza A virus: vRNA and mRNA synthesis from one template Virology 2000; 267(2); 310-317 [PubMed: 10662626] 15.Jin-Wook Jang, Chung-Young Lee, Il-hwan Kim, Jun-Gu Choi, Youn-Jeong Lee, Seong-Su Yuk, Ji-Ho Lee, Chang-Seon Song, Jae-Hong Kim, Hyuk-Joon Kwon (2017) Optimized clade 2.3.2.1c H5N1 recombinant-vaccine strains against highly pathogenic avian influenza J Vet Sci 2017, 18(S1): 299-306 16 Lizette O Durand, Patrick Glew, Diane Gross, Matthew Kasper, Susan Trock, Inkyu K Kim, Joseph S Bresee, Ruben Donis, Timothy M Uyeki, Marc-Alain Widdowson (2015) Timing of Influenza A(H5N1) in Poultry and Humans and Seasonal Influenza Activity Worldwide, 2004–2013 Emerg Infect Dis, 21(2): 202–208 38 17 Uchida Y, Takemae N, Saito T (2014) Application of reverse genetics for producing attenuated vaccine strains against highly pathogenic avian influenza viruses J Vet Med Sci 76(8): 1111 - 1117 18 Volker Czudai-Matwich, Markus Schnare, Olaf Pinkenburg (2013) A simple and fast system for cloning influenza A virus gene segments into pHW2000-and pCAGGS-based vectors Archives of Virology, October 2013, 158 (10): 2049– 2058 39 ... AGATTGACACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGT GGGAGGATGGAGTTCTTCTGGACAATCTTAAAACCGAATAATGCAATC AACTTCGAGAGTAATGGAAATTTCATTGCTCCAGAATATGCATACAAA ATTGTCAAGAAAGGGGACTCAACAATTATGAAAAGTGAATTGGAATAT GGTAACTGCAACACCAAATGTCAAACTCCAATGGGGGCGATAAACTCT... TTTTCCGAAATGTGGTATGGCTTATCAAAAAGAACAGTACATACCCAAC AATAAAGAGGAGTTACAATAATACCAACCAAGAAGATCTTTTGGTAAT GTGGGGGATCCACCATCCTAATGATGCTGCAGAGCAGATAAAGCTCTA TCAAAATCCAACCACCTATATCTCCGTTGGGACATCAACGCTAAACCAG AGATTGACACCAAGAATAGCTACTAGATCCAAAGTAAACGGGCAAAGT... GTTTCGAGTTCTATCACAAATGTGATAATGAATGTATGGAAAGTGTGAG AAACGGGACGTATGACTACCCGCAGTATTCAGAAGAAGCAAGATTAAA AAGAGAGGAAATAAGTGGAGTGAAATTGGAATCGATAGGAGTTTACCA AATACTGTCAATTTATTCTACAGTGGCGAGTTCCCTAGCACTGGCAATC ATGGTAGCTGGTCTATCCTTATGGATGTGCTCCAATGGGTCGTTACAAT