LỜI CẢM ƠN Đề tài đƣợc hoàn thành Trung tâm Giống & Công nghệ sinh học Trƣờng Đại học Lâm nghiệp, khn khổ chƣơng trình đào tạo kỹ sƣ chun ngành Cơng nghệ sinh học, khố học 2007 – 2011 Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Có đƣợc kết này, trƣớc hết xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo toàn thể cán bộ, viên chức trƣờng Đại học Lâm nghiệp khoa Lâm học tạo điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành tốt nhiệm vụ học tập Xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo trực tiếp giảng dạy tơi tồn khố học Đặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Vũ Thị Huệ tận tâm hƣớng dẫn, bảo truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình thực đề tài Nhân dịp này, xin bày tỏ lòng cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình, tận tụy Ban Giám đốc tồn thể cán - viên chức Trung tâm Giống Công nghệ sinh học, đặc biệt ThS Hồ Văn Giảng, tạo điều kiện đóng góp nhiều ý kiến q báu cho khóa luận tơi đƣợc hồn thiện Cuối tơi xin đƣợc cảm ơn bạn bè ngƣời thân gia đình động viên tạo điều kiện thuận lợi để học tập, nghiên cứu khoa học hoàn thiện khóa luận Hà Nội, ngày 16 tháng 05 năm 2011 Sinh viên Nguyễn Ngọc Tuấn MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan nhân giống in vitro 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Sơ lược lịch sử phát triển 1.1.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.1.4 Các điều kiện nuôi cấy 1.1.5 Môi trường nuôi cấy 10 1.1.6 Các giai đoạn nhân giống in vitro 18 1.1.7 Ý nghĩa kỹ thuật nhân giống in vitro 19 1.2 Giới thiệu Lan 20 1.2.1 Khái quát họ Lan 20 1.2.2 Đặc điểm sinh học họ Lan 21 1.2.3 Lịch sử nghiên cứu thành tựu nhân giống Lan kỹ thuật nuôi cấy in vitro 23 1.3 Giới thiệu Lan Dáng hƣơng thơm 26 PHẦN MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Mục tiêu nghiên cứu 29 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 29 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Ảnh hƣởng thời gian khử trùng đến khả tạo mẫu 35 3.2 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả tạo thể chồi chồi 37 3.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tạo thể chồi chồi mẫu cấy 46 3.4 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh thể chồi chồi 48 PHẦN KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 52 4.1 Kết luận 52 4.2 Tồn 52 4.3 Kiến nghị 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC PHỤ BIỂU DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Các chữ viết tắt Giải thích 2,4-D 2,4-dichlorophenoxy acetic acid AC Than hoạt tính (Activated charcoal) ADN Acid desoxyribonucleic BAP Benzyl amino purine CTTN Cơng thức thí nghiệm CT Công thức ĐC Đối chứng GA3 Gibberellic acid IAA Indole acetic acid IBA Indole butyric acid KT Khử trùng NAA α-Naphthalene acetic acid TB Trung bình TDZ Thidiazuron TN Thí nghiệm ĐẶT VẤN ĐỀ Nhân giống bảo quản giống trồng có giá trị kinh tế việc làm cần thiết để phát triển nông nghiệp Để phục vụ cho công tác nhân giống, trƣớc phƣơng pháp truyền thống thƣờng đƣợc sử dụng nhƣ: tách, chiết, giâm cành,… cho hệ số nhân thấp giống dễ bị thối hóa qua số hệ Hiện kỹ thuật nhân giống in vitro đƣợc đƣa vào áp dụng thực tiễn sản xuất thành công nhiều loại khác Ƣu điểm kỹ thuật cho đồng kiểu hình, tính di truyền ổn định, tạo bệnh, cho hệ số nhân lớn thời gian ngắn mà không phụ thuộc vào thời tiết năm, giúp thu hoạch đồng loạt Phƣơng pháp nhân giống in vitro mở hƣớng phát triển ngành nông nghiệp, thúc đẩy tăng sản lƣợng, chất lƣợng giống tốt, đảm bảo nhu cầu ngƣời sản xuất tiêu dùng [11] Từ xƣa tới nay, Lan đƣợc biết đến nhƣ loài hoa quý phái, hoa bậc vua chúa vƣơng giả Lan Việt Nam đẹp cao, lại chứa đựng nhiều ý nghĩa Cùng với phát triển ngành trồng Lan thời gian qua, loài hoa quý khơng làm đẹp hình ảnh Việt Nam mắt du khách đến với đất nƣớc xứ sở nhiệt đới mà mang lại hiệu kinh tế cao Theo thống kê Sở Nông nghiệp Phát triển nơng thơn thành phố Hồ Chí Minh, tính riêng thành phố Hồ Chí Minh, năm 2003 doanh thu từ kinh doanh hoa lan đạt 200 – 300 tỷ đồng, đến năm 2005 tăng đến 600 – 700 tỷ đồng, quý I năm 2006 số đạt mức 400 tỷ đồng Ngoài ra, sở kinh doanh hoa Lan tăng từ 264 sở (năm 2003) lên 1.000 sở, với lƣợng Phong lan tiêu thụ trung bình năm lên tới hàng triệu Riêng Phong lan năm thành phố tiêu thụ triệu [19] Một số giống hoa trồng đƣợc điều kiện khí hậu cận nhiệt đới nƣớc ta là: Dendrobium, Cattleya, Phalaenopsis, Oncidium, Vanda, Aerides,… Trong chi Lan Việt Nam, chi Lan Dáng hƣơng gồm lồi hoa có hình dáng màu sắc đẹp, thƣờng có hƣơng thơm, chi Lan đặc trƣng vùng Đông Nam Á Trong Lan Dáng hƣơng thơm (Aerides odorata Lour.) đƣợc giới chơi Lan đặc biệt ƣa chuộng vẻ đẹp hoàn mỹ chùm hoa sang trọng với hƣơng thơm dịu dàng Tuy nhiên, phát triển vƣờn sản xuất Lan Dáng hƣơng nói chung Lan Dáng hƣơng thơm nói riêng cịn quy mơ nhỏ, khơng đủ cung ứng cho thị trƣờng nội địa Nguyên nhân hệ số nhân giống phƣơng pháp cổ điển cịn thấp, lại có khả lây truyền bệnh cao Hạt Lan nhỏ, không chứa nội nhũ có phơi chƣa phân hóa nên có tỉ lệ nảy mầm tự nhiên thấp Trong đó, thị trƣờng hoa địi hỏi chặt chẽ đồng kích thƣớc phải bệnh [11] Trƣớc thực tế đó, việc ứng dụng phƣơng pháp nhân giống in vitro vào sản xuất hàng loạt giống Lan Dáng hƣơng thơm điều cần thiết, để lồi Lan cạnh tranh với lồi hoa khác thị trƣờng nƣớc, khu vực giới Chính vậy, chúng tơi tiến hành thực đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Dáng hƣơng thơm (Aerides odorata Lour.) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO 1.1.1 Khái niệm Nhân giống in vitro thuật ngữ mơ tả q trình sản xuất hàng loạt cách nuôi cấy phận thực vật ống nghiệm có chứa mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp, điều kiện vơ trùng đƣợc kiểm soát 1.1.2 Sơ lược lịch sử phát triển Nhân giống in vitro đƣợc khởi xƣớng vào cuối kỷ XIX, trải qua 100 năm phát triển Q trình phát triển khái quát qua giai đoạn sau: * Giai đoạn 1(1898 – 1930) Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực vật học ngƣời Đức đặt móng cho ni cấy mơ – tế bào thực vật Ơng đƣa giả thuyết tính tồn tế bào sách “Thực nghiệm nuôi cấy tế bào tách rời” Đây tảng lý thuyết nuôi cấy mô – tế bào sau Tuy nhiên, thí nghiệm Haberlandt với tế bào mơ mềm, biểu bì bị thất bại chúng phân chia đƣợc Nhƣng sau Garrison (1904 – 1907) ni thành cơng tế bào thần kinh ếch huyết tƣơng Trên sở đó, nhà khoa học thực vật tiến hành nuôi tế bào môi trƣờng dinh dƣỡng tự nhiên chiết từ thực vật, nhƣng không thành công Sau thời gian dài nhà nghiên cứu tập trung vào nghiên cứu môi trƣờng nuôi cấy tự nhiên tổng hợp [17] Năm 1922, Kotte học trò Haberlandt với Robbins lặp lại thí nghiệm Haberlandt với đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ ngô Hai tác giả nuôi đƣợc đỉnh sinh trƣởng thời gian ngắn (12 ngày) mơi trƣờng lỏng có chứa đƣờng glucose muối khống, thu đƣợc hệ rễ nhỏ Từ đầu rễ đƣợc ni hồn thiện mơi trƣờng ni cấy [17] * Giai đoạn (1930 – 1950): Giai đoạn đƣợc đánh dấu thành công White (1934) trì đƣợc sinh trƣởng đầu rễ cà chua thời gian dài mơi trƣờng lỏng có chứa đƣờng, số muối khống dịch chiết nấm men Theo hƣớng khác, Gautherets thành công nuôi cấy mô tƣợng tầng gỗ tìm mơi trƣờng thích hợp [17] Cũng giai đoạn này, vai trò thúc đẩy sinh trƣởng ni cấy hàng loạt vitamin nhóm B đƣợc phát nhƣ: thiamin (vitamin B1), pyridoxine (vitamin B6), nicotinic (vitamin B3),… Ni cấy mơ thực vật có nhiều thuận lợi Went Thimann tìm chất kích thích sinh trƣởng đầu tiên, sau xác định indole axetic axit (IAA) đƣợc Kogl tách chiết thành công [17] Trong thời gian 1941 – 1952, nhiều chất kích thích sinh trƣởng thuộc nhóm Auxin đƣợc tổng hợp thành công ứng dụng vào nuôi cấy mô – tế bào thực vật: Napthalen axetic axit (NAA), axit 2,4-dichlorophenoxy axetic (2,4D),… Nhiều nhà nghiên cứu nhận thấy với nƣớc dừa, NAA 2,4D giúp tạo mô sẹo thành công nhiều đối tƣợng mà trƣớc khó ni cấy [17] Năm 1954, Skoog phát chế phẩm thủy phân tinh dịch cá bẹ kích thích sinh trƣởng rõ rệt ni cấy mảnh mơ thân thuốc Một năm sau, chất đƣợc tổng hợp thành công đƣợc Skoog gọi Kinetin có tác dụng kích thích phân bào [16] Việc phát NAA, 2,4D, Kinetin với loại vitamin nƣớc dừa bƣớc tiến có ý nghĩa giai đoạn thứ hai nuôi cấy mô tế bào thực vật * Giai đoạn (1957 – 1960): Skoog Miller (1957) chứng minh biệt hóa rễ, chồi nghiên cứu ni cấy mô tủy thuốc phụ thuộc vào nồng độ tƣơng đối Auxin/Cytokinin từ đƣa quan niệm điều khiển hormone trình hình thành quan thực vật Thành công Skoog Miller dẫn đến nhiều phát quan trọng mở đầu cho giai đoạn thứ ba nuôi cấy mô – tế bào thực vật [16] Trong khoảng thời gian từ 1954 – 1959, kỹ thuật nuôi cấy tế bào đơn đƣợc phát triển hoàn thiện dần Melcher Beckman ni cấy tế bào đơn bình dung tích lớn có sục khí bổ sung chất dinh dƣỡng định kỳ Khả nuôi cấy tế bào thực vật tái tạo đƣợc hoàn chỉnh từ tế bào mở triển vọng cho chọn dòng đột biến, sản xuất chất trao đổi thứ cấp * Giai đoạn (từ 1960 đến nay): Đây giai đoạn ứng dụng công nghệ nuôi cấy mô – tế bào thực vật vào công tác giống nghiên cứu di truyền Các thành tựu bật giai đoạn gồm: Năm 1960, nhờ nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Morel tạo đƣợc protocorm từ Địa lan Khi để điều kiện định, protocorm phát triển thành Lan bệnh Cũng năm đó, Coocking trƣờng Đại học tổng hợp Nottingham thu đƣợc tế bào trần (protoplast) nhờ xử lý với enzyme cellulase [17] Năm 1966, Guha cộng tạo đƣợc đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cà độc dƣợc Sau Bourin Nitsch (1967) thành cơng với cấy thuốc Việc tạo đơn bội thành công nhiều lồi thực vật thơng qua ni cấy bao phấn hạt phấn đóng góp lớn cho nghiên cứu di truyền lai tạo giống Từ năm 1970 trở đi, nhà khoa học ý vào triển vọng kỹ thuật nuôi cấy protoplast, hai tác giả ngƣời Nhật Bản Nagata Takebe thành công việc làm cho protoplast thuốc tái tạo đƣợc cellulose Melchers cộng (1978) lai thành công protoplast cà chua với protoplast khoai tây, mở triển vọng lai xa thực vật Ngoài ra, điều kiện định, protoplast có khả hấp thụ phân tử lớn, quan tử từ bên ngồi, chúng đối tƣợng lý tƣởng cho nghiên cứu di truyền thực vật [17] Ngày nay, nuôi cấy mô – tế bào thực vật đƣợc ứng dụng rộng rãi nhân giống nhiều lồi thực vật, chọn dịng chống chịu, lai xa, chuyển gen vào trồng 1.1.3 Cơ sở khoa học nuôi cấy mô – tế bào thực vật 1.1.3.1 Tính tồn tế bào Haberlandt 1902, lần quan niệm tế bào thể sinh vật đa bào có khả tiềm tàng để phát triển thành cá thể hoàn chỉnh Theo quan niệm sinh học đại tế bào riêng rẽ biệt hố mang tồn lƣợng thơng tin di truyền cần thiết đủ thể sinh vật Khi gặp điều kiện thích hợp tế bào phát triển thành cá thể hồn chỉnh, tính tồn tế bào Tính tồn tế bào mà Haberlandt nêu sở lý luận phƣơng pháp ni cấy mô – tế bào thực vật Cho đến ngƣời hoàn toàn chứng minh đƣợc khả tái sinh thể thực vật hoàn chỉnh từ tế bào riêng biệt [1, 13, 17] 1.1.3.2 Sự biệt hóa phản biệt hóa tế bào Cơ thể thực vật trƣởng thành thể thống bao gồm nhiều quan chức khác nhau, đƣợc hình thành từ nhiều loại tế bào khác Tuy nhiên tất loại tế bào bắt nguồn từ tế bào (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử phân chia liên tục hình thành nên tế bào phơi sinh Sau từ tế bào phơi sinh chúng tiếp tục phân chia biến đổi thành tế bào chun hố đặc hiệu cho mơ, quan có chức khác Sự biệt hóa tế bào chuyển tế bào phôi sinh thành tế bào chuyên hóa, đảm nhận chức khác Tuy nhiên tế bào biệt hoá thành tế bào có chức chuyên biệt, chúng khơng hồn tồn khả biến đổi Trong trƣờng màu vàng chanh) Chứng tỏ hạt Lan dần đƣợc lục hóa, bắt đầu có quang hợp Hệ số nhân thể chồi cao công thức K3 (0,3mg/l BAP + 0,1mg/l NAA + 0,1mg/l IAA) đạt 3,89 lần, song chất lƣợng thể chồi có xu hƣớng giảm (thể chồi có màu vàng nhạt, xốp) Nhƣ vậy, từ kết nghiên cứu thấy mơi trƣờng có bổ sung 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA + 0,1mg/l IAA kích thích hạt Lan phân hóa tạo thể chồi tốt, thể chồi có kích thƣớc lớn, phát triển bình thƣờng Hình 3.3: Thể chồi môi trƣờng K2 3.2.2 Ảnh hưởng phối hợp Kinetin, IAA NAA đến khả tạo thể chồi Trong thí nghiệm này, chúng tơi tiến hành cấy chuyển thể chồi vào mơi trƣờng Knops có bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng (Kinetin, IAA NAA) để nghiên cứu ảnh hƣởng chúng đến khả tạo thể chồi Sau – tuần theo dõi, kết đƣợc tổng hợp phụ biểu 03 Từ phụ biểu 03 có bảng số liệu 3.3: 40 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng phối hợp Kinetin, IAA NAA đến khả tạo thể chồi Chất điều hòa sinh trƣởng (mg/l) CTTN Hệ số nhân Chất lƣợng Kinetin IAA NAA thể chồi (lần) thể chồi ĐC - - - 1,11 + K4 0,1 2,44 ++ K5 0,2 3,44 ++ K6 0,3 3,67 +++ 0,1 0,1 Ghi chú: (+): Chất lƣợng thể chồi kém: thể chồi có kích thƣớc nhỏ, màu vàng nhạt (++): Chất lƣợng thể chồi trung bình: có kích thƣớc trung bình, màu vàng chanh (+++): Chất lƣợng thể chồi tốt: thể chồi có kích thƣớc lớn, màu xanh nhạt Kết bảng 3.3 đƣợc minh họa biểu đồ: (Lần) ĐC K4 K5 K6 Hình 3.4: Ảnh hƣởng phối hợp Kinetin, IAA NAA đến khả tạo thể chồi Tiến hành phân tích phƣơng sai nhân tố cho kết quả: Ftính = 29,22 > F0,05 = 4,07, nghĩa mơi trƣờng ni cấy khác có ảnh hƣởng khác rõ rệt đến khả tạo thể chồi đối tƣợng Lan Dáng hƣơng thơm Cụ thể mơi trƣờng ni cấy có bổ sung Kinetin, IAA NAA 41 nồng độ khác có khả kích thích khác rõ rệt đến phân hóa tạo thể chồi Từ kết bảng 3.3 hình 3.4 cho thấy: Tất mơi trƣờng ni cấy có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng cho hệ số nhân thể chồi cao so với mơi trƣờng khơng bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng Ở công thức đối chứng (không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng), hệ số nhân thể chồi thấp (chỉ đạt 1,11 lần), chất lƣợng thể chồi (thể chồi có màu vàng, kích thƣớc thể chồi nhỏ) Ở công thức K4 (bổ sung 0,1mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA + 0,1mg/l IAA) hệ số nhân thể chồi đạt 2,44 lần, chất lƣợng thể chồi trung bình (kích thƣớc to dần, có màu vàng chanh) Hệ số nhân thể chồi chất lƣợng thể chồi cao có đƣợc công thức K6 (bổ sung 0,3mg/l Kinetin + 0,1mg/l NAA + 0,1mg/l IAA) Hệ số nhân đạt 3,67 lần, thể chồi phát triển nhanh, kích thƣớc to, mập, số thể chồi bắt đầu xuất mầm nhỏ Nhìn chung, hai thí nghiệm thấy mơi trƣờng có thành phần Kinetin khối thể chồi có biến đổi tƣơng đối nhanh màu sắc: Từ màu vàng nhạt chuyển sang màu vàng chanh, thành màu xanh nhạt Điều có đƣợc Kinetin chất điều hòa sinh trƣởng thuộc nhóm Cytokinin Nhóm có ảnh hƣởng rõ rệt đặc trƣng lên phân hóa quan thực vật, đặc biệt phân hóa chồi [15] Chính mà bổ sung Kinetin vào mơi trƣờng có phối hợp với 0,1mg/l NAA 0,1mg/l IAA chất lƣợng thể chồi tốt hẳn, có màu xanh, to, mập 42 Nhƣ vậy, mơi trƣờng có khả tạo thể chồi tốt môi trƣờng bổ sung 0,3mg/l Kinetin + 0,1mg/l IAA + 0,1mg/l NAA Hình 3.5: Thể chồi Hình 3.6: Thể chồi mơi trƣờng K6 môi trƣờng K5 3.2.3 Ảnh hưởng phối hợp Kinetin, BAP NAA đến khả tạo thể chồi Kế thừa kết nghiên cứu cho thấy Kinetin BAP có tác dụng phân hóa tạo thể chồi tốt Vì vậy, thí nghiệm tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng phối hợp Kinetin, BAP NAA đến khả tạo thể chồi Sau tuần theo dõi, kết đƣợc tổng hợp phụ biểu 04 Từ phụ biểu có bảng số liệu sau: Bảng 3.4: Ảnh hƣởng phối hợp Kinetin, BAP NAA đến khả tạo thể chồi Chất điều hòa sinh trƣởng (mg/l) CTTN Kinetin BAP NAA ĐC - - - K7 0,1 K8 0,2 K9 0,3 0,2 0,1 43 Hệ số nhân thể chồi (lần) Chất lƣợng thể chồi 1,11 + 4,00 +++ 4,11 +++ 4,67 +++ Ghi chú: (+): Chất lƣợng thể chồi kém: thể chồi có kích thƣớc nhỏ, màu vàng nhạt (++): Chất lƣợng thể chồi trung bình: có kích thƣớc trung bình, màu vàng xanh (+++): Chất lƣợng thể chồi tốt: thể chồi có kích thƣớc to, màu xanh Từ kết bảng 3.4, vẽ đƣợc biểu đồ: (Lần) ĐC K7 K8 K9 Hình 3.7: Ảnh hƣởng phối hợp Kinetin, BAP NAA đến khả tạo thể chồi Kết phân tích phƣơng sai nhân tố cho thấy: Ftính = 41,50 > F0,05 = 4,07, nghĩa môi trƣờng nuôi cấy khác có ảnh hƣởng khác rõ rệt đến khả tạo thể chồi đối tƣợng nghiên cứu Cụ thể mơi trƣờng ni cấy có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng nồng độ khác có khả kích thích khác rõ rệt đến phân hóa tạo thể chồi Từ kết bảng 3.4 hình 3.7 cho thấy: Sử dụng phối hợp Kinetin, BAP NAA có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả tạo thể chồi nhƣ chất lƣợng thể chồi hình thành mơi trƣờng ni cấy Thể hệ số nhân thể chồi cao so với mơi trƣờng khơng bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng 44 Ở công thức đối chứng (không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng), hệ số nhân thể chồi đạt 1,22 lần, chất lƣợng thể chồi (thể chồi có màu vàng nhạt, phát triển chậm, kích thƣớc thể chồi nhỏ) Công thức K7 (0,1mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA) cho hệ số nhân thể chồi tăng (đạt 4,00 lần), chất lƣợng thể chồi đạt mức (thể chồi có màu vàng xanh, tốc độ phân hóa thể chồi tốt) Cơng thức K8 tăng hàm lƣợng Kinetin lên 0,2mg/l so với công thức K7 thấy tốc độ phân hóa tạo thể chồi tăng (4,11 lần), chất lƣợng thể chồi tốt Hệ số nhân thể chồi cao có đƣợc cơng thức K9 (0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA) đạt 4,67 lần, chất lƣợng thể chồi tốt (thể chồi sinh trƣởng khỏe, mập, thể chồi có màu xanh) Nhƣ vậy, mơi trƣờng có bổ sung 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA mơi trƣờng thích hợp cho khả tạo thể chồi loài Lan Dáng hƣơng thơm Hình 3.8: Thể chồi Hình 3.9: Thể chồi môi trƣờng K8 môi trƣờng K9 45 3.3 Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tạo thể chồi chồi mẫu cấy Việc tạo đƣợc thể chồi chồi Lan Dáng hƣơng thơm điều kiện in vitro dấu hiệu định thành công kỹ thuật nuôi cấy Các thể chồi chồi hình thành giai đoạn nguồn nguyên liệu cho giai đoạn sau Thể chồi chồi đƣợc tạo không phụ thuộc vào thời điểm thu hái (độ chín quả), lồi mà cịn phụ thuộc vào mơi trƣờng ni cấy Các hạt Lan đƣợc tách rời khỏi nuôi bình, ống nghiệm, chúng khơng có khả tự dƣỡng đƣợc, chúng không đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng đầy đủ chết Vì để phơi hạt Lan tồn tại, phân hoá tiếp tục phát triển điều kiện in vitro, phôi hạt cần đƣợc cung cấp chất dinh dƣỡng Trong thí nghiệm này, chúng tơi tập trung nghiên cứu ảnh hƣởng hai loại môi trƣờng dinh dƣỡng bản, mơi trƣờng Knops môi trƣờng Vacine and Went (1949) đến khả tạo thể chồi chồi Theo kết số nghiên cứu hai loại mơi trƣờng thích hợp cho ni cấy mơ Phong lan [3], [8] Hai loại môi trƣờng đƣợc bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng thích hợp (0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA) + 100g/l dịch chiết khoai tây + 100ml/l nƣớc dừa + 30g/l saccharose Sau – tuần theo dõi, kết đƣợc tổng hợp phụ biểu 05 Từ phụ biểu 05 có bảng số liệu 3.5: Bảng 3.5: Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tạo thể chồi chồi Hệ số nhân thể chồi Chất lƣợng thể chồi chồi (lần) chồi Knops 4,67 Tốt Vacine and Went 5,33 Tốt Loại môi trƣờng 46 Từ kết bảng 3.5, vẽ đƣợc biểu đồ: (Lần) 5,4 5,2 4,8 4,6 4,4 4,2 Knops Vacine and Went Hình 3.10: Ảnh hƣởng môi trƣờng dinh dƣỡng đến khả tạo thể chồi chồi Theo kết bảng 3.5 hình 3.10 cho thấy hai mơi trƣờng ni cấy có ảnh hƣởng khác đến khả tạo thể chồi chồi nhƣ chất lƣợng chúng Mơi trƣờng Knops có hệ số nhân thể chồi đạt 4,89 lần Trong mơi trƣờng Vacine and Went cho hệ số nhân thể chồi cao (đạt 5,33 lần), chất lƣợng thể chồi hai loại môi trƣờng tốt (thể chồi sinh trƣởng mạnh, to, mập, số thể chồi xuất mầm có màu xanh đậm, bắt đầu có biểu xuất rễ nhiều chồi) 47 Nhƣ vậy, mơi trƣờng thích hợp cho tạo thể chồi chồi Lan Dáng hƣơng thơm mơi trƣờng Vacine and Went (1949) Hình 3.11: Chồi mơi trƣờng Hình 3.12: Chồi mơi trƣờng Vacine and Went (1949) Knops 3.4 Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi Giai đoạn nhân nhanh chồi giai đoạn then chốt, định hiệu tốc độ quy trình nhân giống in vitro Vì chúng tơi tiến hành nghiên cứu bổ sung thêm số chất điều hịa sinh trƣởng vào mơi trƣờng để kích thích chồi phân hóa nhiều, nhanh tốt, đồng thời với q trình phân hóa chồi kích thích cho chồi tăng trƣởng chiều cao, lá, rễ Ở giai đoạn lựa chọn đƣợc số lƣợng chồi đáng kể để chuyển sang giai đoạn kích thích tăng trƣởng chồi tạo rễ, nhằm rút ngắn thời gian tạo ống nghiệm Sau tìm đƣợc môi trƣờng Vacine and Went (1949) môi trƣờng phù hợp cho tạo thể chồi chồi, sử dụng môi trƣờng bổ sung thêm số chất điều hịa sinh trƣởng vào để tìm hiểu khả nhân nhanh chồi Lan 3.4.1 Ảnh hưởng phối hợp NAA, Kinetin BAP đến khả nhân nhanh chồi Các chồi đƣợc cấy vào môi trƣờng Vacine and Went (1949) có bổ sung phối hợp NAA, Kinetin BAP hàm lƣợng khác 48 Sau – tuần theo dõi, kết đƣợc tổng hợp phụ biểu 06 Từ phụ biểu ta có bảng số liệu: Bảng 3.6: Ảnh hƣởng phối hợp NAA, Kinetin BAP đến khả nhân nhanh chồi CTTN Chất điều hòa sinh trƣởng (mg/l) Hệ số nhân chồi Chất lƣợng NAA Kinetin BAP (lần) chồi ĐC - - - 1,11 + Y1 0,1 5,00 ++ Y2 0,3 5,27 +++ Y3 0,5 5,03 ++ Y4 0,1 5,40 +++ Y5 0,3 6,00 +++ Y6 0,5 5,60 +++ 0,1 0,2 0,3 Ghi chú: (+): Chất lƣợng chồi kém: chồi có kích thƣớc nhỏ, màu xanh nhạt (++): Chất lƣợng chồi trung bình: có kích thƣớc trung bình, màu xanh (+++): Chất lƣợng chồi tốt: chồi có kích thƣớc lớn, màu xanh đậm Kết bảng 3.6 đƣợc minh họa biểu đồ: 49 (Lần) ĐC Y1 Y2 Y3 Y4 Y5 Y6 Hình 3.13: Ảnh hƣởng phối hợp NAA, Kinetin BAP đến khả nhân nhanh chồi Kết phân tích phƣơng sai hai nhân tố với lần lặp cho thấy: Ftính = 5,54 > F0,05 = 3,89, nghĩa mơi trƣờng ni cấy khác có ảnh hƣởng khác rõ rệt đến khả nhân nhanh chồi đối tƣợng Lan Dáng hƣơng thơm Cụ thể mơi trƣờng ni cấy có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng nồng độ khác có khả kích thích khác rõ rệt đến khả nhân nhanh chồi Từ kết bảng 3.6 hình 3.13, cho thấy: Tất cơng thức thí nghiệm có bổ sung chất điều hịa sinh trƣởng cho hệ số nhân nhanh chồi cao so với đối chứng Ở công thức đối chứng (không bổ sung chất điều hòa sinh trƣởng), hệ số nhân chồi thấp (chỉ đạt 1,67 lần), chất lƣợng chồi (kích thƣớc chồi nhỏ, chồi có màu xanh nhạt) Ở cơng thức Y1, Y2 cho hệ số nhân chồi cao (đạt 5,00 lần 5,27 lần), chất lƣợng chồi tốt (kích thƣớc trung bình, chồi có màu xanh) Cơng thức Y3 (tăng hàm lƣợng NAA lên 0,5mg/l) thấy hệ số nhân, chất lƣợng chồi giảm (rễ phát triển mạnh, mập, phát triển kém, nhỏ) 50 Các công thức Y4, Y5 Y6, tăng hàm lƣợng Kinetin bổ sung vào môi trƣờng thấy hệ số nhân chất lƣợng chồi tăng so với công thức Hệ số nhân chất lƣợng chồi cao công thức Y5 (0,3mg/l NAA + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP) Hệ số nhân đạt 6,00 lần, chồi sinh trƣởng mạnh, mập, rễ phát triển cân đối, có màu xanh đậm Từ kết nghiên cứu trên, nhận thấy giai đoạn nhân nhanh chồi, công thức chồi phát triển rễ nhiều phát triển kém, nhỏ Điều ngƣợc lại với mục đích giai đoạn nhân nhanh, giai đoạn cần kích thích cho chồi phát triển thật nhiều, tăng trƣởng nhanh kích thƣớc lá, chiều cao chồi Vì vậy, công thức cho hệ số nhân nhanh chồi tốt công thức Y5 (0,3mg/l NAA + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP) Hình 3.14: Chồi mơi trƣờng Y5 Hình 3.15: Chồi môi trƣờng Y6 51 PHẦN KẾT LUẬN – TỒN TẠI – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Dựa vào kết thu đƣợc từ thí nghiệm sơ đƣa số kết luận sau: - Dùng cồn 70% phút, HgCl2 0,1% phút để khử trùng Lan Dáng hƣơng thơm cho tỷ lệ mẫu đạt 100%, tỷ lệ mẫu tái sinh chồi đạt 100% - Môi trƣờng thích hợp cho khả tạo thể chồi: Knops + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA + 100ml/l nƣớc dừa + 100g/l dịch chiết khoai tây + 30g/l saccharose + 7g/l agar, cho hệ số nhân thể chồi đạt 4,67 lần - Môi trƣờng Vacine and Went (1949) có bổ sung 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 0,1mg/l NAA + 100ml/l nƣớc dừa + 100g/l dịch chiết khoai tây + 30g/l saccharose + 7g/l agar mơi trƣờng dinh dƣỡng thích hợp để tạo thể chồi chồi cho lồi Lan Dáng hƣơng thơm Ở mơi trƣờng dinh dƣỡng cho hệ số nhân đạt 5,33 lần - Môi trƣờng tốt cho nhân nhanh chồi lồi Lan Dáng hƣơng thơm mơi trƣờng Vacine and Went (1949) có bổ sung 0,3mg/l NAA + 0,3mg/l Kinetin + 0,2mg/l BAP + 100ml/l nƣớc dừa + 100g/l dịch chiết khoai tây + 30g/l saccharose + 7g/l agar, mơi trƣờng có hệ số nhân nhanh chồi đạt 6,00 lần Chồi sinh trƣởng mạnh, mập, rễ phát triển cân đối, có màu xanh đậm 4.2 Tồn Do thời gian có hạn nên đề tài chƣa nghiên cứu đƣợc giai đoạn sau trình nhân giống 4.3 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện kỹ thuật nhân giống Lan Dáng hƣơng thơm phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO A TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Lê Trần Bình; Hồ Hữu Nhị - Lê Thị Muội (1997), Công nghệ sinh học cải thiện giống trồng NXB Nơng nghiệp, Hà Nội Hồng Thị Giang, Nguyễn Quang Thạch, Mạch Hồng Thắm, Đỗ Thị Thu Hà (2010), Nghiên cứu nhân giống in vitro nuôi trồng giống lan hài quý P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) thu thập Việt Nam Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp, số Bùi Thị Thu Hiền (2009), Nghiên cứu số biện pháp kỹ thuật nâng cao suất, chất lượng hoa lan Hoàng thảo lai (Dendrobium hybrid) Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp – Trƣờng Đại học Nơng nghiệp Hà Nội Phạm Hồng Hộ (2003), Cây cỏ Việt nam – Quyển III, NXB Trẻ Trần Hợp (1998), Phong lan Việt Nam, NXB Nông Nghiệp Phan Thúc Huân (2009), Hoa lan – nuôi trồng kinh doanh NXB Phƣơng Đông Vũ Thị Huệ (1999), Nhân giống số loài phong lan địa phương pháp nuôi cấy ống nghiệm Luận văn thạc sĩ – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Mai Thị Hƣơng (2010), Nghiên cứu nhân giống loài lan Hoàng thảo Long tu (Dendrobium primulium Lindl) phương pháp nuôi cấy in vitro Khóa luận tốt nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp Lê Thị Mận (2009), Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus Setaceus Blume) Khóa luận tốt nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp 10 Nguyễn Công Nghiệp (2006), Trồng hoa lan, NXB Trẻ 11 Nguyễn Thị Ngọc (2005), Tìm hiểu ảnh hưởng số yếu tố môi trường lên tạo protocorm sinh trưởng phát triển Vanda in vitro Luận văn tốt nghiệp – Trƣờng ĐH KHTN TP Hồ Chí Minh 53 12 Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Thị Nga, Nguyễn Thị Lý Anh, Vũ Thị Hoài (2004), Nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuôi cấy lát mỏng tế bào nhân nhanh in vitro cho số giống Địa lan có giá trị Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp, số 13 Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi cấy mô tế bào thực vật nghiên cứu ứng dụng NXB Nông nghiệp, Hà Nội 14 Nguyễn Văn Uyển (1998), Nuôi cấy mô thực vật phục vụ công tác giống trồng NXB Nông nghiệp, TP Hồ Chí Minh 15 Đặng Xuân Viên (2006), Nhân nhanh in vitro hoa phong lan Mokara Luận văn tốt nghiệp – Trƣờng ĐH KHTN TP Hồ Chí Minh 16 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2005), Sinh lý học thực vật, NXB Giáo dục, Hà Nội 17 Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2005), Công nghệ sinh học (Tập 2) NXB Giáo Dục B TÀI LIỆU TIẾNG ANH 18 Morel G., Am Orchid Soc Bull., 29: 495-497 Các trang web: 19 http://www.hcmbiotech.com.vn 20 http://www.phonglanviet.com.vn/vn/newsdetails.aspx?id=25 54 ... đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu kỹ thuật nhân giống Lan Dáng hƣơng thơm (Aerides odorata Lour. ) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro” PHẦN TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 TỔNG QUAN VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO... xây dựng kỹ thuật nhân giống loài Lan Dáng hƣơng thơm (Aerides odorata Lour. ) phƣơng pháp nuôi cấy in vitro + Xác định đƣợc thời gian khử trùng tốt cho loại vật liệu lan Dáng hƣơng thơm + Xác... sinh trƣởng đến khả nhân nhanh chồi 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Đối tượng, thời gian địa điểm nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Lan Dáng hƣơng thơm (Aerides odorata Lour. ) đƣợc lấy từ rừng