i BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƢƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT HOẠT TÍNH ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ THÂN ĐẬU BẮP ABELMOSCHUS ESCULENTUS (L.) MALVACEAE Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: KHOA DƯỢC, ĐH Y DƯỢC TP HCM Chủ trì nhiệm vụ: PGS TS HUỲNH NGỌC TRINH Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH v CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN T[I LIỆU 2.1 QU\ TRÌNH TỔNG HỢP CHOLESTEROL V[ VAI TRÒ CỦA ENZYM HMG-COA REDUCTASE 2.2 THUỐC ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE 2.3 THỬ NGHIỆM ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE TỪ DỊCH ĐỒNG THỂ ENZYM 2.4 C]Y ĐẬU BẮP [1], [6] 2.4.1 Tên gọi - Ph}n loại thực vật 2.4.2 Mô tả 2.4.3 Ph}n bố, thu hái v{ chế biến 2.4.4 Th{nh phần hóa học [17], [19], [59], [82] 2.4.5 T|c dụng dược lý CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG – PHƯƠNG PH\P NGHI N CỨU 11 3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 11 3.1.1 ong vat th nghiệm 11 3.1.2 Dược liệu 11 3.1.3 oa chat va dung moi 11 3.1.4 Trang thiet bị – Dụng cụ 11 3.2 PHƯƠNG PH\P NGHI N CỨU 12 3.2.1 Quy trình chiết xuất dược liệu 12 3.2.2 Quy trình tạo dịch đồng thể enzym từ gan chuột nhắt 12 3.2.3 ịnh lượng h{m lượng protein dịch đồng thể enzym gan thu phương ph|p Biuret 14 3.2.4 Phương ph|p định lượng hoạt tính MG-CoA reductase 14 iii 3.2.5 Phương ph|p định lượng lipid huyết 16 3.2.6 Khảo s|t hoạt tính ức chế MG-CoA reductase mơ hình in vitro [44] 17 3.2.7 Khảo s|t hoạt tính ức chế MG-CoA reductase mơ hình chuột tăng lipid huyết cấp tính 19 3.3 PH]N TÍCH KẾT QUẢ THỐNG K 20 CHƯƠNG KẾT QUẢ V[ B[N LUẬN 21 4.1 Kết chiết xuất dược liệu 21 4.2 Khảo s|t hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase mơ hình in vitro 21 4.2.1 Hoạt tính ức chế MG-CoA reductase in vitro atorvastatin 21 4.2.2 Kết khảo s|t hoạt tính ức chế enzym MG-CoA reductase in vitro cao to{n phần ậu bắp 22 4.2.3 Kết khảo s|t hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro cao ethyl acetat ậu bắp 23 4.3 Khảo s|t hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase mơ hình chuột tăng lipid huyết cấp tính 23 4.3.1 T|c dụng hạ lipid huyết 23 4.3.2 oạt tính ức chế enzym MG-CoA reductase 26 CHƯƠNG KẾT LUẬN V[ KIẾN NGHỊ 28 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Tiếng Anh LDL-C Tiếng Việt Low-density lipoprotein Cholesterol Cholesterol lipoprotein tỷ trọng thấp LDL-R Low-density lipoprotein receptor Thụ thể lipoprotein tỷ trọng thấp HDL-C High-density lipoprotein Cholesterol lipoprotein Cholesterol tỷ trọng cao HMG-CoA Hydroxymethylglutaryl Coenzym A TG Triglycerides EA IV Ethyl acetat Intravenous Tiêm tĩnh mạch v DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Độ ẩm, độ tro c|c cao Đậu bắp 21 Bảng 4.2 Nồng độ cholesterol v{ triglycerid c|c nhóm chuột thử nghiệm 24 Bảng 4.3 Kết thí nghiệm khảo s|t hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase mơ hình chuột tăng lipid huyết cấp tính v{ điều trị 24 26 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Qu| trình tổng hợp cholesterol [29] Hình 2.2 C}y Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae Hình 4.1 Đường tuyến tính phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase v{o nồng độ atorvastatin 22 Hình 4.2 Đường tuyến tính phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase v{o nồng độ cao to{n phần 22 Hình 4.3 Đường tuyến tính phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase v{o nồng độ cao ethyl acetat 23 Hình 4.4 Nồng độ cholesterol huyết c|c nhóm chuột sau 24 điều trị 24 Hình 4.5 Nồng độ triglycerid huyết c|c nhóm chuột sau 24 điều trị 25 Hình 4.6 Hoạt tính enzym HMG-CoA reductase (nmol/phút) c|c nhóm chuột thử nghiệm 26 CHƢƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ Rối loạn lipid huyết yếu tố nguy liên quan đến bệnh tim mạch Các nghiên cứu trước nhóm cho thấy thân Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae có tác dụng hạ lipid huyết, cao từ thân Đậu bắp, đặc biệt cao chiết toàn phần cồn 50% cao chiết phân đoạn ethyl acetat thể rõ tác động [5], [8], [12], [13], [14] Tuy nhiên, chế tác dụng hạ lipid huyết Đậu bắp chưa chứng minh Với mong muốn chứng minh chế gây lipid huyết thân Đậu bắp, thực đề tài " Khảo sát hoạt tính ức chế HMG-CoA reductase cao chiết từ thân đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.), Malvaceae" với nội dung sau: + Chiết xuất cao toàn phần cao ethyl acetat từ thân đâu bắp + Khảo sát tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vitro cao dược liệu + Khảo sát tác dụng ức chế HMG-CoA reductase in vivo cao dược liệu mơ hình chuột gây tăng lipid huyết cấp tyloxapol CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 QUÁ TRÌNH TỔNG HỢP CHOLESTEROL VÀ VAI TRÒ CỦA ENZYM HMG-COA REDUCTASE Trong thể, tế bào nhận cholesterol từ đường: tổng hợp tế bào hấp thu từ hệ tiêu hóa Hầu hết trình sinh tổng hợp cholesterol xảy gan ruột Ngồi ra, cholesterol cịn tổng hợp thượng thận, tinh hoàn, buồng trứng, da hệ thần kinh Quá trình tổng hợp cholesterol nội sinh phức tạp, cần 20 enzym khác tham gia chuyển hóa phân tử carbon acetyl – CoA thành cấu trúc vịng có 27 carbon (hình 2.1) Quá trình tổng hợp cholesterol gồm 25 bước, chia làm giai đoạn: (1) tổng hợp acid mevalonic từ acid acetic dạng acetyl CoA, (2) biến đổi acid mevalonic thành isopren hoạt hóa, (3) biến đổi đơn vị isopren hoạt hóa thành squalen, (4) biến đổi squalen thành nhân steroid có vờng Trong đó, giai đoạn chuyển hóa HMG-CoA thành acid mevalonic enzym HMG-CoA reductase bước quan trọng Như vậy, enzym HMG-CoA reductase có vai trị quan trọng đảm nhiệm xúc tác cho phản ứng không thuận nghịch giai đoạn đầu trình tổng hợp cholesterol nội sinh [72] Do đó, việc ức chế HMG-CoA reductase giới hạn trình sinh tổng hợp cholesterol nội sinh Hình 2.1 Quá trình tổng hợp cholesterol [29] 2.2 THUỐC ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE Nhóm thuốc lựa chọn việc giảm nồng độ LDL-C giảm nguy bệnh mạch vành Ở bệnh nhân đáp ứng với thuốc, statin có khả làm giảm 20-46% nồng độ LDL-C liều đầu tiên, 35-60% tối đa liều Ngoài thuốc làm giảm nồng độ triglycerid 15-45% tăng nồng độ HDL-C nhẹ Các thuốc nhóm có cấu trúc tương tự HMG-CoA reductase, có tác dụng ức chế theo kiểu cạnh tranh với HMG-CoA reductase dẫn đến làm giảm tổng hợp cholesterol nội sinh Các statin khuyến cáo sử dụng theo NCEP ATP-IV bao gồm atorvastatin, simvastatin, fluvastatin, lovastatin, rosuvastatin, pravastatin  Atorvastatin [3], [7] Dƣợc lực học Atorvastatin ức chế cạnh tranh chọn lọc enzym HMG-CoA reductase, ức chế trình chuyển 3-hydroxy-3-metylglutaryl-coenzym A thành mevalonat, ức chế tổng hợp cholesterol gan tăng số lượng thụ thể LDL-R bề mặt tế bào gan từ tăng thối biến LDL-C Atorvastatin làm giảm sản xuất LDL-C giảm số lượng LDL-C, làm gia tăng hoạt tính LDL-R thay đổi có lợi tính chất LDL-C tuần hoàn Dƣợc động học Hấp thu: Atorvastatin hấp thu nhanh dùng đường uống, nồng độ thuốc huyết tương tối đa đạt vòng - Sinh khả dụng tuyệt đối atorvastatin khoảng 14% Thức ăn làm giảm tốc độ mức độ hấp thu Hiệu giảm LDL-C thời điểm dùng thuốc ngày Phân bố: Thể tích phân bố trung bình atorvastatin khoảng 381 lít Trên 98% atorvastatin gắn kết với protein huyết tương Chuyển hóa: Khoảng 70% hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase atorvastatin chất chuyển hóa có hoạt tính Thải trừ: Atorvastatin chất chuyển hóa thải trừ chủ yếu qua mật sau q trình chuyển hóa gan ngồi gan Dưới 2% lượng atorvastatin uống vào tìm thấy nước tiểu Chỉ định Atorvastatin định làm giảm cholesterol toàn phần, LDL-C, apolipoprotein B TG bệnh nhân có triệu chứng tăng lipid huyết nguyên phát, tăng lipid huyết hỗn hợp tăng cholesterol huyết Chống định Người có bệnh lý gan tiến triển hay có tăng dai dẳng transaminase huyết lần giới hạn mức bình thường, bệnh nhân mang thai, cho bú Tác dụng phụ Những tác dụng bất lợi thường gặp (≥ 1%) táo bón, đầy hơi, đau bụng, nhức đầu, buồn nôn, đau cơ, mệt mỏi, tiêu chảy ngủ Liều lƣợng Liều khởi đầu 10 mg lần ngày Liều dùng tùy thuộc cá nhân dựa theo nồng độ LDL-C ban đầu, mục tiêu điều trị đáp ứng bệnh nhân Sau liều khởi đầu, nên kiểm tra số lipid máu vòng 2-4 tuần chỉnh liều theo kết xét nghiệm Liều tối đa 80 mg/ngày Thận trọng Suy gan thận, trẻ em, phụ nữ có thai cho bú Nên tái khám bị đau, căng yếu không giải thích 2.3 THỬ NGHIỆM ỨC CHẾ HMG-COA REDUCTASE TỪ DỊCH ĐỒNG THỂ ENZYM Vai trò chế hoạt động enzym HMG-CoA reductase nhà nghiên cứu làm sáng tỏ kể từ thập niên 1950 – 1960 Chu trình chuyển hóa cholesterol thể chuột thí nghiệm với tham gia nhiều enzym khác nhau, có vai trị quan trọng enzym HMG-CoA reductase Bloch (1965) mô tả [22] Kể từ đó, enzym HMG-CoA reductase mục tiêu nhắm đến nhà nghiên cứu in vitro in vivo lĩnh vực y sinh Từ năm 1972, chế hoạt động enzym HMG-CoA reductase thụ thể enzym Goldstein cộng làm sáng tỏ, điều làm tiền đề cho phát triển thuốc điều trị rối loạn lipid huyết với chế ức chế enzym HMG-CoA reductase [37] Các nhà khoa học nghiên cứu quy trình chiết xuất enzym HMGCoA reductase nhằm sử dụng để tìm chất có khả ức chế enzym Vào năm 1972, Shefer cộng thành công việc tạo dịch đồng thể enzym HMG-CoA reductase từ niêm mạc ruột gan chuột [67] Giữa thập niên 1970, Akira Endo chiết xuất thành công Compactin từ nấm Penicillium citrinum, dẫn xuất có khả ức chế enzym HMG-CoA reductase dịch đồng thể 21 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Kết chiết xuất dƣợc liệu Từ kg bột dược liệu thân Đậu bắp đun hồi lưu với 40 lít cồn 50% thu 2200 ml cao lỏng thân Đậu bắp Trích 250 ml cao lỏng thân Đậu bắp, cô cách thủy 95 0C đến cao đặc, sấy áp suất thấp, nhiệt độ 35 0C thu 73,28 g cao toàn phần (độ ẩm 11,65%) Hiệu suất chiết 12,9% Từ 1950 ml cao lỏng thân Đậu bắp lại, hòa thêm nước, lắc phân bố lỏng – lỏng với dichloromethan Phần dịch lại sau loại bỏ dichloromethan tiếp tục lắc phân bố với ethyl acetat Dịch ethyl acetat bay dung môi thu 13,53 g cao ethyl acetat (độ ẩm 5,86%) Hiệu suất chiết 0,31% Độ ẩm, độ tro cao tồn phần cao ethyl acetat trình bày bảng 4.1 Bảng 4.1 Độ ẩm, độ tro cao Đậu bắp Độ ẩm (%) Tro toàn phần (%) Tro khơng tan acid (%) Cao tồn phần 11,65 22,33 0,81 Cao ethyl acetat 5,86 2,10 0,17 4.2 Khảo sát hoạt t nh ức chế HMG-CoA reductase mô hình in vitro 4.2.1 Hoạt t nh ức chế HMG-CoA reductase in vitro atorvastatin Đường tuyến tính thể mối liên quan % ức chế hoạt tính enzym HMG-CoA reductase nồng độ atorvastatin thể hình 4.1 Kết cho thấy atorvastatin bắt đầu ức chế enzym nồng độ 0,1 ng/ml, bắt đầu tác động ức chế enzym mạnh nồng độ 10 ng/ml, nồng độ 1000 ng/ml enzym bị ức chế hoàn tồn Phương trình hồi quy: y = 23,969x + 28,655, R2 = 0,95623 Như vậy, IC50 ước lượng atorvastatin: 7,77 (ng/ml) 22 % ức chế HMG-CoA reductate 120 -2 y = 23,969x + 28,655 R² = 0,95623 100 80 60 40 20 -1 Log [Nồng độ atorvastatin] Hình 4.1 Đường tuyến tính phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase vào nồng độ atorvastatin 4.2.2 Kết khảo sát hoạt t nh ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro cao tồn phần Đậu bắp Đường tuyến tính thể phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase vào nồng độ cao toàn phần Đậu bắp thể hình 4.2 Kết cho thấy cao tồn phần Đậu bắp có hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase mơ hình in vitro Khoảng tuyến tính ước lượng khoảng nồng độ 500 – 1300 μg/ml Phương trình hồi quy: y = 136,21x - 358,75, R2 = 0,93172 Như vậy, IC50 ước lượng cao toàn phần: 1002,03 (μg/ml) % ức chế HMG-CoA reductase 80 y = 136,21x - 358,75 R² = 0,93172 70 60 50 40 30 20 10 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 Log[Nồng độ cao toàn phần] Hình 4.2 Đường tuyến tính phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase vào nồng độ cao toàn phần 23 4.2.3 Kết khảo sát hoạt t nh ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro cao ethyl acetat Đậu bắp Đường tuyến tính thể phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase % ức chế HMG-CoA reductase vào nồng độ cao ethyl acetat thể hình 4.3 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 2.00 y = 142,63x - 327,87 R² = 0,96494 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 Log[Nồng độ cao ethyl acetat] Hình 4.3 Đường tuyến tính phụ thuộc % ức chế enzym HMG-CoA reductase vào nồng độ cao ethyl acetat Kết cho thấy cao ethyl acetat Đậu bắp có hoạt tính ức chế enzym HMGCoA reductase mơ hình in vitro Khoảng tuyến tính ước lượng khoảng nồng độ 200 – 700 μg/ml Phương trình hồi quy: y = 142,63x – 327,87 Hệ số tương quan: R2 = 0,96494 Như vậy, IC50 ước lượng được cao ethyl acetat: 445,97 (μg/ml) 4.3 Khảo sát hoạt t nh ức chế enzym HMG-CoA reductase mơ hình chuột tăng lipid huyết cấp t nh 4.3.1 Tác dụng hạ lipid huyết Kết đo nồng độ cholesterol triglycerid chuột thử nghiệm sau tiêm tyloxapol điều trị 24 trình bày bảng 4.2 24 Bảng 4.2 Nồng độ cholesterol triglycerid nhóm chuột thử nghiệm Nhóm n Cholesterol (mg/dl) Triglycerid (mg/dl) Sinh lý 112,18 ± 8,06 (*) 137,58 ± 11,15 (*) Chứng bệnh 305,61 ± 27,18 (#) 1601,79 ± 238,85 (#) Ator 64 197,42 ± 22,24 (*) 1071,13 ± 128,95 (#, *) Tween 10 298,69 ± 19,38 (#) 1507,31 ± 168,68 (#) Cao TP 10 200,69 ± 21,91 (#, *) 884,62 ± 138,82 (#, *) Cao EA 10 214,29 ± 23,23 (#, *) 951,23 ± 70,54 (#, *) (#) p < 0,05 so với Sinh lý (*) p < 0,05 so với Chứng bệnh Kết thực nghiệm cho thấy 24 sau tiêm tyloxapol, nồng độ cholesterol triglycerid huyết tăng 2,72 11,64 lần so với nhóm sinh lý khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Ở nhóm chuột uống tween 1% 0,1 ml/10 g/ngày, nồng độ lipid huyết không khác biệt so với nhóm chứng bệnh Như vậy, tween 1% sử dụng để hòa tan cao ethyl acetat Đậu bắp mà không làm ảnh hưởng nồng độ lipid huyết chuột thử nghiệm # Nồng độ cholesterol (mg/dl) 350 # 300 * 250 #* #* 200 150 * 100 50 Sinh lý Chứng bệnh (#) p < 0,05 so với Sinh lý Ator 64 Tween TP EA (*) p < 0,05 so với Chứng bệnh Hình 4.4 Nồng độ cholesterol huyết nhóm chuột sau 24 điều trị 25 2000 # # Nồng độ triglycerid (mg/dl) 1800 1600 1400 #* 1200 #* #* TP EA 1000 800 600 400 * 200 Sinh lý Chứng bệnh Ator 64 (#) p < 0,05 so với Sinh lý Tween (*) p < 0,05 so với Chứng bệnh Hình 4.5 Nồng độ triglycerid huyết nhóm chuột sau 24 điều trị Ở nhóm điều trị với atorvastatin liều 64 mg/kg cân nặng, nồng độ lipid huyết giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng bệnh (p < 0,05) Nồng độ cholesterol triglycerid giảm tương ứng 35,4% 33,14% Đối với cao Đậu bắp, liều 60 g dược liệu khô/kg cân nặng, sau 24 điều trị, cao toàn phần cao ethyl acetat Đậu bắp làm nồng độ cholesterol giảm có ý nghĩa so với nhóm chứng bệnh (p < 0,05) Cụ thể, nồng độ cholesterol giảm 34,33% điều trị với cao toàn phần giảm 29,88% điều trị với cao ethyl acetat Tương tự, cao toàn phần cao ethyl acetat Đậu bắp làm giảm nồng độ triglycerid có ý nghĩa so với nhóm chứng (p < 0,05) Cụ thể, nồng độ triglycerid giảm 44,77% điều trị với cao toàn phần giảm 40,61% điều trị với cao ethyl acetat Các kết cho thấy, cao toàn phần cao ethyl acetat Đậu bắp thể tác động hạ lipid huyết liều 60 g dược liệu khơ/kg mơ hình tăng lipid huyết cấp tính điều trị 24 Do đó, tiến hành chiết tách men gan định lượng enzym HMG-CoA reductase để xác định hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase cao Đậu bắp Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 26 4.3.2 Hoạt t nh ức chế enzym HMG-CoA reductase Kết định lượng hoạt tính enzym HMG-CoA reductase nhóm chuột thử nghiệm trình bày theo bảng 4.3 Bảng 4.3 Kết thí nghiệm khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase mơ hình chuột tăng lipid huyết cấp tính điều trị 24 n ∆OD Hoạt tính enzym (nmol/phút) Sinh lý 0,021 ± 0,002 6,27 ± 0,79 (*) Chứng bệnh 0,063 ± 0,005 19,92 ± 1,47 (#) Ator 64 0,024 ± 0,013 7,29 ± 4,18 (*) Tween 10 0,066 ± 0,002 20,7 ± 0,71 (#) Cao TP 10 0,047 ± 0,003 14,56 ± 0,84 (*,#) Cao EA 10 0,048 ± 0,003 14,84 ± 1,11 (*,#) Nhóm (#) p < 0,05 so với Sinh lý (*) p < 0,05 so với Chứng bệnh Hoạt t nh enzym (nmol/phút) 25 # # 20 *# 15 *# * 10 * Sinh lý Chứng bệnh (#) p < 0,05 so với Sinh lý Ator 64 Tween Cao toàn phần Cao EA (*) p < 0,05 so với Chứng bệnh Hình 4.6 Hoạt tính enzym HMG-CoA reductase (nmol/phút) nhóm chuột thử nghiệm Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 27 Kết thực nghiệm cho thấy, liều 250 mg/kg tiêm tĩnh mạch, tyloxapol làm tăng hoạt tính enzym HMG-CoA reductase cách rõ rệt so với chuột sinh lý Thật vậy, nhóm chứng bệnh, hoạt tính enzym sau 24 tiêm tyloxapol 19,92 nmol/phút, tăng gấp 3,18 lần so với hoạt tính enzym nhóm chuột sinh lý Hoạt tính enzym HMG-CoA reductase nhóm chuột uống tween 1% với thể tích 0,1 ml/10 g/ngày khơng khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chứng bệnh (p = 0,608) Như vậy, tween 1% khơng làm thay đổi hoạt tính enzym HMG-CoA reductase Hai mươi bốn sau điều trị atorvastatin liều 64 mg/kg hay với cao Đậu bắp tồn phần cao ethyl acetat, hoạt tính enzym HMG-CoA reductase chuột thử nghiệm giảm so với nhóm chứng bệnh (bảng 4.11) Đối với atorvastatin, hoạt tính enzym giảm 63,4% khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chứng bệnh (p = 0,015) Hoạt tính enzym nhóm chuột điều trị với atorvastatin trở mức bình thường khơng khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chuột sinh lý (p = 0,829) Đối với cao Đậu bắp toàn phần cao ethyl acetat, hoạt tính enzym giảm 26,91% 25,5%, khác biệt có ý nghĩa so với nhóm chứng bệnh (p < 0,05) Tuy nhiên, hoạt tính enzym nhóm chuột điều trị với cao tồn phần cao ethyl acetat chưa trở mức hoạt tính enzym nhóm chuột sinh lý (p < 0,05) Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 28 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Trên thực nghiệm đạt số kết sau: - Chiết xuất cao toàn phần cồn 50% cao phân đoạn ethyl acetat - Khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro: Cả cao thể hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase mơ hình in vitro, cao ethyl acetat có hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vitro mạnh cao toàn phần - Khảo sát tác động hạ lipid huyết: Ở liều 60 g dược liệu khô/kg cân nặng, cao toàn phần cao ethyl acetat thể tác động hạ lipid huyết rõ rệt mô hình chuột gây tăng lipid huyết cấp tính tyloxapol - Khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase in vivo: Ở liều 60 g dược liệu khô/kg cân nặng, cao toàn phần cao ethyl acetat thể hoạt tính ức chế enzym HMG-CoA reductase tương tự KIẾN NGHỊ Trong thời gian tới, với mong muốn phát triển cao Đậu bắp thành sản phẩm ứng dụng điều trị bệnh, đề nghị: - Nghiên cứu dạng chế phẩm, kiểm định dạng chế phẩm với thành phần hoạt chất hay nhóm hoạt chất có tác dụng - Tiến hành thử lâm sàng bao gồm xác định tính an tồn người khỏe mạnh xác lập hiệu điều trị bệnh nhân rối loạn lipid huyết đái tháo đường; ứng dụng vào điều trị Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Võ Văn Chi (2004), Tự điển thực vật thông dụng, NXB Khoa học kỹ thuật, tr.124127 Đại học Y Hà Nội (2006), Sinh lý học tập 1, NXB Y học Hà Nội, Hà Nội, tr.337-352 Trần Thị Thu Hằng (2016), Dược lực học, NXB Phương Đông, tr.391-410, tr.576-595 Nguyễn Thị Hạnh, Mai Phương Mai (2008), “Góp phần nghiên cứu tác động hạ glucose huyết độc tính Đậu bắp Abelmoschus esculentus L Malvaceae thực nghiệm”, Y học Tp Hồ Chí Minh, 12 (1), tr.126-130 Trần Thị Lợi, Huỳnh Ngọc Trinh, Lê Thị Mỹ Vân, Trần Thủy Tiên, Trần Thị Hạnh, Mai Phương Mai (2012), “Khảo sát tác dụng hạ glucose huyết lipid huyết dịch chiết từ thân Đậu bắp Abelmoschus esculentus L Malvaceae”, Y học Tp Hồ Chí Minh Đỗ Tất Lợi (2004), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học, tr.759-760 Mai Phương Mai, Trần Mạnh Hùng (2016), “Dược Lý Học”, Nhà xuất Y học Hà Nội, Đại học Y Dược TP.HCM, tập 2, tr.166-182 Nguyễn Quang Nam, Nguyễn Thị Xuân Hương, Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên (2008), “Sàng lọc tác động hạ đường huyết lipid huyết phân đoạn Đậu bắp Abelmoschus esculentus L Malvaceae”, Y học Tp Hồ Chí Minh, 1, tr.302306 Võ Thị Kim Ngân (2016), “Khảo sát tác động ức chế hấp thu glucose qua ruột ex vivo in vivo cao chiết từ dứa thơm (Pandanus amaryllifolius R Pandanaceae)”, luận văn thạc sĩ Dược học ĐH Y Dược TP HCM 10 Trương Đình Phước (2016), “Mơ quy trình xác định hoạt tính enzym HMGCoA reductase từ gan chuột”, luận văn thạc sĩ Dược học ĐH Y Dược TP HCM 11 Trần Thủy Tiên (2009), “Sàng lọc tác động hạ đường huyết phân đoạn Đậu bắp Abelmoschus esculentus L Malvaceae”, luận văn thạc sĩ Dược học ĐH Y Dược TP HCM 12 Trương Thị Thu Trang, Nguyễn Thị Hạnh, Lê Phú Nguyên Thảo, Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên (2014), "Khảo sát tác động hạ lipid huyết Đậu bắp Abelmoschus esculentus (L.) Malvaceae chuột thực nghiệm", Y học Hồ Chí Minh, 18(2), 412 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 13 Huỳnh Ngọc Trinh, Nguyễn Ngọc Văn, Mai Phương Mai, Võ Phùng Nguyên (2008), “Xây dựng mô hình gây tăng lipid huyết thực nghiệm chuột nhắt khảo sát tác dụng hạ lipid huyết đậu bặp Abelmoschus esculentus L Malvaceae”, Y Học Tp Hồ Chí Minh, (12), 165-171 14 Huỳnh Ngọc Trinh, Nguyễn Bảo Yến, Vũ Thị Thanh Thảo, Trần Thuỷ Tiên, Mai Phương Mai (2014), "Tác dụng dược lý phân đoạn chiết từ thân Đậu bắp Abelmoschus esculentus L - Malvaceae chuột nhắt", Y học Hồ Chí Minh, 18(2), 429 Tiếng Anh: 15 Alberts A.W et al (1980), “Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase and a cholesterol-lowering agent”, Proc Natl Acad Sci USA, 77, 3957-3961 16 Alvarado FC and Crane RK (1962), “Phloridzin as a competitive inhibitor of the active transport of sugars by hamster small intestine invitro”, Biochim Biophys Acta, 56, 170172 17 Panagiotis Arapitsas (2008), “Identification and quatification of polyphenolic compounds from orka seeds and skins”, Food Chemistry, 1041-1045 18 Atawwodi et al (2009), “Polyphenol composition and antioxidant potential of Hibiscus esculentus L fruit cultivated in Nigeria”, Journal of Medicinal Food, 12(6), 13161320 19 V A Bandyukova and L V Ligai (1987), “A chemical investigation of the fruit of Abelmoschus esculentus”, Chem Nat Compd, 23, 376-377 20 L Barthe (1999), “Gastrointestinal absorption of drugs: methods and studies”, Fundam Clin Pharmacol, 13(2), 154-168 21 Bell GI et al (1990), “Molecular biology of mammalian glucose transporters”, Diabetes Care, 13(3), 193-208 22 Konrad Bloch (1965), “The Biological Synthesis of Cholesterol”, Science, 150(3692), 19-28 23 Burant C F et al (1992), “Fructose transporter in human spermatozoa and small intestine in GLUT5”, J Biol Chem, 267(21), 14523-14526 24 Brown MS D S., Dietschy JM, Siperstein MD ( 1973), "3-Hydroxy-3-methylglutaryl Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh coenzym A reductase Solubilization and purification of a cold-sensitive microsomal enzym.", J Biol Chem, 248, 4731-4738 25 Yuan-Yen Chang et al (2010), “Antiobesity and hypolipidemic Effects of PolyphenolRich Longan (Dimocarpus longans Lour.) Flower Water Extract in HypercaloricDietary Rats”, Food Chemistry, 2020-2027 26 Chin D J et al (1982), "Molecular cloning of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym a reductase and evidence for regulation of its mRNA", Proc Natl Acad Sci USA, 79(24), 7704-7708 27 Margaret J Cook (1965), “The Anatomy of the Laboratory Mouse”, Mouse Genome Informatics 2008 28 Crane R K et al (1961), “The restrictions on possible mechanisms of intestinal active transport of sugars”, Membrane transport and metabolism, 439-449 29 DeBose-Boyd R A (2008), "Feedback regulation of cholesterol synthesis: sterolaccelerated ubiquitination and degradation of HMG CoA reductase", Cell Res, 18(6), 609-621 30 Christine Dixon and Linda W Mizen (1977), “Absorption of amino penicillins from everted rat intestine”, J Physiol, 269(3), 549-559 31 Durr IF R H (1960), "The reduction of β-hydroxy-β-methyl-glutaryl coenzym A to mevalonic acid", J Biol Chem, 235, 2572-2578 32 Joe R L Ehrenkranz et al (2004), “Phloridzin: a review”, Diabetes/Metabolism Research and Reviews, 21(1), 31-38 33 Endo A et al (1976), “ML-236A, ML-236B, and ML-236C, new inhibitors of cholesterogenesis produced by Penicillium citrinum”, J Antibiot (Tokyo), 29(12), 13461348 34 Eric Le Ferrec et al (2001), “In vitro models of the intestinal barrier”, ATLA, 29, 649668 35 Fordtran J S et al (1965), “Permeability characteristics of the human small intestine”, J Clin Invest., 44(12), 1935 36 Glynn I M (1964), “The action of cardiac glycosides on ion movements”, Pharmacol Rev., 16, 381-407 37 Goldstein JL et al (1976), “Receptor-mediated control of cholesterol metabolism”, Science, 191(4223), 150-154 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 38 Goldstein J L et al (2006), "Protein sensors for membrane sterols", Cell, 124(1), 3546 39 N M Grefnera et al (2012), “Caco-2 cell culture as an intestinal epithelium model to study hexose transport”, Cell and Tissue Biology, 6(4), 335-340 40 Kirk L Hamilton and A Grant Butt (2013), “Glucose transport into everted sacs of the small intestine of mice”, Advances in Physiology Education Published, 37(4), 415-426 41 Hedin et al (1968), “Isolation and structural determination of 13 flavonoid glycoside in Hibicus esculentus (okra)”, American Journal of Botany, 55(4), 431-437 42 Hutchinson A et al (1959), “Studies of Phloridzin in malus”, Can J Med Sci, 37(7), 901-910 43 Huynh Ngoc Trinh, Doan Nguyen Kim Ngan, Vu Thi Thanh Thao, Mai Phuong Mai (2013), Hypolipidemic effect of fractional extracts from Okra plants in tyloxapol – induced hyperlipidemic mous model, Proceeding of The Eighth Indochina Conference on Pharmaceutical Sciences, pp.670-675 44 Danish Iqbal et al (2014), “In Vitro Screening for 𝛽-Hydroxy-𝛽-methylglutaryl-CoA Reductase Inhibitory and Antioxidant Activity of Sequentially Extracted Fractions of Ficus palmata Forsk”, BioMed Research International 45 Youngah Jo et al (2010), “Control of cholesterol synthesis through regulated ERassociated degradation of HMG-CoA reductase”, Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 45(3), 185-198 46 Shrikant V Joshi (2011), “Alteration of gastric mucus secretion in rats treated with Abelmoschus esculentusseed mucilage”, Der Pharmacia Lettre, 3(5), 183-188 47 Keller GA et al (1986), “3-Hydroxy-3-methylglutaryl conenzyme A reductase localization in rat liver peroxisomes and microsomes of control and cholestyraminetreated animals: quantitive biochemical and immunoelectron microscopical analyses”, J Cell Biol, 103(3), 875-886 48 Kellet G and Helliwell P (2000), “The diffusive component of intestinal glucose absorption is mediated by the glucose - induced recruitment of GLUT2 to the brush border membrane”, Biochem J., 350(1), 155-162 49 Panadda Khomsug et al (2010), “Antioxidative Activities and Phenolic Content of Extracts from Okra (Abelmoschus esculentus L.), Research Journal of Biological Sciences, 5(4), 310-313 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 50 Ki MH et al (2008), “The efficacy and safety of clopidogrel resinate as a novel polymeric salt form of clopidogrel”, Arch Pharm Res, 31(2), 250-258 51 Lee SH et al (1999), „Plasma and hepatic cholesterol and hepatic activities of 3hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoA reductase and acyl CoA: cholesterol transferase are lower in rats fed citrus peel extract or a mixture of citrus bioflavonoids”, J Nutr, 129(6), 1182-1195 52 Lengsfeld C et al (2004), “Glycosylated compounds from orka inhibit adhesion of Helicobacter Pylori to human gastro mucosa”, Journal of agricultural & food chemistry, 52(6), 1485-1503 53 Liao et al (2012), “Analysis and comparison of the active components and antioxidant activities of extracts from Abelmoschus esculentus L.”, Pharmagnosy Magazine, 8(30), 156-161 54 Liscum L et al (1985), "Domain structure of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzym A reductase, a glycoprotein of the endoplasmic reticulum", J Biol Chem, 260(1), 522-530 55 Mairue N et al (2015), "The effects of okra (Abelmoschus esculentus Linn.) on the cellular events associated with Alzheimer's disease in a stably expressed HFE neuroblastoma SH-SY5Y cell line", Neurosci Lett, 6-11 56 McCrimmon R et al (2002), “AICAR and Phloridzin reverse the hypoglycemia – specific defect in glucagon secretion in the diabetic BB rat”, Am J Physiol Endocrinol metab, 283(5), 1076-1083 57 Panayotova – Heiermann M et al (1995), “Kinetics of steady – state currents and charge movements associated with the rat Na+-glucose cotransporter”, J Biol Chem., 270(45), 27099-27105 58 Hirangi D Patel et al (2011), “Investigation of HMG-CoA Reductase Inhibitory Activity of Antihyperlipidemic Herbal Drugs In Vitro Study”, Asian J.Exp.Biol.Sci, 2(1), 63-68 59 E.A Pshenichnov et al (2005), “Bioactive protein components from Hibiscus esculentus seeds”, Chem Nat Compd, 41, 82-84 60 Davis G R et al (1982), “Permeability characteristic of human jejunum, ileum, proximal colon and distal colon: results of potential difference measurements and unidirectional fluxes”, Gastroenterology, 83(4), 844-850 61 Magdy M Rashed et al (2010), “Hypolipidemic effect of vegetable and cereal dietary Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh mixtures from Egytian sources”, Grasas Y Aceites, 61(3), 261-270 62 Vanitha Reddy et al (2012), “Inhibitor of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A (HMG-CoA) reductase in liver microsomes by Moringa Oleifera L Polyphenols”, UPSR, 3(7), 2510-2516 63 Vanitha Reddy et al (2014), “Inhibition of 3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Ex vivo) by Morus Indica (Mulberry), Chinese Journal of biology 64 Anupam Roy et al (2014), “Functional properties of Okra Albelmoschus esculentus L (Moench): traditional claims and scientific evidences”, Plant Science Today, 1(3), 121130 65 Schultz S G et al (1970), “Coupled transport of sodium and organic solutes”, Physyol Rev, 50(4), 637-718 66 Shechter J R a I (1983), "Regulation of Rat Liver 3-Hydroxy-3-methylglutarylC oenzym A Reductase", J Biol Chem, 259(2), 870-877 67 Shefer et al (1972), “HMG-CoA reductase of intestinal mucosa and liver of the rat”, The Journal of Lipid Research, 13, 402-412 68 Miyuki Shirosaki et al (2011), “Apple leaf extract as a potential candidate for suppressing postprandial elevation of the blood glucose level”, J Nutr Sci Vitaminol, 58(1), 63-67 69 Miyuki Shirosaki et al (2011), “Suppressive effect of peach leaf extract on glucose absorption from the small intestine of mice”, Biosci Biotechno Biochem., 76(1), 8994 70 Miyuki Shirosaki et al (2012), “Peach leaf contains multiflorin A as a potent inhibitor of glucose absorption in the small intestine in mice”, Biol Pharm Bull., 35(8), 12641268 71 Singleton VL Et al (1969), “Toxicity and related physiological activity of phenolic substances of plant origin”, J Agric Food Chem, 17(3), 497-512 72 Siperstein M D et al (1960), "Studies on the site of the feedback control of cholesterol synthesis", J Clin Invest, 39, 642-652 73 David Snipelisky, Paul Ziajka (2012), "Diabetes and hyperlipidemia: A direct quantitative analysis of the effects of insulin resistance on lipid levels in relation to atherosclerotic coronary artery disease", World Journal of Cardiovascular Diseases, 2(1), 20-25 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh 74 Stone J et al (2013), "2013 ACC/AHA Guildline on the Treatment of Blood Cholesterol to reduce Atheroscleotic Cardiovascular Risk in adults", J Am Coll Cardiol 63(25), 2889-2934 75 Sun L P et al (2007), "Sterol-regulated transport of SREBPs from endoplasmic reticulum to Golgi: Insig renders sorting signal in Scap inaccessible to COPII proteins", Proc Natl Acad Sci USA, 104(16), 6519-6526 76 Vallon V et al (1999), “Glomerular hyperfiltration in experimental diabetes mellitus: potential role of tubular reabsorption”, J Am Soc Nephrol, 10(12), 2569-2576 77 D.E Vance and J.E Vance (Eds.) (2002), Biochemistry of lipids, Lipoproteins and Membranes, Elsevier Science, pp.410-430 78 C.H.M Versantvoort et al (2000), Methodologies to study human intestinal adsorption A review, National institute of public health and the environment, pp.11-43 79 T H Wilson and G Wiseman (1954), “The use of sacs of everted small intestine for the study of the transference of substances from the mucosal to the serosal surface”, J Physiol, 123(1), 116-125 80 Ernest M Wright et al (2003), “The sodium/glucose cotransport family SLC5”, Eur J Physiol, 447(5), 510-518 81 Fangbo Xia et al (2015), "Antioxidative and Anti-Fatigue Constituents of Okra", Nutrients, 7(1), 8846-8858 82 Ray-Yu Yang et al (2008), “Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species”, Asia Pac J Clin Nutr, 18, 275-279 ... 4.2 Khảo s|t hoạt tính ức chế HMG- CoA reductase mơ hình in vitro 21 4.2.1 Hoạt tính ức chế MG -CoA reductase in vitro atorvastatin 21 4.2.2 Kết khảo s|t hoạt tính ức chế enzym MG -CoA reductase. .. nhiên, chế tác dụng hạ lipid huyết Đậu bắp chưa chứng minh Với mong muốn chứng minh chế gây lipid huyết thân Đậu bắp, thực đề tài " Khảo sát hoạt tính ức chế HMG- CoA reductase cao chiết từ thân đậu. .. tránh hư hỏng enzym Các dịch đồng thể sử dụng để đánh giá hoạt tính enzym HMG – CoA reductase nhằm khảo sát hoạt tính ức chế enzym HMG – CoA reductase cao chiết từ thân Đậu bắp mơ hình in vitro