BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 10-HYDROXY-2-DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài: TS.DS NUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp Hồ Chí Minh, 04/2019 BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG 10-HYDROXY-2-DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Mã số: Chủ nhiệm đề tài NGUYỄN HỮU LẠC THỦY Tp Hồ Chí Minh, 04/2019 DANH SÁCH CÁC THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI TS DS NGUYỄN HỮU LẠC THỦY ThS TRƯƠNG VĂN ĐẠT DS NGUYỄN MINH NGHUYỆT .i MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ SỮA ONG CHÚA 2.2 TỔNG QUAN VỀ ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC 13 MỤC TIÊU – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 3.1 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 4.1 ĐỊNH TÍNH ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG 20 4.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID (E)-10-HYDROXY-2DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO 21 4.3 ỨNG DỤNG 31 4.4 BÀN LUẬN 31 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 .ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh 10-HDA (E)-10-hydroxy-2-decenoic acid As Asymmetry Hệ số bất đối C Concentration Nồng độ dung dịch HPLC High performance liquid chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao k’ Capacity factor Hệ số dung lượng N Theoretical plate Số đĩa lý thuyết PDA Photodiode array Đầu dò dãy diod quang Rs Resolution Độ phân giải RSD Relative Standard Deviation Độ lệch chuẩn tương đối S Area Diện tích pic SOC Royal jelly Sữa ong chúa TB Average Giá trị trung bình tR Retention time Thời gian lưu UV-Vis Ultraviolet - Visible Phổ tử ngoại - khả kiến Tiếng Việt Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Hàm lượng vitamin sữa ong chúa Bảng 2.2 Một số acid béo sữa ong chúa Bảng 2.3 Các acid amin tự sữa ong chúa [1] Bảng 2.4 So sánh thành phần sữa ong chúa tươi dạng đông khô Bảng 2.5 Sản lượng sữa ong chúa giới năm 1984 2012 (ĐV: Tấn) [24] 11 Bảng 2.6.Tình hình tiêu thụ sữa ong chúa từ Đà Lạt năm 2002 - 2003 (ĐV: Tấn) [25] 12 Bảng 4.7 Kết Rf 10-HDA với hệ dung môi 20 Bảng 4.8 Khảo sát thời gian siêu âm mẫu thử 21 Bảng 4.9 Tỷ lệ pha động gồm methanol – dung dịch acid phosphoric pH 21 Bảng 4.10 Tỷ lệ pha động gồm acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH 21 Bảng 4.11 Pha động gồm dung môi hữu – dung dịch acid phosphoric pH 24 Bảng 4.12 So sánh thông số sắc ký với cột C8 C18 25 Bảng 4.13 Kết khảo sát tính phù hợp hệ thống 26 Bảng 4.14 Kết khảo sát khoảng tuyến tính dung dịch đối chiếu 10-HDA 29 Bảng 4.15 Kết khảo sát độ lặp lại 29 Bảng 4.16 Kết khảo sát độ 30 Bảng 4.17 Kết thẩm định quy trình định lượng 30 Bảng 4.18 Kết khảo sát mẫu sữa ong chúa 31 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Sự phát triển ong chúa từ ấu trùng ong nhờ sữa ong chúa Hình 2.2 Một số sản phẩm chứa sữa ong chúa [nguồn internet] 12 Hình 2.3 Cấu trúc hóa học 10-HDA 13 Hình 4.8 Sắc ký lớp mỏng mẫu thử phát đèn UV 254 nm 20 Hình 4.10 Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH (45 : 55) 22 Hình 4.11 Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH (50 : 50) 22 Hình 4.12 Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH (55 : 45) 22 Hình 4.13 Sắc ký đồ pha động methanol – dung dịch acid phosphoric pH (60 : 40) 22 Hình 4.14 Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH (55 : 45) 23 Hình 4.15 Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH (50 : 50) 23 Hình 4.16 Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH (40 : 60) 23 Hình 4.17 Sắc ký đồ pha động acetonitril – dung dịch acid phosphoric pH (30 : 70) 23 Hình 4.18 Sắc ký đồ pha động acetonitril – acid phosphoric pH (30 : 70) 24 Hình 4.19 Sắc ký đồ pha động methanol – acid phosphoric pH (55 : 45) 24 Hình 4.20 Sắc ký đồ mẫu thử với cột C8 25 Hình 4.21 Sắc ký đồ mẫu thử với cột C18 25 Hình 4.22 Độ tinh khiết pic 10-HDA mẫu thử với cột sắc ký C8 25 Hình 4.23 Độ tinh khiết pic 10-HDA mẫu thử với cột sắc ký C18 25 Hình 4.24 Phổ UV - Vis 10-HDA mẫu chuẩn mẫu thử 27 Hình 4.25 Độ tinh khiết pic 10-HDA mẫu thử 27 Hình 4.26 Sắc ký đồ mẫu trắng 28 Hình 4.27 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 10-HDA 28 Hình 4.28 Sắc ký đồ mẫu thử 28 Hình 4.29 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn 28 Hình 4.30 Đồ thị thể mối tương quan diện tích pic nồng độ 29 Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu ĐẶT VẤN ĐỀ Sữa ong chúa (SOC) sử dụng lâu đời nhiều lĩnh vực từ công nghiệp thực phẩm tới công nghiệp mỹ phẩm, dược phẩm ngày mở rộng sản xuất để đáp ứng nhu cầu tăng cao năm gần Sữa ong chúa chứng minh tác động dược lý qua thử nghiệm in vitro, in vivo qua nghiên cứu lâm sàng, bao gồm tác động giãn mạch hạ huyết áp, chống vô sinh, chống ung thư, hạ cholesterol, chống oxy hóa, kháng khuẩn, kháng viêm Ngồi ra, tác động điều hòa miễn dịch, tác dụng tương tự estrogen làm giảm triệu chứng khó chịu phụ nữ thời kỳ tiền mãn kinh mãn kinh, ức chế phá hủy khớp, tác động giống insulin chứng minh [1] Sữa ong chúa chứa lượng protein dồi dào, acid amin tự do, chất béo, vitamin, carbohydrat đặc biệt acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic (10-HDA) có nhiều tác dụng sinh học điều hòa miễn dịch, tăng tổng hợp collagen [2], làm trắng da [3], đồng thời có tác dụng chống ung thư, kháng khuẩn…10-HDA sử dụng marker để đánh giá chất lượng sữa ong chúa chất có SOC khơng có sản phẩm từ ong khác [4] Với giá trị dinh dưỡng cao tác dụng sinh học chứng minh, nhu cầu sử dụng SOC lớn, khai thác tiềm bên cạnh mật ong đem lại nguồn lợi nhuận đáng kể cho người nuôi ong Tuy nhiên, để đảm bảo đầu sản phẩm, việc ban hành tiêu chuẩn kiểm soát chất lượng chặt chẽ để tạo niềm tin nơi người tiêu dùng vô cần thiết mà chất lượng sản phẩm thị trường “vàng thau lẫn lộn” với mức giá dao động từ 90.000 – 300.000 đồng/100 g kèm với thơng tin hàm lượng 10-HDA – chất có giá trị sinh học SOC thay đổi đáng kể theo thời gian gây khơng hoang mang cho người tiêu dùng Các cơng trình nghiên cứu sữa ong chúa giới định lượng 10-HDA phương pháp sắc ký khí [5], điện di mao quản [6] HPLC [7], [8], [9] Ở Việt nam, sản phẩm từ SOC kiểm soát chất lượng theo yêu cầu sản phẩm thực phẩm chức gồm tiêu lý hóa, tiêu vi sinh kim loại nặng, hàm lượng 10-HDA định lượng phương pháp chuẩn độ thể tích (TCVN 5272 – 90), chưa có tiêu chuẩn kiểm nghiệm áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao để đánh giá chất lượng SOC Do đó, với mong muốn góp phần vào cơng tác kiểm sốt chất lượng cho SOC Việt Nam, thực đề tài “Xây dựng thẩm định quy trình định lượng acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao” Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 TỔNG QUAN VỀ SỮA ONG CHÚA 2.1.1 Giới thiệu sữa ong chúa Sữa ong chúa sản phẩm tiết từ hàm ong thợ làm thức ăn để nuôi dưỡng ong phát triển ong chúa Ở nhiệt độ thường sữa ong chúa chất đặc biệt bơ, màu ngà vàng Sữa ong chúa có màu vàng nhạt, dạng kem, có tính acid mùi đặc trưng [4] Hình 2.1 Sự phát triển ong chúa từ ấu trùng ong nhờ sữa ong chúa 2.1.2 Thành phần hóa học sữa ong chúa Thành phần SOC gồm nước (50 – 65 %), protein (11 – 18 %), lipid (4 – %), carbohydrat (10 – 15 %), muối khoáng (khoảng 1,5 %), polyphenol, vitamin VÀ số hợp chất khác Acid béo Không giống acid béo có nguồn gốc từ động vật thực vật chủ yếu acid béo triglycerid có 14 – 20 nguyên tử carbon, acid béo sữa ong chúa có mạch carbon ngắn khoảng – 12 carbon thường acid béo hydroxy, dicarboxylic, monohydroxy acid dẫn chất Lượng acid béo sữa ong chúa thay đổi tùy thuộc vào nguồn gốc mật đặc tính đàn ong [1] Acid béo sữa ong chúa gồm acid (E)-10-hydroxy-2-decenoic (10-HDA) 10-hydroxy decanoic chiếm khoảng 60 – 80 % tổng lượng acid hữu Trong thành phần có giá trị dinh dưỡng cao 10-HDA có sữa ong chúa mà khơng tìm thấy sản phẩm khác từ ong Protein [1] Protein chiếm đến 50 % trọng lượng khơ Các protein sữa ong chúa gồm protein với trọng lượng phân tử từ 49 đến 87 kDa Các protein tồn sữa ong chúa tạo thành nguồn nitơ acid amin thiết yếu cho ấu trùng ong Mục tiêu – Phương pháp nghiên cứu Carbohydrat [1] Các loại đường chứa sữa ong chúa chủ yếu fructose glucose tương đối giống với mật ong, fructose đường phổ biến Các loại đường khác tìm thấy với lượng nhỏ nhiều maltose, trehalose, ribose, erlose, … Sterol 24-methylen cholesterol sterol quan trọng sữa ong chúa Các sterol sữa ong chúa: 24-methylen cholesterol (49 – 58 %), β-sitosterol (19 – 24 %), isofucosterol (9 – 16 %), campesterol (6 – %) [11] Testosteron tồn sữa ong chúa với lượng nhỏ, khoảng 11 – 12 ng/g [12] Khoáng chất Khoáng chất sữa ong chúa chiếm khoảng % tổng lượng tro khoảng – % dạng đơng khơ Các kim loại phát K, Ca, Na, Zn, Fe, Cu Mn, K có nồng độ cao [1] Vitamin Sữa ong chúa giàu vitamin, chủ yếu vitamin tan nước Vitamin C tìm thấy sữa ong chúa, khơng có vitamin A, D, K [1] Thành phần khác Ngoài thành phần chủ yếu trên, sữa ong chúa chứa biopterin, neopterin; acid hữu (acid lactic, glycolic, glyceric, malic); alcol béo (2,3-butanediol, mesoglycerol); aldehyd béo (3-methyl butanal, 2-methyl butanal); lacton (δdecalacton, δ-octalacton); hydrocarbon (n-pentacosan, n-heptacosan); ceton béo (2pentanon, 2-heptanon); vòng thơm (pyrocatechol, hydroquinon, 2-methoxy-p-cresol, methyl salicylat,…) Bảng 2.1 Hàm lượng vitamin sữa ong chúa Vitamin Hàm lượng (μg/g) Thiamin (B1) 1,44 – 6,70 Riboflavin (B2) 5,0 – 25,0 Pyridoxin (B6) 1,0 – 48,0 Niacin (B3) 48,0 – 88,0 Acid pantothenic (B5) Biotin (B7) 159,0 – 265,0 1,1 – 19,8 Acid folic (B9) 0,130 – 0,530 Inositol (B8) 80,0 – 350,0 20 Kết bàn luận KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 ĐỊNH TÍNH ACID (E)-10-HYDROXY-2-DECENOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG Mẫu chuẩn: dung dịch chuẩn 10-HDA nồng độ 40 μg/ml Mẫu thử: sữa ong chúa tươi (T1) mẫu đơng khơ (T2) hịa tan methanol, lọc lấy dịch lọc làm mẫu thử Dung môi: hệ dung môi (1): cloroform – ethyl acetat (1 : 2) hệ dung môi (2): cloroform – methanol (5 : 1) hệ dung môi (3): ethyl acetat – methanol (3 : 1) Hình 4.4 Sắc ký lớp mỏng mẫu thử phát đèn UV 254 nm Kết quả: Bảng 4.7 Kết Rf 10-HDA với hệ dung môi Hệ dung môi (1) (2) (3) Mẫu chuẩn 0,43 0,59 0,65 Mẫu thử (T1) 0,44 0,59 0,65 Mẫu thử (T2) 0,43 0,59 0,65 Nhận xét: hệ dung môi, Rf 10-HDA mẫu chuẩn mẫu thử tương đương chứng tỏ mẫu thử có 10-HDA Khi phun thuốc thử vanilin – acid sulfuric lên mỏng, sấy 105 oC, mẫu thử có vết giá trị Rf màu sắc với vết 10-HDA mẫu chuẩn Kết luận: phương pháp sắc ký lớp mỏng, phát đèn UV 254 nm phun thuốc thử vanilin – acid sulfuric chứng tỏ mẫu sữa ong chúa tươi mẫu đơng khơ có 10-HDA Có thể sử dụng ba hệ dung mơi để định tính phát nhanh 10-HDA sữa ong chúa Kết bàn luận 21 4.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID (E)-10-HYDROXY-2DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - Mẫu thử: cân xác khoảng 180 mg sữa ong chúa vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 10 ml methanol, siêu âm với thời gian khảo sát, thêm methanol vừa đủ đến định mức, lắc Lọc qua màng lọc 0,45 μm - Điều kiện sắc ký dự kiến cho tất khảo sát thời gian siêu âm mẫu thử; khảo sát thành phần, tỷ lệ pH pha động: Cột sắc ký: C18; Nhiệt độ cột: 30 oC Tốc độ dòng: ml/phút 4.2.1 Khảo sát thời gian siêu âm mẫu thử Thay đổi thời gian siêu âm mẫu thử 30; 40 60 phút Tiến hành sắc ký với pha động: methanol – acid phosphoric pH (55 : 45) Bảng 4.8 Khảo sát thời gian siêu âm mẫu thử Thời gian siêu âm tR (phút) S (μV x giây) 30 phút 13,43 1672228 40 phút 13,44 2079050 60 phút 13,47 2099569 Nhận xét: chọn thời gian siêu âm mẫu thử 40 phút H (μV) 52087 64264 63503 4.2.2 Khảo sát thành phần, tỷ lệ pH pha động - Yêu cầu: Độ phân giải: Rs > 1,5; Hệ số đối xứng: 0,8 < As < 1,5 Thời gian lưu: Rt < 30 phút; Hệ số dung lượng: < k’ 1,5) 4,9 6,2 5,5 5,4 5,9 6,0 N ( > 2000) 12945 12770 12965 12853 13096 12982 Đạt Đạt Đạt Nhận xét: giá trị RSD thời gian lưu diện tích pic ≤ 2,0 %, thông số sắc ký đạt yêu cầu Quy trình đạt u cầu tính phù hợp hệ thống 27 Kết bàn luận Độ đặc hiệu Kết khảo sát tính đặc hiệu cho thấy điều kiện phân tích: - Sắc ký đồ mẫu trắng: không xuất pic thời gian lưu tương ứng pic 10HDA sắc ký đồ mẫu đối chiếu - Sắc ký đồ mẫu thử: cho pic 10-HDA có thời gian lưu tương tự với pic 10-HDA sắc ký đồ mẫu đối chiếu (12,3 phút) - Sử dụng chức kiểm tra độ tinh khiết cho thấy pic 10-HDA đạt yêu cầu - Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn: cho pic có thời gian lưu tương tự với pic 10-HDA sắc ký đồ mẫu đối chiếu, diện tích pic tăng lên tương ứng với lượng 10-HDA chuẩn thêm vào - Phổ tử ngoại thời gian lưu pic 10-HDA mẫu thử có hình dạng tương tự với phổ tử ngoại mẫu đối chiếu (bước sóng hấp thu cực đại 212 nm) Như vậy, quy trình đạt yêu cầu độ đặc hiệu Mẫu chuẩn Mẫu thử Hình 4.19 Phổ UV - Vis 10-HDA mẫu chuẩn mẫu thử Hình 4.20 Độ tinh khiết pic 10-HDA mẫu thử 28 Hình 4.21 Sắc ký đồ mẫu trắng Hình 4.22 Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 10-HDA Hình 4.23 Sắc ký đồ mẫu thử Hình 4.24 Sắc ký đồ mẫu thử thêm chuẩn Kết bàn luận Kết bàn luận 29 Tính tuyến tính Bảng 4.14 Kết khảo sát khoảng tuyến tính dung dịch đối chiếu 10-HDA Nồng độ chất chuẩn (μg/ml) 5,0 10,0 20,0 40,0 80,0 160,0 STT Diện tích pic (μV x giây) 296847 633774 1166589 2292590 4694702 9354678 S pic (μVx giây) 10000000 8000000 6000000 4000000 2000000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Nồng độ dung dịch đối chiếu (μg/ml) Hình 4.25 Đồ thị thể mối tương quan diện tích pic nồng độ Phương trình hồi quy tuyến tính: y = 58401x với R2 = 0,9999 Khoảng tuyến tính: 5,0 – 160,0 μg/ml Độ lặp lại Kết khảo sát độ lặp lại trình bày Bảng 4.16 Bảng 4.15 Kết khảo sát độ lặp lại Lượng cân Diện tích pic mẫu thử (g) (μV x giây) 0,1847 2051814 0,1883 2079927 0,1878 2114523 0,1880 2117777 0,1885 2119117 0,1882 2138912 Trung bình % STT Hàm lượng 10-HDA mẫu (%) 0,94 0,93 0,95 0,95 0,95 0,96 0,95 % (RSD 1,04%) Nhận xét: giá trị RSD (%) hàm lượng 10-HDA mẫu ≤ 2,0 % Vậy quy trình định lượng 10-HDA đạt yêu cầu độ lặp lại Kết bàn luận 30 Độ Kết khảo sát trình bày Bảng 4.17; quy trình đạt yêu cầu độ Bảng 4.16 Kết khảo sát độ Chuẩn cho thêm 80% 100% 120% Khối lượng mẫu (g) 0,1880 0,1883 0,1882 0,1882 0,1881 0,1880 0,1881 0,1880 0,1880 Diện tích Nồng độ 10pic sau HDA thêm chuẩn mẫu thử thêm chuẩn (μg/ml) (μV x giây) 3687350 63,14 3683028 63,06 3688392 63,16 4049760 69,34 4045861 69,28 4056092 69,45 4435131 75,94 4444815 76,11 4446327 76,13 Tỷ lệ phục hồi trung bình RSD (%) Nồng độ Nồng độ chuẩn chuẩn tìm thêm vào lại (μg/ml) (μg/ml) 26,85 26,85 26,85 33,56 33,56 33,56 40,28 40,28 40,28 27,12 27,04 27,14 33,32 33,26 33,43 39,92 40,09 40,11 Tỷ lệ phục hồi (%) 100,99 100,72 101,06 99,28 99,08 99,61 99,12 99,53 99,59 99,41 0,26 Bảng 4.17 Kết thẩm định quy trình định lượng Chỉ tiêu Độ đặc hiệu Kết Sắc ký đồ mẫu trắng khơng có tín hiệu pic thời gian lưu mẫu thử chuẩn Phổ UV – Vis mẫu thử mẫu chuẩn có đỉnh hấp thu bước sóng 212 nm Thời gian lưu 10-HDA mẫu chuẩn thử tương đương (12,34 phút) Khoảng tuyến tính Phương trình hồi quy: y = 58401x với R2 = 0,9999 (khoảng tuyến tính 5,0 – 160,0 μg/ml) Độ lặp lại RSD % hàm lượng 10-HDA sữa ong chúa 1,04%< 2,0% Độ Tỷ lệ phục hồi quy trình 99,41% (98,0 – 102,0 %) Kết luận Quy trình đạt tất yêu cầu thẩm định theo ICH [30] Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 31 Kết bàn luận 4.3 ỨNG DỤNG Kết định lượng 10-HDA mẫu khảo sát thể Bảng 4.19 Bảng 4.18 Kết khảo sát mẫu sữa ong chúa Mẫu Xuất xứ SOC SOC SOC SOC SOC SOC đông khô Cơ sở du lịch (Tiền Giang) Đại mộc Garden (Lô 1) Đại mộc Garden (Lô 2) Trại nuôi ong Buôn Mê Thuột Trại nuôi ong Bình Phước Đơng khơ từ mẫu sữa ong chúa lơ Hàm lượng 10-HDA (%) 0,56 1,05 1,02 1,08 1,53 0,95 Nhận xét: - Mẫu SOC 1: chất khác biệt hàm lượng 10-HDA thấp mẫu khảo sát (0,56 %) Cơ sở sản xuất công bố điều kiện bảo quản mẫu nhiệt độ thường thời gian tháng Về cảm quan, mẫu chất đặc, màu sắc khơng tương đồng vị nhạt, không gây cảm giác tê rát cổ so với mẫu lại - Mẫu SOC SOC cho thấy chất lượng ổn định lô thu hoạch thời điểm khác nhau; - SOC sau đơng khơ có hàm lượng 10-HDA thay đổi khơng có ý nghĩa thống kể, chứng tỏ điều kiện tác động quy trình đơng khơ khơng ảnh hưởng đến chất lượng Có thể ứng dụng để sản xuất nguyên liệu đóng nang sữa ong chúa - Mẫu SOC 5: có hàm lượng 10-HDA cao (1,53 %), nhiên chưa đủ cở mẫu nghiên cứu nên chưa thể kết luận vùng miền cho sữa ong chúa có chất lượng cao 4.4 BÀN LUẬN - Quy trình định lượng áp dụng cho mục tiêu khảo sát chất lượng với mẫu thu thập có nồng độ 10-HDA thay đổi khoảng rộng từ 5,0 – 160,0 μg/ml - Quy trình xử lý mẫu đơn giản, không qua bước chiết tách, pic 10-HDA đạt yêu cầu độ tinh khiết, không bị ảnh hưởng pic lân cận (Rs 5,5) nên kết định lượng đạt tính tính xác - Hàm lượng 10-HDA dao động lớn mẫu khảo sát, mẫu SOC lấy trực tiếp từ nơi sản xuất (mẫu SOC SOC 5) có hàm lượng 10-HDA cao so với mẫu SOC thành phẩm thị trường (các mẫu SOC 1, SOC 2, SOC 3) Điều cho thấy tầm quan trọng việc bảo quản SOC cách sau thu hoạch suốt q trình lưu thơng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.32 Mẫu khảo sát KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN Sau thời gian thực hiện, thu số kết thực nghiệm: - Xây dựng phương pháp định tính 10-HDA sữa ong chúa Việt Nam phương pháp sắc ký lớp mỏng, xác định hệ dung môi tách tốt vết cần khảo sát nhiên hệ cloroform – ethyl acetat (1 : 2) lựa chọn tách nhiều vết mẫu thử - Xây dựng thẩm định quy trình định lượng 10-HDA sữa ong chúa phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: Mẫu đối chiếu: pha dung dịch 10-HDA đối chiếu nồng độ 40 μg/ml methanol Mẫu thử: cân 180 mg sữa ong chúa, siêu âm đến tan hồn tồn dung mơi methanol, định mức đến vạch bình định mức 50 ml Mẫu thử mẫu đối chiếu lọc qua màng lọc 0,45 μm, dịch lọc tiêm vào hệ thống sắc ký Các điều kiện sắc ký: Cột sắc ký Eurospher II C8 (250 x 4,6 mm; μm) Nhiệt độ cột: 30 oC; Thể tích tiêm: 10 μl Pha động: methanol – acid phosphoric pH (55 : 45) Tốc độ dịng: 1,0 ml/phút Bước sóng phát 212 nm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.33 Mẫu khảo sát TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Melliou E., Chinou I (2014), “Chemistry and bioactivities of Royal jelly”, Natural Products Chemisty, 43, pp 262-290 [2] Ha S M., Yeo Y H., Cho Y H., et al (2011), “Royal jelly reduces melanin synthesis through down regulation of Tyrosinase expression”, The American Journal of Chinese Medicine, 39(6), pp 1253-1260 [3] Peng C C., Sun H T., Lin I P., et al (2017), “The functional property of Royal jelly 10-hydroxy-2-decenoic acid as a melanogenesis inhibitor”, BMC Complementary and Alternative Medicine, 17(392), pp 1-8 [4] Antinelli J et al (2003), “Evaluation of (E)-10-hydroxy-2-decenoic acid as a freshness parameter for Royal jelly”, Food Chem, 80, pp.85-89 [5] Bloodworth B C., et al (1995), “Liquid chromatographic determination of trans-10-hydroxy-2-decenoic acid content of commercial products containing Royal jelly”, Journal of AOAC International, 78(4), pp 1019-1023 [6] Li J., Zhang H X., Kou X L., Hu Z D (1995), “Seperation and determination of 10-hydroxy-2-decenoic acid in Royal jelly by capillary electrophoresis”, Chromatographia, 41(9,10), pp 605-606 [7] Kim J., Lee J (2010), “Quantitative analysis of trans 10- hydroxy-2-decenoic acid in Royal jelly products purchased in USA by high performance liquid chromatography”, Journal of Apicultural Science, 54(1), pp 77-83 [8] Garcia-Amoedo L H., de Almeida-Muradian L B (2003), “Determination of trans-10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA) in Royal jelly from Sao Paulo State, Brazil”, Cienc Tecnol Aliment Campinas, 23, pp 63- 64 [9] Mărghitas L., Bărnutiu L I., Dezmirean D S., et al (2013), “Determination of trans-10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA) in Transylvanian Royal jelly”, Bulletin UASVM Animal Science and Biotechnologies, 70(1), pp 9-14 [10] Lercker G (1981), “Components of Royal jelly: identification of the organic acids”, Lipids, 16(12), pp 912-919 [11] Svoboda J A., Herbert E W., Thompson M J (1986), “Sterols of organs involved in blood food production and of Royal jelly in honey bees”, Insect Biochem., 16(3), pp 479-482 [12] Vittek J (1984), “Testosterone in Royal jelly”, Experientia, 40, pp.104-105 [13] Liu J R., Yang Y C., Shi L S et al (2008), “Antioxidant properties of Royal jelly associated with larval age and time of harvest”, J Agric Food Chem., 56, pp 11447-11452 [14] Vucevic D., Melliou E., Vasilijic S., et al (2007), “Fatty acid isolated from Royal jelly modulate dendritic cell-mediated immune response in vitro”, International Immuno pharmacology, 7, pp 1211-1220 [15] Hidaka S., Okamoto Y., Uchiyama S., et al (2006), “Royal jelly prevents osteoporosis in rats: beneficial effects in ovariectomy model and in bone tissue culture model”, eCAM, 3(3), pp 339-348 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh PL.34 Mẫu khảo sát [16] Hattori N., Sakamoto T., et al (2009), “Royal jelly facilitates restoration of the cognitive ability in trimethyltin-intoxicated mice”, eCAM, 1, pp 1-6 [17] Ito S., Nitta Y., Fukumistu H., et al (2011), “Antidepressant - like activity of 10-hydroxxy-trans-2-decenoic acid, a unique unsaturated fatty acid of Royal jelly, in stress - inducible depression - like mouse model”, eCAM, 1, pp 1-6 [18] Guo H., Chikaraishi Y., Shimazawa M., et al (2007), “Royal jelly supplementation improves lipoprotein metabolism in humans”, Journal Nutrial Science Vitaminol, 53, pp 345-348 [19] Munstedt K., Bargello M., Hauenschild A (2009), “Royal jelly reduces the serum glucose levels in healthy subjects”, J Med Food, 12(5), pp 1170-1172 [20] Taavoni S., Goushegir A., et al (2014), “Effect of Royal jelly on premenstrual syndrome among Iranian medical sciences students: a randomized, triple-blind, placebo-controlled study”, Complementary Therapies in Medicine, 1, pp 1-13 [21] Imai M., Qin J., Yamakawa N., et al (2012), “Molecular alterations during female reproductive aging: can aged oocytes remind youth?”, Embryology – Updates and Highlights on Classic Topics, 1, pp 3-22 [22] Siavash M., Shokri S., Haghighi S., et al (2015), “The efficacy of topical Royal jelly on healing of diabetic foot ulcers: a double-blind placebo-controlled clinical trial”, Internatioal Wound Journal, 12(2), pp 137-142 [23] Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập 2, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, tr 1179-1185 [24] Michael C., Peter McDonald (2017), “Market Opportunity Assessment based on production that uses new labour saving technology”, pp [25] Tuyet Hoa Nietdam (2003), “Production and Export honey in Daklak”, pp [26] Isidorov V A., Bakier S., Grzech I., et al (2012), “Gas chromatographic – mass spectrometric investigation of volatile and extractable compounds of crude Royal jelly”, Journal of Chromatography B, 885 - 886, pp 109-116 [27] Noda N., Nakatani T., et al (2005), “Isolation nd characterization of some hydroxy fatty and phosphoric acid esters of 10-Hydroxy-2-decenoic acid from the Royal jelly of honeybees (Apis mellifera)”, Lipids, 40(8), pp 833-838 [28] Boselli E., Sabatini A G., et al (2003), “Determination and changes of free amino acids in Royal jelly during storage”, Apidologie, 34(2), pp 129-137 [29] Garcia-Amoedo L H., de Almeida-Muradian L B (2003), “Determination of trans-10-hydroxy-2-decenoic acid (10-HDA) in Royal jelly from Sao Paulo State, Brazil”, Cienc Tecnol Aliment Campinas, 23, pp 63- 64 [30] Japanese Pharmacopoeia XVII (2016), pp 1960-1961 [31] ICH Harmonised tripartite guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, pp 1-13 ... 20 4.1 ĐỊNH TÍNH ACID (E) -10- HYDROXY- 2- DECENOIC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỚP MỎNG 20 4 .2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID (E) -10- HYDROXY- 2DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG... tính phát nhanh 10- HDA sữa ong chúa Kết bàn luận 21 4 .2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID (E) -10- HYDROXY- 2DECENOIC TRONG SỮA ONG CHÚA BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO - Mẫu thử:... cứu 3.1 .2 Phương pháp nghiên cứu 3.1 .2. 1 Định tính acid (E) -10- hydroxy- 2- decenoic sữa ong chúa phương pháp sắc ký lớp mỏng Thử nghiệm định tính xác định 10- HDA sữa ong chúa phương pháp sắc ký lớp