PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU I ĐẶT VẤN ĐỀ Ớt loại người trồng trọt để thu hái từ lâu đời Với khơng người, ớt loại gia vị thiếu bữa ăn, giúp làm tăng cảm giác ngon miệng Ngoài ra, ớt cịn vị thuốc q y học cổ truyền Vì vậy, diện tích trồng ớt ngày tăng cao Những năm gần Việt Nam, nhà chọn tạo giống ớt đạt số kết đáng khả quan Song cấu giống ớt nước ta chưa phong phú, giống dùng cho chế biến, xuất cịn q ít, khơng đủ cho nhu cầu sản xuất với qui mô lớn, khả chống chịu sâu bệnh nên làm giảm số lượng chất lượng giống ớt Việc nhập nội giống mới, giống lai từ nước ngồi có suất, chất luợng tốt phương thức chủ yếu để đáp ứng nhu cầu cấu giống phù hợp với vùng sinh thái mục tiêu sử dụng khác nhau, với phương thức nhập nội có giá thành tương đối cao khơng chủ động giống, cơng tác chọn tạo giống nước ngày trở nên cấp bách Trong chọn tạo giống ớt phương pháp truyền thống, để tạo dòng cho việc thử khả kết hợp chung kết hợp riêng phải từ 4-5 hệ (2-3 năm) dẫn đến kéo dài thời gian cho công tác chọn tạo giống, gây tốn kinh phí sức lao động Bằng phương pháp nuôi cấy hạt phấn ớt khắc phục nhược điểm phương pháp Cây đơn bội kép tạo từ ni cấy hạt phấn có độ đồng hợp tử tuyệt đối, hồn tồn khơng phân ly hệ sau tạo thời gian ngắn (1 hệ), tiết kiệm nhiều công sức, tiền đặc biệt rút ngắn thời gian cho công tác chọn tạo giống ớt Hiện Việt Nam, việc ứng dụng kỹ thuật đơn bội tập trung lúa, ngô thu nhiều thành công Cho tới chưa có quy trình hồn thiện ni cấy bao phấn ớt Vì vậy, vấn đề chọn tạo giống ớt kỹ thuật nuôi cấy bao phấn đòi hỏi cấp thiết Tuy nhiên, trình nghiên cứu áp dụng kỹ thuật ni cấy bao phấn nhiều loại trồng, nhà khoa học tìm có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả tạo callus tái sinh cây: kiểu gen, giai đoạn phát triển bao phấn, môi trường nuôi cấy Hơn nữa, việc nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến kết nuôi cấy bao phấn Việt Nam hạn chế, tỷ lệ tái sinh xanh chưa cao Vì vậy, cần phải tìm điều kiện tối ưu cho q trình ni cấy để việc nuôi cấy bao phấn áp dụng có hiệu chọn tạo giống trồng Xuất phát từ vấn đề với mục đích hồn thiện quy trình ni cấy bao phấn ớt, đề xuất thực đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố ngoại sinh đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt (Capsicum annuum L.)" II MỤC ĐÍCH YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI 2.1 Mục đích đề tài Xây dựng hệ thống tái sinh invitro từ bao phấn ớt làm sở phục vụ cho công tác chọn tạo giống 2.2 Yêu cầu đề tài - Đánh giá ảnh hưỏng môi trường đến khả tạo callus từ bao phấn ớt - Xác định thời gian xử lý lạnh hợp lý để tạo callus từ bao phấn ớt - Xác định chất điều hoà sinh trưởng hợp lý để tạo callus từ bao phấn ớt PHẦN HAI: TỔNG QUAN TÀI LIỆU I GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY ỚT (Capsicum annuum L.) 1.1 Nguồn gốc, phân bố địa lý, đặc điểm thực vật học, yêu cầu ngoại cảnh ớt (Capsicum annuum L.) 1.1.1.Nguồn gốc Cây ớt có tên khoa học Capsicum annuum L., thuộc họ Cà Solanaceae Cây có nguồn gốc địa lý từ Mexico, Trung Nam Mỹ Safford phát ớt khô nghĩa địa cũ Peru có 2000 năm tuổi Nguồn gốc thực vật học ớt từ dạng ớt cay hoang dại Nam Mỹ hoá trồng Châu Âu, Ấn Độ cách 500 năm (http://vi.wikipedia.org/wiki/%E1%BB%9At) 1.1.2 Phân bố địa lý Cây ớt xuất từ lâu song đến tận kỷ 16 người Châu Âu biết đến ớt Ớt Christopher Colombor đưa vào Tây Ban Nha vào năm 1493 ông ghé thăm nước hành trình vịng quanh giới Việc gieo trồng phổ biến từ Địa Trung Hải đến nước Anh vào năm 1958 đến Trung Âu vào cuối kỷ 16 Sau người Bồ Đào Nha mang ớt từ Brazil đến Ấn Độ vào năm 1885, Trung Quốc vào khoảng cuối năm 1970…Và việc ớt du nhập vào Việt Nam chưa có tài liệu xác song theo vài tác giả cho người Pháp có cơng mang ớt sang nước ta 1.1.3 Đặc điểm thực vật học + Thân: Ớt bụi, thân gỗ hai mầm, thân thường mọc thẳng, đơi gặp dạng có thân bị nhiều cành, chiều cao trung bình 0.5- 1.5m, hàng năm lâu năm thường gieo trồng hàng năm + Rễ: Ban đầu ớt có rễ cọc phát triển mạnh với nhiều rễ phụ, theo thời gian trồng trọt, rễ cọc bị đứt hệ rễ chùm phát triển nên người ta lầm tưởng ớt có hệ rễ chùm + Lá: đơn mọc xoắn thân chính, có nhiều dạng khác thường gặp dạng mác, trứng ngược, mép cưa + Hoa: Các hoa hoàn thiện thường sinh đơn độc nách lá, riêng lồi C.chinense có tới 2-5 hoa nách Hoa mọc thẳng đứng bng thõng Hoa thường có màu trắng, số giống có màu sữa, xanh lam tím, hoa có 5-7 cánh hoa, có cuống dài khoảng 1.5cm, đài (5-7) ngắn có dạng chng, dài khoảng 2mm bọc lấy Nhụy đơn giản có màu trắng tím Hoa có 5-7 nhị đực với ống phấn màu xanh da trời tím, bao phấn có màu tím với số lượng 4-6 bao phấn/ hoa + Quả: Ớt thuộc loại mọng có nhiều hạt, thịt nhăn chia làm hai ngăn Tuỳ vào giống khác có kích thước quả, hình dạng quả, độ nhọn, màu sắc, độ mềm thịt khác Quả chưa chín có màu xanh sau chuyển dần sang màu đỏ vàng chín Hiện nay, nước ta thường trồng phổ biến số giống lai F1 Trung Quốc, Hàn Quốc, Đài Loan…có dạng hình chng, thịt mỏng, dạng hình tim dài + Hạt: có dạng thận màu vàng rơm, hạt có đường kính khoảng 35mm, chiều dài khoảng 3-5mm 1.1.4 Yêu cầu ngoại cảnh ớt (Capsicum annuum L.) Cây ớt ưa khí hậu khơ ấm Cây phát triển tốt đất thịt nhẹ, đất pha cát dễ thoát nước Hạt ớt nảy mầm nhiệt độ từ 25-30oC, 10oC hạt không mọc Thời kỳ hoa cần nhiệt độ 15- 20oC, nhiều ánh sáng Cây ớt có khả chịu hạn cao, lúc hoa cần độ ẩm >70%, song không chịu ngập úng, pH 5.5-7, tưới tiêu chủ động 1.2 Thành phần dinh dƣỡng, giá trị sử dụng giá trị kinh tế ớt (Capsicum annuum L.) 1.2.1 Thành phần dinh dưỡng giá trị sử dụng Ở Việt Nam, ớt loại rau gia vị có giá trị kinh tế cao, trồng chủ yếu tỉnh miền Trung Nam Những năm gần đây, số tỉnh đồng sông Hồng bắt đầu trồng với diện tích lớn, nhằm cung cấp nguyên liệu cho nhà máy, công ty sản xuất mặt hàng thực phẩm để tiêu thụ xuất khẩu, đem lại lợi nhuận cao Ớt giàu loại vitamin, đặc biệt vitamin A C Trong đó, loại ớt hình chng đỏ có nhiều loại sắc tố khác như: capsanthin capsorvbin6%, cryptocapsin - 4% vitamin C khoảng 321mg (Curl, 1962), (Simon, 1960) Bảng 1: Hàm lƣợng chất chứa ớt (trong 100g phần ăn đƣợc) Thành phần Hàm lượng Thành phần Hàm lượng Vitamin B+B2 0.02-0.1 mg Ca 11g Axit folic 1.3-2.9 mg Vitamin A 870I.U Axit nicotinic 6-10 mg Axit ascorbic 175 Nước 92,4% Thiamin 0.06 mg Calo 29 Riboflavin 0.03mg Protein 1-2g Niaxin 0.55 mg Theo Joshi Sing, 1975 Nhờ chứa lượng vitamin C tương đối cao: 100g ớt có chứa 120mg vitamin C, tương đương với 75% lượng vitamin C thể cần ngày nên ớt có vai trị quan trọng việc cung cấp vitamin cho ăn, dù để sống trộn với salat hay nấu chín Với lượng ớt, lượng vitamin A loại rau mang lại từ 15-50% tổng lượng vitamin cung cấp cho thể Bên cạnh loại gia vị thiếu bữa ăn, giúp làm tăng cảm giác ngon miệng, ớt vị thuốc q y học cổ truyền, chữa nhiều bệnh hữu hiệu Theo y học cổ truyền, ớt có vị cay, nóng, có tác dụng khoan trung, tán hàn, kiện tỳ, tiêu thực, thống (giảm đau), kháng nham (chữa ung thư…) Do vậy, ớt thường dùng để chữa đau bụng lạnh, tiêu hóa kém, đau khớp, chữa vết rắn cắn… Nghiên cứu y học đại thống với y học cổ truyền tác dụng chữa bệnh ớt Kết luận nghiên cứu nhà khoa học Trung Quốc cho thấy ớt có nhiều ích lợi cho sức khoẻ Trong ớt có chứa số hoạt chất: capsicain alkaloid chiếm tỷ lệ khoảng 0.05- 2%, xác định acid isodexenic vanilyamit, có đặc điểm bốc nhiệt độ cao, gây hắt mạnh Ngồi ra, cịn có capsaicin, hoạt chất gây đỏ nóng, xuất ớt chín, chiếm tỷ lệ từ 0.01- 0.1 % Capsaicin có tác dụng kích thích não sản xuất chất endorphin, chất morphin nội sinh, có đặc tính thuốc giảm đau, đặc biệt có ích cho bệnh nhân bị viêm khớp mãn tính bệnh ung thư Ngồi ra, ớt cịn giúp ngăn ngừa bệnh tim chứa số hoạt chất giúp máu lưu thơng tốt, tránh tình trạng đóng vón tiểu cầu dễ gây tai biến tim mạch Một số nghiên cứu cho thấy, loại ớt vỏ xanh, trái nhỏ có hàm lượng capsaicin nhiều Ngồi ra, cịn có chứa nhiều loại vitamin: C, B1, B2, acid citric, acid malic, β caroten… 1.2.2 Giá trị kinh tế ớt (Capsicum annuum L.) Chính giá trị to lớn lĩnh vực thực phẩm dược phẩm mà ớt mang lại, giá ớt có xu hướng tăng mạnh Trên Sở giao dịch hàng hoá Quốc gia Ấn Độ cho biết giá ớt vào khoảng 4.557 Rupi/ 100Kg Ước tính, sản lượng vụ tới vào cuối tháng 10 năm đạt 28-30 triệu bao loại 35 Kg, tăng 20-25% so với năm trước Đồng thời việc xuất ớt Ấn Độ tăng nhanh nhu cầu tăng từ nước nhập như: Malaysia, Srilanka, Mỹ, Bangladet…, chiếm 48% tổng khối lượng 28% tri giá xuất gia vị nước Còn Việt Nam, ớt loại mặt hàng có kim ngạch xuất cao với 448 nghìn USD Các chủng loại ớt xuất đa dạng bao gồm: ớt tươi, ớt khô, ớt muối, ớt đông lạnh…Trung Quốc Hàn Quốc hai thị truờng nhập ớt lớn thời gian này, chiếm 53.2 35.1% tổng kim ngạch xuất ớt nước Một thực tế cho thấy: huyện Mường Khương (Lào Cai), ớt mũi nhọn đem lại hiệu kinh tế cao cho người dân Trước đây, giá ớt tươi bấp bênh khoảng 2000-4000đồng/ kg giá mua mức ổn định 13000- 15000 đồng/kg Tổng kết vụ ớt năm 2005 Phòng kinh tế huyện, suất trung bình đạt 8tạ/ha, tính giá trị ớt cao gấp 2-3 lần so với ngô rau màu khác đơn vị diện tích mức đầu tư lại thấp nhiều II GIỚI THIỆU VỀ PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY BAO PHẤN TRONG CHỌN TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG: Nuôi cấy mô tế bào thực vật vấn đề nhà khoa học quan tâm nghiên cứu Năm 1902, Haberlandt - nhà thực vật học người Đức đề xuất phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính tồn tế bào Theo ông, tế bào thể sinh vật mang toàn lượng thông tin di truyền cần thiết đầy đủ sinh vật đó, gặp điều kiện thích hợp, tế bào phát triển thành thể hoàn chỉnh Theo thời gian, với tiến kỹ thuật nuôi cấy tế bào tạo khả tái sinh phạm vi lớn quan thực vật Việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn mở tiềm to lớn tạo đơn bội trồng Bởi lẽ, thực vật đơn bội đối tượng hữu ích chương trình chọn giống thực vật để chọn đặc điểm mong muốn, kiểu hình chúng biểu đơn, không bị gen trội lấn át Chúng nguồn vật liệu khởi đầu cần thiết công tác tạo giống đồng thời sản phẩm cuối qui trình tạo giống (đối với dịng tự thụ phấn) Để nhận dòng đồng hợp tử từ thể đột biến lai thực vật, từ xưa đến người ta áp dụng phương pháp cho tự thụ phấn phối hợp với chọn dòng liên tục qua từ 8-16 hệ Thông thường, người ta chọn lọc theo hai cách: chọn lọc đơn bội xuất ngẫu nhiên; lai xa sau nhiễm sắc thể thối biến cịn lại nhiễm sắc thể đơn bội Rõ ràng theo phương pháp cổ truyền này, người ta phải nhiều thời gian cơng sức chi phí bỏ Ni cấy bao phấn phương pháp để tạo dòng đồng hợp tử thời gian vài tháng so với yêu cầu nhiều hệ sử dụng phương pháp truyền thống (Choo et al, 1985; Morrison & Evans, 1988; Snape, 1989) Và đơn bội sản phẩm cuối ni cấy bao phấn, chúng có đặc điểm có độ đồng hợp tử cao nguồn vật liệu đa dạng phong phú cho chọn giống (Knapp, 1991; Michell et al, 1992; Bjonstad et al, 1993) Vậy ni cấy bao phấn gì? Đó kỹ thuật ni cấy invitro bao phấn có chứa tiểu bào tử hạt phấn chưa chín mơi trường dinh dưỡng nhằm mục đích tạo đơn bội, giúp ta rút ngắn thời gian chọn giống, làm tăng hiệu chọn lọc, tăng biến dị cho chọn lọc giúp giải vấn đề lai xa, đặc biệt nhiều lồi trồng có mức độ dị hợp tử cao cần phải nhiều năm ni trồng cẩn thận tạo dịng qua việc tự thụ phấn Kỹ thuật tạo đơn bội invitro thơng qua việc kích thích tiểu bào tử phát triển thành nuôi cấy bao phấn nhanh chóng tạo hàng loạt đơn bội lối thoát kỳ diệu lĩnh vực ứng dụng đơn bội vào nghiên cứu di truyền tạo giống trồng (Trần Duy Quý, 1999) Chúng ta hình dung theo sơ đồ sau: Bình thường phát triển tế bào sinh dục đực bao phấn theo giai đoạn sau: từ tế bào mẹ thơng qua q trình phân bào giảm nhiễm hình thành tiểu bào tử (đơn bội) Sau từ tiểu bào tử hình thành giao tử đực (hạt phấn - đơn bội) Nhưng ta đưa bao phấn vào nuôi cấy môi trường nhân tạo, phát triển tiểu bào tử khác Dưới tác động loạt yếu tố môi trường nuôi cấy, đặc biệt chất kích thích sinh trưởng tế bào diễn q trình phản phân hố, từ tiểu bào tử phân chia hình thành mơ sẹo Các mơ sẹo lúc đầu bao gồm tế bào đơn bội Sau tuỳ điều kiện ni cấy chúng đơn bội hay bị lưỡng bội hoá Khi cần thiết, đơn bội xử lý colchicine để chuyển thành lưỡng bội Tất thể lưỡng bội thu hai trường hợp đồng hợp tử (hoàn toàn phương diện di truyền) chúng có nguồn gốc từ tế bào đơn bội (Phan Phải, Vũ Đức Quang cộng sự, 1990) Trong nuôi cấy bao phấn tuỳ theo loại trồng mà thu tỷ lệ số đơn bội nhị bội khác nhau, vài trường hợp cụ thể thu có mức độ bội thể cao (Chu & CS, 1982) Các bao phấn dùng để nuôi cấy thường lấy từ quần thể F1 F2 nhằm tạo đa dạng di truyền tối đa quần thể đơn bội III.TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ ỨNG DỤNG NUÔI CẤY BAO PHẤN TRÊN THẾ GIỚI VÀ TRONG NƢỚC 3.1 Tình hình nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy bao phấn giới Kỹ thuật nuôi cấy bao phấn, hạt phấn giúp cho nhà khoa học rút ngắn thời gian tạo đơn bội so với phương pháp truyền thống Đó lối kì diệu lĩnh vực ứng dụng đơn bào vào nghiên cứu di truyền tạo giống trồng Nuôi cấy hạt phấn thành công vào năm 1950 Morel (người Pháp) thực hạt phấn khoả tử (cây mầm) nước dừa tạo thành mô sẹo Tiếp theo hai nhà khoa học người Ấn Độ Guha Mahe shamari (1964) nuôi cấy thành công hạt phấn cà độc dược (Datura inno xia) [13], tạo phôi từ phôi cho hồn chỉnh Kỹ thuật ni cấy bao phấn phát triển hồn thiện nhờ cơng trình Bouisgin Nitsch (1967) thuốc (Nicotiana), đặc biệt Niizeki Oono nuôi cấy thành công bao phấn lúa (Oryza Sativa) năm 1968, thu đơn bội, tạo khả ứng dụng lớn cho công tác chọn tạo chọn giống lúa Sau thành công Niizeki Oono (1968), kỹ thuật nuôi cấy bao phấn nghiên cứu ứng dụng rộng rãi nhiều nước giới Việc đưa đơn bội vào chương trình tạo giống lúa mì, lúa mạch, thuốc lá, ngô, ớt… trở thành phổ biến nước: Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, Pháp, Triều Tiên… Các tác giả Pháp (E.Teoulé Y.Demarly, 1998) cho rằng: bình quân người tiết kiệm năm sử dụng kỹ thuật đơn bội cho việc tạo giống Tại Trung Quốc công nghệ đơn bội triển khai có hệ thống quy lớn có định hướng chiến lược rõ ràng Hơn 1000 sở nuôi cấy bao phấn hoạt động toàn quốc từ năm 1970, kết cho thấy có hàng chục vạn lúa trồng giống tạo phương pháp nuôi cấy bao phấn (Niizeki, 1999; Đỗ Năng Vịnh, 2002) Cũng Trung 10 TT Môi trƣờng MS B5 N6 Số bao phấn cấy 200 200 200 Số bao phấn tạo callus 70 32,3 20,6 Tỷ lệ bao phấn tạo callus (%) 35 16,17 10,30 Qua nghiên cứu nhiều tài liệu, nhận thấy hầu hết đối tượng nuôi cấy bao phấn đặc biệt lúa thích ứng với mơi trường N6, ớt thông qua bảng kết 4.2, môi trường MS môi trường cho tỷ lệ bao phấn tạo callus cao (35%) so với hai môi trường Tuy nhiên, tỷ lệ bao phấn tạo callus mơi trường tương đối thấp, ngun nhân bao phấn khơng thích ứng với mơi trường nuôi cấy, sức sống hạt phấn yếu, thao tác cấy…dẫn tới bao phấn chết không phản ứng, hiệu thí nghiệm đạt khơng cao Do điều kiện thời gian có hạn nên chúng tơi khơng tiến hành thí nghiệm nhiều loại mơi trường khác cải tiến thành phần môi trường…Song qua kết thí nghiệm chúng tơi kết luận rằng: tỷ lệ bao phấn tạo callus nhiều nuôi cấy bao phấn ớt môi trường MS IV ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ NUÔI CẤY BAO PHẤN ỚT Nguồn cacbon thành phần môi trường nuôi cấy bao gồm loại đường saccarose, mannitol, glucose…không cung cấp lượng mà cịn kích thích tính thẩm thấu tồn tế bào Nồng độ đường mức định làm tăng khả tạo callus tái sinh xanh từ nuôi cấy bao phấn nhiều loại trồng Để biết ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tạo callus bao phấn ớt nào, chúng tơi tiến hành bố trí hàm lượng đường môi trường nuôi cấy: 30, 60, 90, 120, 150g đường saccarose/l môi trường Sau 3-4 tuần ni cấy, callus hình thành Kết trình bày bảng 4.3: Bảng 4.3: Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt 35 TT CTTN MS + 30g MS + 60g MS + 90g MS + 120g MS + 150g Số bao phấn cấy 200 200 200 200 200 Số bao phấn tạo callus 119 137 151 129 118,3 Tỷ lệ bao phấn tạo callus (%) 59,5 68,5 75,5 64,5 59,2 Qua bảng kết nhận thấy, tỷ lệ bao phấn tạo callus nồng độ đường khác thay đổi không nhiều Khi tăng nồng độ đường từ 30g/l - 90g/l nhận thấy tỷ lệ bao phấn tạo callus tăng lên Ở nồng độ đường 90g /l có tỷ lệ bao phấn tạo callus cao (75,5%) Tiếp tục tăng nồng độ đường tới 120, 150 g/l tỷ lệ bao phấn phát sinh callus lại giảm dần công thức Như vậy, nồng độ đường 90g/l môi trường nuôi cấy bao phấn ớt cho tỷ lệ tạo callus cao V ẢNH HƢỞNG CỦA CHẤT ĐIỀU TIẾT SINH TRƢỞNG ĐẾN KHẢ NĂNG PHÁT SINH CALLUS TỪ NUÔI CẤY BAO PHẤN ỚT Trong q trình tạo mơ sẹo tái sinh xanh nuôi cấy bao phấn, việc bổ sung chất điều tiết sinh trưởng cần thiết loại môi trường Tuy nhiên, vấn đề quan trọng sử dụng chất điều tiết sinh trưởng nồng độ bao nhiêu, sử dụng chất riêng rẽ hay kết hợp với cho hiệu tốt Do nuôi cấy bao phấn ớt cịn mẻ chúng tơi vào số tài liệu tham khảo ngồi nước ni cấy bao phấn số loại trồng (thuộc họ Cà) để làm sở tiến hành nghiên cứu vai trò chất điều hoà sinh trưởng (auxin, cytokinin) đến khả tạo callus từ bao phấn ớt 5.1 Ảnh hƣởng nồng độ BAP đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt BAP (Bezylamino purine) thuộc nhóm cytokinin có tác dụng tích cực việc kích thích phân chia tế bào, kéo dài thời gian sinh trưởng mô phân sinh làm hạn chế già hoá tế bào Đặc biệt, BAP có tác dụng 36 dương tính rõ rệt đến phát sinh phơi vơ tính mẫu nuôi cấy Để nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt, chúng tơi tiến hành bố trí thí nghiệm với nồng độ BAP bổ sung lần lượt: 0,5; 1; 1,5; mg/l vào môi trường nuôi cấy Sau tuần ni cấy, kết thí nghiệm trình bày bảng 4.4: Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng độ BAP đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt CTTN Nồng độ BAP (mg/l) 1(ĐC) 0,5 1,0 1,5 2,0 Số bao phấn cấy 200 200 200 200 200 Số bao phấn tạo callus hữu hiệu 71 137,6 76,6 61,6 Tỷ lệ callus hữu hiệu (%) 35,5 68,8 38,3 30,8 Kết bảng 4.4 chứng tỏ BAP có ảnh hưởng mạnh đến khả tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt Ở công thức đối chứng không bổ sung BAP bao phấn ớt khơng có phản ứng Khi bổ sung BAP nồng độ thấp (0,5mg/l) bắt đầu thấy xuất callus với tỷ lệ 35,5% tỷ lệ callus đạt giá trị cao nồng độ BAP 1,0mg/l (68,8%) Nhưng tiếp tục tăng nồng độ BAP tỷ lệ tạo callus từ bao phấn lại giảm dần Như vậy, nồng độ BAP 1,0mg/l phù hợp để bao phấn ớt phát sinh callus 5.2 Ảnh hƣởng nồng độ kinetin đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt Kinetin chất điều tiết sinh trưởng thuộc nhóm cytokinin Vì vậy, mang tính chất đặc trưng nhóm Để so sánh hiệu BAP kinetin chúng tơi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng kinetin đến khả phát sinh callus từ ni cấy bao phấn ớt Thí nghiệm bố trí với nồng độ kinetin từ - 2mg/l mơi trường thí nghiệm (MS + 30g đường/l + 6g agar/l) Kết nghiên cứu trình bày bảng 4.5: 37 Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ kinetin đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt TT Nồng độ kinetin Số bao Số bao phấn tạo Tỷ lệ callus (mg/l) phấn callus hữu hiệu hữu hiệu cấy (%) 1(ĐC) 200 0 0,5 200 38,6 19,3 1,0 200 47 23,5 1,5 200 35,6 17,8 2,0 200 34 17 Kết nghiên cứu cho thấy: bổ sung kinetin vào mơi trường ni cấy tỷ lệ cho callus hữu hiệu thấp so với ta bổ sung BAP nồng độ 1mg/l kinetin cho tỷ lệ tạo callus hữu hiệu đạt 23,5% Khi tiếp tục tăng nồng độ kinetin lên 1,5 – mg/l tỷ lệ tạo callus lại có xu hướng giảm xuống Tóm lại, thơng qua hai thí nghiệm ảnh hưởng kinetin BAP đến khả phát sinh callus từ ni cấy bao phấn ớt, chúng tơi sơ kết luận: BAP có ảnh hưởng tốt Kinetin điều kiện nuôi cấy 5.3 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP + αNAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt Để nâng cao tỷ lệ tạo callus hữu hiệu, chúng tơi tìm hiểu ảnh hưởng tổ hợp BAP + αNAA đến khả tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt, thí nghiệm tiến hành 10 cơng thức với nồng độ BAP 1,0 mg/l phối hợp với αNAA từ 1,0 -5,0 mg/l Sau tuần nuôi cấy, kết thí nghiệm trình bày bảng 4.6: Bảng 4.6 Ảnh hưởng tổ hợp BAP + αNAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt 38 CTTN Nồng độ (αNAA) 1(ĐC) 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 10 5,0 Số bao phấn cấy 200 200 200 200 200 200 200 200 200 200 Số bao phấn tạo callus hữu hiệu 138,3 71 83,6 100,6 109 133,3 141 189,6 141,6 125,3 Tỷ lệ callus hữu hiệu (%) 69,2 35,5 41,8 50,3 54,5 66,7 70,5 94,8 70,8 62,7 Từ kết thu cho thấy: công thức đối chứng việc sử dụng nồng độ BAP tối ưu (1,0mg/l) khơng có kết hợp αNAA cho tỷ lệ tạo callus tương đối cao ảnh hưởng riêng rẽ BAP đến hình thành callus từ ni cấy bao phấn ớt cho tốt (từ kết thu thí nghiệm 4.5.1) Khi bổ sung nồng độ αNAA tăng từ 1,0 – 3,5 mg/l tỷ lệ tạo callus tăng lên từ 35,5 -70,5% ngưỡng αNAA 4,0 mg/l tỷ lệ callus đạt cao lên tới 94,8% Nhưng nồng độ αNAA tiếp tục tăng cao tỷ lệ tạo callus lại giảm xuống Có thể nói, việc phối hợp tỷ lệ chất điều tiết sinh trưởng cách phù hợp có vai trị quan trọng ni cấy bao phấn, làm tăng hiệu tạo callus cách rõ rệt Công thức đánh giá tốt công thức với việc sử dụng 1,0 mg/l BAP + 4,0 mg/l αNAA 5.4 Ảnh hƣởng tổ hợp BAP + IAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt Nhằm so sánh hiệu tác động IAA với αNAA cho kết hợp với 1,0mg/l BAP, chúng tơi tiến hành bố trí 10 cơng thức thí nghiệm mơi trường MS + 1,0 mg/l BAP kết hợp với IAA có nồng độ từ – 5mg/l Sau tuần nuôi cấy, kết thí nghiệm trình bày bảng 4.7: 39 Bảng 4.7: Ảnh hưởng tổ hợp BAP + IAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt TT CTTN Số bao phấn cấy Số bao phấn tạo callus hữu hiệu Tỷ lệ callus hữu hiệu (%) MS + 1,0mg/lBAP 200 54,6 27,3 MS+1,0mg/lBAP+1,0 mg/lIAA 200 60,3 30,2 MS+1,0mg/lBAP+1,5 mg/lIAA 200 62,3 31,2 MS+1,0mg/lBAP+2,0mg/lIAA 200 80 40 MS+1,0mg/lBAP+2,5 mg/lIAA 200 74 34 MS+1,0mg/lBAP+3,0 mg/lIAA 200 60 30 MS+1,0mg/lBAP+3,5 mg/lIAA 200 54 27 MS+1,0mg/lBAP+4,0 mg/lIAA 200 44 22 MS+1,0mg/lBAP+4,5 mg/lIAA 200 42 21 10 MS+1,0mg/lBAP+5,0 mg/lIAA 200 40,3 20,2 Kết bảng 4.7 cho thấy: tổ hợp BAP + IAA cho tỷ lệ tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt thấp nhiều so với sử dụng tổ hợp BAP + αNAA Tỷ lệ tạo callus cao tổ hợp đem lại 40% nồng độ IAA 2,0mg/l tổ hợp BAP + αNAA cho tỷ lệ >90% (từ thí nghiệm 4.5.3) 5.5 Ảnh hƣởng tổ hợp 2,4D + BAP + IAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt Với mục đích để thăm dị hiệu tác động tổng hợp chất điều tiết sinh trưởng đến khả phát sinh callus dựa tài liệu tham khảo, tiến hành phối hợp chất điều tiết sinh trưởng: 2,4D; BAP; IAA môi trường MS + 30g đường + 6g agar Thí nghiệm bố trí với cơng thức khác nhau: môi trường MS + 1,5 mg/l 2,4-D + 1,0 mg/l 40 BAP kết hợp với IAA có nồng độ từ – 0,5mg/l Kết thí nghiệm trình bày bảng 4.8: Bảng 4.8: Ảnh hưởng tổ hợp 2,4D + BAP + IAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn TT CTTN Số bao phấn cấy MS+1,5mg 2,4D+1,0mgBAP (Đ/C) MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,1mgIAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,2mgIAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,3mgIAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,4mgIAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,5mgIAA 200 200 200 200 200 200 Số bao phấn tạo callus 91 93 102,3 87,6 83,6 70,3 tỷ lệ tạo callus (%) 45,5 46,5 51,2 43,8 41,8 35,2 Từ kết nhận thấy: chênh lệch công thức khác tỷ lệ phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn không lớn Khi bổ sung IAA nồng độ 0,1- 0,2 mg/l cho thấy tỷ lệ tạo callus tăng lên đạt cao CT3 (51,2%) Khi tiếp tục tăng nồng độ IAA tỷ lệ callus tạo lại có xu hướng giảm xuống 5.6 Ảnh hƣỏng tổ hợp 2,4D + BAP + αNAA đến khả phát sinh callus từ ni cấy bao phấn ớt Thí nghiệm bố trí với cơng thức khác mơi trường MS + 1,5 mg/l 2,4D + 1,0 mg/l BAP kết hợp với αNAA có nồng độ từ – 0,5 mg/l Kết trình bày bảng 4.9: Bảng 4.9: Ảnh hưởng tổ hợp 2,4D + BAP + αNAA đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt 41 CTTN Số bao phấn cấy MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP (Đ/C) MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,1mgαNAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,2mgαNAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,3mgαNAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,4mgαNAA MS+1,5mg2,4D+1,0mgBAP+0,5mgαNAA 200 200 200 200 200 200 TT Số bao phấn tạo callus 91 88,3 60,4 53,3 47,6 37,3 tỷ lệ tạo callus (%) 45,5 44,2 30,2 26,6 23,8 18,6 Kết bảng 4.9 cho thấy: bổ sung αNAA vào mơi trường ni cấy khơng khơng có tác dụng tích cực mà tất cơng thức có bổ sung αNAA: nồng độ αNAA tăng tỷ lệ tạo callus từ ni cấy bao phấn ớt giảm 42 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ I KẾT LUẬN Quá trình xử lý lạnh cho bao phấn trước ni cấy có ảnh hưởng lớn đến khả phát sinh callus từ nuôi cấy bao phấn ớt Ở ngưỡng nhiệt độ 4ºC khoảng thời gian 24h cho hiệu tạo callus tốt Với môi trường dinh dưỡng nghiên cứu nuôi cấy bao phấn ớt: MS, N6, B5 nhận thấy MS tỏ môi trường có ảnh hưởng tốt so với hai mơi trường lại Việc tăng nồng độ đường ni cấy bao phấn ớt có tác dụng làm tăng hiệu tạo callus với nồng độ đường 90g/l cho tỷ lệ phát sinh callus cao (75,5%) BAP có ảnh hưởng mạnh việc làm tăng tỷ lệ phát sinh callus từ bao phấn ớt Ở nồng độ 1,0 mg/l BAP bổ sung vào môi trường nuôi cấy cho tỷ lệ tạo callus tốt (68,8%) Kinetin có tác dụng khơng rõ rệt việc làm tăng tỷ lệ tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt, khả callus tạo tương đối thấp, cao đạt 23,5% nồng độ 1,0mg/l kinetin Việc phối hợp BAP αNAA nâng cao tỷ lệ tạo callus lên đáng kể, môi trường MS + 1,0 mg/l BAP + 4,0 mg/l αNAA mơi trường thích hợp cho việc tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt (94,8%) 43 Việc kết hợp BAP IAA tỏ hiệu so với kết hợp BAP với αNAA, tỷ lệ tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt thấp (40%) Sự kết hợp chất điều tiết sinh trưởng:1,5mg/l 2,4D + 1,0mg/l BAP + (0,1- 0,5mg/l) IAA có ảnh hưỏng tới hiệu nuôi cấy bao phấn ớt, nồng độ 0,2mg/l IAA tỷ lệ callus đạt 51,2% Ngược lại, kết hợp 1,5mg/l 2,4D + 1,0mg/l BAP + (0,1 -0,5mg/l) αNAA khơng khơng có tác dụng đến hiệu tạo callus mà tăng nồng độ αNAA tỷ lệ tạo callus cịn giảm xuống Trên sở kết thu được, đề xuất quy trình tạo callus từ ni cấy bao phấn ớt phù hợp với điều kiện phịng thí nghiệm Viện nghiên cứu Rau sau: Quy trình tạo callus từ nuoi cay bao phấn ớt Bao phấn ớt (hạt phấn dang ỏ thời kỳ đơn nhân muộn) X lý mu 4OC 24 h Nuôi m«i tr-êng MS Ni điều kiện 16/24 sáng 25OC) Nuôi môi trƣờng tạo callus MS + 1,0mg/l BAP + mg/l IAA + 30g/l Sacarose 44 II ĐỀ NGHỊ Cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm để kết luận đưa có độ xác cao đưa vào ứng dụng thực tiễn Tiếp tục nghiên cứu thêm số yếu tố ảnh hưởng khác đến khả tạo callus từ nuôi cấy bao phấn ớt như: kiểu gen cho bao phấn, giai đoạn phát triển hạt phấn… nhằm tăng hiệu tạo callus Tiến hành nghiên cứu tiếp ảnh hưởng yếu tố đến khả tái sinh từ nuôi cấy bao phấn TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Lý Anh (2003) Bài giảng Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông Nghiệp I – Hà Nội Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997, CNSH thực vật cải tiến giống trồng Giáo trình cao học nơng nghiệp, Viện KHKTNNVN, NXBNN – HN Nguyễn Hữu Đống (2000), “ Công nghệ tế bào - ứng dụng quan trọng nghành CNSHNN Thông tin vấn đề sinh học ngày nay, tập 6, tr 54-55 Nguyễn Mạnh Đôn, Huỳnh Yên Nghĩa (2000) “ Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn chọn tạo giống lúa” Tạp chí khoa học – công nghệ quản lý kinh tế, tháng 4, tr 149 - 150 Nguyễn Văn Đồng, Vũ Đức Giang (1996) Nghiên cứu tối ưu hố mơi trường nuôi cấy bao phấn lúa Kết nghiên cứu khoa học 1986 – 1996 Viện DTNN, NXBNN – HN 45 Nguyễn Tấn Hinh, Nguyễn Thị Ngát (2002) “ Ứng dụng nuôi cấy bao phẩn chọn tạo giống lúa đặc sản giống lúa thâm canh có hàm lượng protêin cao gạo”, Tạp chí KH CN Nguyễn Thị Thanh Huyền (2002) Ảnh hưởng cuả yếu tố môi trường nuôi cấy đến tỷ lệ tạo mô sẹo tái sinh số nguồn gen lúa khác Luận văn thạc sĩ Khoa Học Nông Nghiệp Nguyễn Thị Thanh Huyền, Huỳnh Yên Nghĩa (2002) “Tìm hiểu mơi trường ni cấy bao phấn chọn tạo giống lúa” Tạp chí KHNN, tr 5760 Nguyễn Thị Lang (2002) Phương pháp nghiên cứu CNSH, NXBNN – TP Hồ Chí Minh 10 Phạm Ngọc Lương, Trần Duy Quý, Nguyễn Văn Đống, Vũ Đức Quang cộng (1999) Áp dụng phương pháp nuôi cấy bao phấn phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa Kết nghiên cứu khoa học, Viện Di truyền nông nghiệp, NXBNN – Hà Nội 12 Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh (1997) CNSH thực vật, trưòng Đại học NN I – HN 13 Nguyễn Đức Thành (2000) Nuôi cấy mô tế bào thực vật – Nghiên cứu ứng dụng, NXBNN – HN, tr28 -29,tr 55- 60, tr 133 – 135 14 Phan Hữu Tôn (2001) CNSH chọn tạo nhân giống trồng Giáo trình giảng cho sinh viên chuyên nghành giống cao học Trường Đại học NN I – HN 15 Phan Hữu Tôn (2004).” Ảnh hưởng số yếu tố môi trường nuôi cấy đến kết tái sinh callus ni cấy bao phấn lúa” Tạp chí Nơng nghiệp Phát triển Nông Thôn 16 Vũ Thị Thuỷ, Hoàng Tuyết Minh, Nghiêm Thị Nhạn, Trần Duy Quý, Nguyễn Thuý Mạnh, Lê Duy Hưng cs Nghiên cứu nuôi cấy bao phấn số lai số tổ hợp lúa lai dòng số dòng triển vọng Kết nghiên cứu khoa học 2000 – 2001 Viện KHKT, NXBNN – HN 46 17 Võ Thị Minh Tuyển (2002) Bước đầu sử dụng kỹ thuật nuôi cấy bao phấn để chọn tạo dòng TGMS phục vụ cho phát triển lúa lai dòng Việt Nam Luận văn thạc sĩ KHNN 18 Nguyễn Văn Uyển (1984) Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác chọn giống trồng NXBTPHCM, tr 28 -57 19 Đỗ Năng Vịnh (2002) CNSH trồng NXBNN – HN B TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI Sanda M Reed Production of haploid tobaco plant using anther culture N.A Zagorska, A Shteera, BD.Dimitrov, 1998 Induced androgenesis in tomato Mozartda Silva Lauen; Eliane Kaltchuck – Santos,2003 Association between floral bud size and development stage in soybean microspore Bajaj, Y.P.S, 1993 – Invitro production of haploids Brasileiro, Anachoristina R., Willadilo.Lilia,Guena; Marceloetal Alther development stage and gamma rediatiol effect on tomato culture derived callus formation Zapata J F, Khush S.G, Crill J.P, Tonizo B.L.Rice Anther at IRRI “Cell ald tiffue culture techniques for Cereal Crop Improvemen” Science Press, Beijng Chine Sugimoto, Miyake.H, Takeoka.Y, 2000 “Genetic divesity of regenation ability in anther cuture or rice” Ying C,1983,” Anther and pollel culture of rice in China” Cell and tissue culture techniques for Cereal Crop Improvement, Syence Prre, Bejjing China Tang.K, Sun X, He Y, and Zhang Z, 1998,” Anther culture refponse of wild Oryza species” Plant Breeding 10 Guzman M, Arias Z J I, 2000.”Increasing anther culture efficiency in rice (Oryzastival) using anther prom rationed plant” Plant Science 47 Huyo, S G.(1992), “Study on the breeding of (Red pepper 8) 11 desistance to the phytophthora blight” Acta of Academy of Agricultural – Sciences (Korea Demoncratic peoples republic), No.I.Jan, 1992 Muthukrishman.C.R, T.Thangara and R Chatterrjee, 1986 “ Chili and 12 Capsicum” Vegetable crop in India; T.K.Bose & M.G.Sorn Phblisnhed B.Mitra NAYA Prokash 200006 Bidhan Sarani Calcuta 70006 India Staub J E and V.Ivandie “ Genetic Assessment of the United States 13 National Cucumber Couection”, ISHS Acta Horticulturae 510.VII.Eucarpia Meeting on Cucumbit Genetic and Breeding 14 Qiyong.Z, H.Tao, L.Yier, C.Qinghua, X.Shuanda, Z.Tiansheng, “Creation and Utilization of Breeding parents of Cucumber”, ISHS Acta Horticulture 402 International Symposium on Cultival Improvement of Horlicultural Crops Part I PHỤ BIỂU PHỤ BIỂU 1: MÔI TRƢỜNG TẠO CALLUS (mg/l) STT Thành phần Murashige&Skoog Chu Gamborg môi trƣờng (MS) (N6) (B5) KNO3 1900 2830 2500 (NH4)NO3 1650 _ 134,0 (NH4)2SO4.H20 _ 463 _ MgSO4.7H2O 370 185 250 KH2PO4 170 400 _ CaCl2.2H2O 440 166 150 FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 KI 0,83 0,8 0,75 10 H3BO3 6,2 1,6 3,0 48 11 MnSO4 16,9 3,33 10,0 12 ZnSO4.7H2O 8,6 1,5 2,0 13 Na2MoO4.2H2O 0.25 3,33 0,25 14 CuSO4.5H2O 0,025 _ 0,025 15 CoCl2.6H2O 0,025 0,0125 0,025 16 Thiamin HCL 0,1 1,0 10,0 17 Nicotinic acid 0,5 0,5 1,0 18 Pyridoxine HCL 0,5 0,5 1,0 19 Glycine 2,0 2,0 2,0 20 Myo - inositol 100 100 100 21 Saccarose 30000 30000 30000 22 Agar 8000 8000 8000 49 ... DUNG NGHIÊN CỨU - Ảnh hưởng ngưỡng nhiệt độ thời gian xử l? ? l? ??nh đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt - Ảnh hưởng môi trường dinh dưỡng đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt - Ảnh hưởng. .. callus từ bao phấn ớt - Ảnh hưởng tổ hợp BAP + αNAA môi trường nuôi cấy đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt - Ảnh hưởng tổ hợp BAP+ IAA môi trường nuôi cấy đến khả phát sinh callus từ bao phấn. .. đường đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt - Ảnh hưởng nồng độ BAP môi trường nuôi cấy đến khả phát sinh callus từ bao phấn ớt - Ảnh hưởng nồng độ kinetin môi trường nuôi cấy đến khả phát sinh