BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH ENZYM XANTHIN OXIDASE VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO QUẢ NHÀU (Morinda citrifolia L.) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược – Đại học Y Dược TPHCM Chủ trì nhiệm vụ: ThS Tạ Quang Vượng Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG ỨC CHẾ HOẠT TÍNH ENZYM XANTHIN OXIDASE VÀ KHẢ NĂNG CHỐNG OXY HÓA IN VITRO CỦA CAO QUẢ NHÀU (Morinda citrifolia L.) Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) ThS Tạ Quang Vượng Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) DANH SÁCH NHỮNG THÀNH VIÊN THAM GIA NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI VÀ ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH Thành viên tham gia nghiên cứu: - Tạ Quang Vượng - Trần Thị Khánh Ngân Đơn vị phối hợp chính: - Bộ mơn Sinh hóa, Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM MỤC LỤC MỤC LỤC I DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT III DANH MỤC CÁC BẢNG IV DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ V CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 đặt vấn đề 1.2 Bệnh gout 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Dịch tễ 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh 1.3 Enzym xanthin oxidase 1.3.1 Đặc điểm cấu trúc chế hoạt động 1.3.2 Một số phương pháp xác định hoạt độ enzym xanthin oxidase 1.3.3 Dược liệu có tác động ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase 1.4 Gốc tự chất chống oxy hóa 10 1.4.1 Gốc tự 10 1.4.2 Chất chống oxy hóa .11 1.4.3 Một số phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro 12 1.4.4 Dược liệu có tác động chống oxy hóa 12 1.5 Nhàu 13 1.5.1 Đặc điểm thực vật 13 1.5.2 Thành phần hóa học 14 1.5.3 Tác dụng dược lý công dụng Nhàu 15 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu hóa chất, thiết bị 18 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 18 Tạ Quạng Vượng Trạng i 2.1.2 Hóa chất, thiết bị 18 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn Nhàu 19 2.2.2 Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro cao Nhàu 20 2.2.3 Khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt động enzym XO in vitro cao Nhàu 21 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu 27 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29 3.1 Kết 29 3.1.1 Kết chiết xuất dược liệu 29 3.1.2 Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro cao Nhàu 29 3.1.3 Khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt động enzym XO in vitro cao Nhàu 30 3.2 Bàn luận 35 3.2.1 Khả ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro cao Nhàu: 35 3.2.2 Khả ức chế gốc tự so superoxid in vitro cao Nhàu: 36 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 37 KẾT LUẬN 37 KIẾN NGHỊ 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 Tạ Quạng Vượng Trạng ii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Ngôn ngữ Từ viết tắt Từ gốc-nghĩa tiếng Việt Tiếng Anh DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl Tiếng Anh HGPRT Hypoxanthin-guanin phosphoribosyl transferase Tiếng Anh LDL Low density lipoprotein Tiếng Anh NAD+ Nicotinamid adenin dinucleotid dạng oxy hóa Tiếng Anh NBT p-Nitroblue tetrazolium chloride Tiếng Anh OD Optical Density-Mật độ quang Tiếng Anh PRPP 5’- phosphoribosyl-1-pyrophosphat Tiếng Anh SOD Superoxid dismutase Tiếng Anh XD Xanthin dehydrogenase Tiếng Anh XO Xanthin oxidase Tiếng Anh XOR Xanthin oxidoreductase Tiếng Việt kl/tt Khối lượng/thể tích Tiếng Việt tt/tt Thể tích/thể tích Tạ Quạng Vượng Trạng iii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục hóa chất dùng thử nghiệm 18 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị dùng thử nghiệm 18 Bảng 2.3 Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym XO in vitro cao toàn phần cao phân đoạn Nhàu 21 Bảng 2.4 Khảo sát nồng độ xanthin quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 24 Bảng 2.5 Khảo sát hàm lượng enzym XO quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 25 Bảng 2.6 Khảo sát nồng độ NBT quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid 26 Bảng 2.7 Thử nghiệm khả chống oxy hóa sử dụng DPPH cao Nhàu 26 Bảng 2.8 Thử nghiệm khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT cao Nhàu 27 Bảng 3.1 Khối lượng cao toàn phần phân đoạn chiết từ Nhàu 29 Bảng 3.2 Kết khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym XO in vitro cao Nhàu 29 Bảng 3.3 Kết khảo sát nồng độ xanthin quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT: 30 Bảng 3.4 Kết khảo sát hàm lượng enzym XO quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 31 Bảng 3.5 Kết khảo sát nồng độ NBT quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid 32 Bảng 3.6 Kết khảo sát khả chống oxy hóa sử dụng DPPH cao ethyl acetate Nhàu 34 Bảng 3.7 Kết thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT cao phân đoạn ethyl acetate Nhàu 34 Bảng 3.8 Kết thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 35 Tạ Quạng Vượng Trạng iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ Hình 1.1 Cấu trúc enzym xanthin oxidase [45] Hình 1.2 Cơ chế phản ứng enzym xanthin oxidase Hình 1.3 Quả Nhàu (Morinda citrifolia L.) 14 Hình 1.4 Một số hợp chất phân lập từ Nhàu [15] 17 Hình 2.1 Gốc tự superoxid khử NBT tạo formazan 22 Hình 3.1 Kết khảo sát nồng độ xanthin quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 31 Hình 3.2 Kết khảo sát hàm lượng enzym XO quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 32 Hình 3.3 Kết khảo sát nồng độ NBT quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid 33 Sơ đồ 1.1 Q trình chuyển hóa purin thể Sơ đồ 2.1 Phương pháp chiết xuất cao toàn phần cao phân đoạn Nhàu 19 Tạ Quạng Vượng Trạng v Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc CHƯƠNG ĐẶT VẤN ĐỀ - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Gout bệnh rối loạn chuyển hóa purincó nguồn gốc từ gia tăng tiêu hủy base purin nhân tế bào giảm xuất acid uric nước tiểu dẫn đến tăng mức nồng độ acid uric máu với nồng độ 7,0 mg/dl Acid uric sản phẩm chuyển hoá base purin xúc tác enzymxanthin oxidase (XO) Ức chế XO chế tác động mà thuốc điều trị gout hướng tới Ngồi q trình hoạt động, enzym XO sinh gốc tự superoxid mà nồng độ cao gây nhiều bệnh bệnh tim mạch, bệnh gan, đục thủy tinh thể, lão hóa, ung thư… đặc biệt làm nặng thêm triệu chứng viêm gout cấp Nhàu (Morinda citrifolia L.) thực vật phổ biến khơng Việt Nam mà cịn các nước có khí hậu nhiệt đới khác có đặc điểm chung sử dụng từ hàng ngàn năm trước để làm thực phẩm, thuốc chất tạo màu Ở Việt Nam, Nhàu sử dụng chủ yếu theo kinh nghiệm dân gian theo y học cổ truyền dựa tác dụng kháng khuẩn, kháng viêm (cảm ho, lỵ, mụn nhọt ) giảm đau nhức xương khớp Các nghiên cứu giới công dụng khác Nhàu nhiều riêng công dụng trị gout gần có nghiên cứu Palu cộng (2009)[52] khẳng định khả ức chế enzym XO dịch chiết Nhàu Tuy nhiên, kết công bố dừng khả ức chế enzyme XO dịch chiết toàn phần trái nhàu Bên cạnh đó, nghiên cứu khả chống gốc tự superoxide sử dụng mơ hình phản ứng xúc tác enzyme XO chưa thực Từ sở trên, đề tài “ Khảo sát tác động ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase khả chống oxy hóa in vitro cao Nhàu (Morinda citrifolia L.) ứng dụng điều trị bệnh gout” thực với mong muốn khảo sát sơ in vitro khả ức chế hoạt tính enzym XO khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt động enzym đối tượng cao chiết từ Nhàu Đề tài có mục tiêu cụ thể sau:  Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro cao toàn Tạ Quạng Vượng Trạng Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc phần cao phân đoạn Nhàu  Khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt động enzym xanthin oxidase in vitro cao Nhàu 1.2 BỆNH GOUT 1.2.1 Định nghĩa Bệnh gout (thống phong) bệnh rối loạn chuyển hóa purin, làm tăng acid uric máu, lắng đọng tinh thể natri urat tổ chức màng hoạt dịch khớp, sụn xương, gân, tổ chức da Đặc trưng bệnh đợt viêm khớp cấp, tái phát gây đau dội, tiến triển thành viêm khớp mạn tính [1] 1.2.2 Dịch tễ Sự phát triển bệnh gout trước 30 tuổi thường gặp nam giới so với nữ giới Tỉ lệ mắc bệnh nam giới tăng dần theo độ tuổi cao khoảng 75-84 tuổi Ở nữ giới tỉ lệ mắc thấp nam giới nguy mắc bệnh thường bắt đầu tăng sau mãn kinh Điều cho liên quan đến hormon oestrogen Việc tăng tuổi tác, béo phì, uống rượu, tăng huyết áp sử dụng thuốc lợi tiểu có liên quan đến việc tăng nguy mắc gout nữ giới [30] Những thống kê gần cho thấy tỉ lệ mắc bệnh có chiều hướng gia tăng Cứ sau 25 năm, tỷ lệ mắc bệnh lại tăng lên từ đến 20 lần Theo số liệu từ Cuộc điều tra sức khỏe dinh dưỡng toàn quốc lần thứ III Mỹ, có 5,1 triệu người Mỹ mắc bệnh gout từ năm 1988 đến năm 1994, tỉ lệ mắc tăng từ 2,9 ca/1000 người vào năm 1990 lên 5,2 ca/1000 người vào năm 1999 Theo nghiên cứu khác Anh, tỷ lệ mắc bệnh gout tăng từ 0,14% năm 1975 lên 1,4% năm 2005.[6] Tại Việt Nam giai đoạn 19781989, tỷ lệ bệnh gout chiếm 1,5% trường hợp mắc bệnh xương khớp điều trị nội trú khoa Cơ-Xương-Khớp bệnh viện Bạch Mai theo nghiên cứu 10 năm (1991-2000) tỷ lệ tăng lên 8,57% [3] Tạ Quạng Vượng Trạng Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc D: mẫu trắng mẫu thử (có chất thử khơng có DPPH) b) Thử nghiệm khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT Dựa kết khảo sát điều kiện mục 3.2.5.2, quy trình thử nghiệm tiến hành sau: Mẫu thử: hỗn hợp phản ứng ban đầu gồm: ml dung dịch xanthin, dung dịch enzym XO đệm phosphat ủ 15 phút 25oC Bất hoạt phản ứng 0,5 ml dung dịch HCl 2M, trung hòa hỗn hợp phản ứng với 0,5 ml dung dịch NaOH 2M Thêm ml phân đoạn dịch chiết cần khảo sát, ml dung dịch NBT vào hỗn hợp phản ứng, ủ 10 phút 25oC, đo độ hấp thu bước sóng 560 nm Thử nghiệm lặp lại lần Bảng 2.8 Thử nghiệm khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT cao Nhàu Chất thử (ml) Xanthin 250 µM (ml) Đệm phosphat 0,1M (pH =7,5) (ml) NBT 1800 µM (ml) Enzym XO 0,1 U/ml (0,02 U) (µl) HCl 1M (ml) A B C D (**) 0,9 200 (**) 0,9 (*) 1 0,9 200 1 0,9 (*) (*) Thay đệm phosphat 0,1M (pH =7,5) (**) Thay dung môi pha dịch cao thử A : mẫu chứng B : mẫu trắng mẫu chứng (khơng có dịch cao thử khơng có enzym) C: mẫu thử D: mẫu trắng mẫu thử (có dịch cao thử khơng có enzym) 2.2.4 Phương pháp xử lý số liệu Kết xử lý phần mềm Microsoft Excel 2010, trình bày dạng giá trị trung bình ± sai số chuẩn giá trị trung bình (Mean ± SEM) đánh giá phần mềm thống kê phân tích liệu SPSS Version 20.0 với phép kiểm định sau: Tạ Quạng Vượng Trạng 27 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc Phép kiểm T: sử dụng để kiểm định giả thiết hai mẫu độc lập có phân phối chuẩn Phép kiểm Mann-Whitney: sử dụng để kiểm định giả thiết hai mẫu độc lập khơng có phân phối chuẩn Trong tất phép kiểm, khác biệt có ý nghĩa thống kê giá trị p-value < 0,05 (khoảng tin cậy 95%) Tạ Quạng Vượng Trạng 28 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 KẾT QUẢ 3.1.1 Kết chiết xuất dược liệu Từ 1,5 kg bột Nhàu khô chiết với ethanol 96o lắc phân đoạn với dung môi hữu cơ, kết thể bảng 3.1: Bảng 3.1 Khối lượng cao toàn phần phân đoạn chiết từ Nhàu Cao toàn phần ethanol 96o Cao ethyl acetate Cao n-butanol Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) 264 10,06 48,35 17,60 0,67 3,22 3.1.2 Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro cao Nhàu Thử nghiệm tiến hành với dung dịch tương ứng với cắn thu từ cao toàn phần, cao phân đoạn ethyl acetate cao phân n-butanol nồng độ mg/ml, mg/ml ,5 mg/ml, 10 mg/ml Kết thể bảng 3.2: Bảng 3.2 Kết khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym XO in vitro cao Nhàu Nhóm Phần trăm ức chế (Mean ± SEM) Nồng độ (mg/ml) 10 Cao toàn phần 14,61±0,41 18,15±0,4 39,39±0,68 40,09±0,95 Cao phân đoạn ethyl acetate 50,35±1,12 71,47±1,98 (*) (*) Cao phân đoạn n-butanol 7,75±0,43 17,13±0,88 40,61±0,69 43,19±0,45 (*) Sự khác biệt mẫu thử mẫu trắng khơng có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Kết bảng giá trị trung bình lần thử nghiệm) Nhận xét: Tạ Quạng Vượng Trạng 29 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc - Dịch chiết toàn phần: độ hấp thu mẫu thử mẫu chứng khác có ý nghĩa thống kê tất nồng độ khảo sát (p < 0,05) - Phân đoạn dịch chiết ethyl acetate : độ hấp thu mẫu thử mẫu chứng khác có ý nghĩa thống kê nồng độ 1mg/ml 2mg/ml (p < 0,05) với phần trăm ức chế 50% Ở nồng độ 5mg/ml 10 mg/ml độ hấp thu mẫu thử mẫu trắng khác khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05), tức acid uric gần không tạo thành mẫu thử, chứng tỏ enzym XO gần bị ức chế hoàn toàn - Phân đoạn dịch chiết butanol : độ hấp thu mẫu thử mẫu chứng khác có ý nghĩa thống kê tất nồng độ khảo sát (p < 0,05) 3.1.3 Khảo sát khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt động enzym XO in vitro cao Nhàu 3.1.3.1 Khảo sát điều kiện quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT a) Khảo sát nồng độ xanthin quy trình thử nghiệm Thử nghiệm tiến hành với xanthin nồng độ 100-150-200-250-300 µM (pha nước cất) Kết thể bảng 3.3 hình 3.1: Bảng 3.3 Kết khảo sát nồng độ xanthin quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT:  OD 100 150 0,0173 0,0217 Tạ Quạng Vượng Nồng độ (µM) 200 0,0263 250 300 0,0637 0,0340 Trạng 30 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc 300 250 200 nồng độ xanthine (mcM) delta OD 150 100 0.0637 0.0217 0.0173 0.0340 0.0263 Hình 3.1 Kết khảo sát nồng độ xanthin quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT Nhận xét: Nồng độ xanthin 250 µM cho giá trị  OD cao nên lựa chọn mức nồng độ cho quy trình thử nghiệm khảo sát điều kiện b) Khảo sát hàm lượng enzym XO quy trình thử nghiệm Thử nghiệm tiến hành với enzym XO hàm lượng 0,0045 U; 0,01 U; 0,02 U; 0,05 U (pha đệm phosphate 0,1M pH=7,5) Kết thể bảng 3.4 hình 3.2: Bảng 3.4 Kết khảo sát hàm lượng enzym XO quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT 0,0045  OD 0,0173 Tạ Quạng Vượng Hàm lượng (U) 0,01 0,02 0,0633 0,0767 0,05 0,0637 Trạng 31 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc 0.5 hàm lượng XO (U) delta OD 0.2 0.1 0.045 0.0173 0.05 0.0767 0.0633 0.0637 0.029 Hình 3.2 Kết khảo sát hàm lượng enzym XO quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT Nhận xét: Hàm lượng enzym XO 0,2 U cho giá trị  OD cao nên lựa chọn hàm lượng cho quy trình thử nghiệm khảo sát điều kiện c) Khảo sát nồng độ NBT quy trình thử nghiệm Thử nghiệm tiến hành với NBT nồng độ 600-900-1200-1500-1800 µM (pha đệm phosphate 0,1M pH=7,5) Kết thể bảng 3.5 hình 3.3: Bảng 3.5 Kết khảo sát nồng độ NBT quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid  OD 600 900 Nồng độ (µM) 1200 0,0577 0,0740 0,0907 Tạ Quạng Vượng 1500 1800 0,1003 0,1247 Trạng 32 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc 1800 1500 1200 nồng độ NBT (mcM) 900 delta OD 600 0.0740 0.0577 0.0907 0.1003 0.1247 Hình 3.3 Kết khảo sát nồng độ NBT quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid Nhận xét: Nồng độ NBT 1800 µM cho giá trị  OD cao nên lựa chọn mức nồng độ cho quy trình thử nghiệm với dược liệu 3.1.3.2 Quy trình thử nghiệm khảo sát khả chống oxy hóa sử dụng DPPH cao Nhàu Sau tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng cao toàn phần cao phân đoạn Nhàu lên hoạt tính enzym XO in vitro, chúng tơi nhận thấy cao phân đoạn ethyl acetate cao phân đoạn n-butanol có hoạt tính enzym XO giảm có ý nghĩa thống kê so với lô chứng (p < 0,05) với phần trăm ức chế cao Vì vậy, hai phân đoạn lựa chọn tiến hành nghiên cứu khả ức chế gốc tự superoxid sinh hệ thống enzym XO Thử nghiệm khảo sát khả chống oxy sử dụng DPPH tiến hành với dung dịch tương ứng với cắn thu từ cao phân đoạn ethyl acetate cao phân đoạn nbutanol nồng độ mg/ml, mg/ml, mg/ml, 10 mg/ml Tuy nhiên kết cao phân đoạn n-butanol cho thấy khơng có khả chống oxy hóa nồng độ khảo sát Kết cao phân đoạn ethyl acetate thể bảng 3.6 Tạ Quạng Vượng Trạng 33 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc Bảng 3.6 Kết khảo sát khả chống oxy hóa sử dụng DPPH cao ethyl acetate Nhàu Phần trăm ức chế (Mean ± SEM) Nồng độ (mg/ml) 92,82±0,13 92,46±0,15 10 91,27±0,12 83,56±0,38 Nhận xét: Độ hấp thu độ hấp thu mẫu thử mẫu chứng khác có ý nghĩa thống kê tất nồng độ khảo sát (p < 0,05) với phần trăm ức chế cao từ nồng độ mg/ml 3.1.3.3 Quy trình thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT cao Nhàu Sau khảo sát để lựa chọn giá trị tối ưu cho điều kiện, quy trình thử nghiệm với NBT dược liệu tiến hành phần b mục 3.2.5.3 Thử nghiệm tiến hành với dung dịch tương ứng với cắn thu từ cao phân đoạn ethyl acetate cao phân đoạn n-butanol nồng độ mg/ml, mg/ml, mg/ml, 10 mg/ml Kết phân đoạn dịch chiết ethyl acetate thể bảng 3.7: Bảng 3.7 Kết thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT cao phân đoạn ethyl acetate Nhàu Phần trăm ức chế (Mean ± SEM) Nồng độ (mg/ml) 10 52,69±0,45 69,16±0,45 92,51±0,42 99,85±0,75 Nhận xét: độ hấp thu mẫu thử mẫu chứng khác có ý nghĩa thống kê tất nồng độ khảo sát (p < 0,05) cao phân đoạn ethyl acetate với phần trăm ức chế 50% nồng độ 10mg/ml gốc superoxid gần bị loại bỏ hoàn toàn Kết phân đoạn dịch chiết n-butanol thể bảng 3.8: Tạ Quạng Vượng Trạng 34 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc Bảng 3.8 Kết thử nghiệm khả ức chế gốc tự superoxid sử dụng NBT cao phân đoạn n-butanol Nhàu Phần trăm ức chế (Mean ± SEM) Nồng độ (mg/ml) -49,03±0,92 -54,92±1,74 10 -49,6±2,77 2,80±0,74(*) (*) Sự khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê lô thử lô chứng (p>0,05) Nhận xét: Kết cho thấy khơng có ức chế gốc tự superoxid nồng độ khảo sát cao n-butanol Nhàu 3.2 BÀN LUẬN 3.2.1 Khả ức chế hoạt tính enzym xanthin oxidase in vitro cao Nhàu: Thử nghiệm in vitro tương đối đơn giản nhanh chóng nên lựa chọn để sàng lọc nhanh phân đoạn có khả ức chế enzym XO Kết thực nghiệm phù hợp với kết nghiên cứu Palu cộng (2009) khẳng định khả ức chế enzym XO in vitro phụ thuộc nồng độ dịch chiết Nhàu Tuy nhiên, Palu nghiên cứu khả nước ép nguyên chất dịch chiết toàn phần với methanol Nhàu Trong đề tài này, việc đánh giá khả ức chế XO tiến hành cao toàn phần với ethanol 96o cao phân đoạn với ethyl acetate n-butanol Kết cho thấy cao toàn phần, cao phân đoạn với ethyl acetate với n-butanol có khả ức chế enzym XO in vitro nồng độ khảo sát (tối thiểu mg/ml) với phần trăm ức chế cao Đặc biệt phân đoạn dịch chiết ethyl acetate có phần trăm ức chế đạt 50% nồng độ mg/ml đến nồng độ 5mg/ml gần ức chế hồn toàn Một nghiên cứu Cimanga cộng (1999) cho thấy rutin (quercetin 3-rutinoside) phân lập phân đoạn n-butanol Nhàu có khả ức chế hoạt tính enzym XO ức chế gốc tự superoxid in vitro [21], [22] Do chúng tơi dự đốn flavonoid phân bố nhiều dung mơi n-butanol đóng vai trị định tác dụng ức chế XO phân đoạn Riêng phân đoạn ethyl acetate cho khả ức chế XO cao Tạ Quạng Vượng Trạng 35 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc vai trị thuộc hoạt chất khác ức chế XO mạnh rutin mà chưa nghiên cứu xác định, nghiên cứu thành phần hóa học Nhàu cịn 3.2.2 Khả ức chế gốc tự so superoxid in vitro cao Nhàu: Theo nghiên cứu Cimanga cộng cho thấy số flavonoid Nhàu vừa có khả ức chế XO vừa có khả ức chế gốc tự superoxid sinh trình hoạt động enzym nên flavonoid tồn Nhàu Ngoài nghiên cứu khác Yuting cộng (1990) cho thấy rutin có khả ức chế gốc tự mạnh số flavonoid thử nghiệm [18] Do đề tài khảo sát khả ức chế gốc superoxid cao phân đoạn ethyl acetate cao phân đoạn n-butanol hai phân đoạn dự đốn chứa nhiều flavonoid Tuy nhiên có phân đoạn ethyl acetate cho thấy khả chống oxy hóa tốt, với phần trăm ức chế cao thử nghiệm DPPH đạt 90% từ nồng độ mg/ml, thử nghiệm với NBT đạt 50% từ nồng độ mg/ml, đến nồng độ 10 mg/ml gần gốc tự bị loại bỏ hoàn toàn Trong phân đoạn n-butanol cho chứa nhiều rutin lại khả nồng độ khảo sát Điều nồng độ dịch chiết phân đoạn hỗn hợp phản ứng chưa đủ gây hiệu ức chế gốc tự rõ rệt Tạ Quạng Vượng Trạng 36 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu từ thực nghiệm, rút kết luận sau đây:  Cao toàn phần ethanol 96o, cao phân đoạn ethyl acetate cao phân đoạn nbutanol Nhàu có khả ức chế hoạt tính enzym XO in vitro  Cao phân đoạn ethyl acetate Nhàu có khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt động enzym XO in vitro KIẾN NGHỊ Để kế thừa phát triển kết thu từ đề tài này, đề nghị thực nghiên cứu theo số hướng sau đây:  Tiêu chuẩn hóa cao Nhàu  Xác định IC50 cho khả ức chế hoạt tính enzym XO khả ức chế gốc tự superoxid sinh từ hoạt động enzym XO in vitro cao Nhàu  Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym XO khả ức chế gốc tự superoxid sinh từ hoạt động enzym XO in vivo cao Nhàu Nghiên cứu chiết xuất phân lập thành phần hóa học cao Nhàu có tác động ức chế hoạt tính enzym XO loại trừ gốc tự sinh hoạt động enzym Tạ Quạng Vượng Trạng 37 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT [1] Trần Ngọc Ân (2000), Bách khoa thư bệnh học, NXB Từ điển bách khoa, Hà Nội, tr 2426 [2] Đỗ Huy Bích cộng (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, NXB Khoa học Kỹ thuật, tr 443-445 [3] Nguyễn Thu Hiền (2001), Nghiên cứu mơ hình bệnh tật khoa Cơ -Xương- Khớp bệnh viện Bạch Mai mười năm (1991-2000) Luận văn tốt nghiệp Thạc sĩ Y khoa Đại học Y Hà Nội [4] Đỗ Tất Lợi (2000), Những thuốc vị thuốc Việt Nam, NXB Y học, tr 306-307 TIẾNG ANH [5] Al-Khalidi U et al (1965), "The species distribution of xanthine oxidase", Biochemical Journal 97 (1), pp 318-320 [6] Annemans L et al (2008), "Gout in the UK and Germany: prevalence, comorbidities and management in general practice 2000–2005", Annals of the rheumatic diseases 67 (7), pp 960-966 [7] Apaya K L et al (2011), "Xanthine oxidase inhibition of selected Philippine medicinal plants", Journal of Medicinal Plants Research (2), pp 289-292 [8] Awaad A S et al (2010), "Antioxidant natural plant", RPMP Ethnomedicine: Source & Mechanism 27, pp 1-35 [9] Basar S et al (2010), "Analgesic and antiinflammatory activity of Morinda citrifolia L.(Noni) fruit", Phytotherapy Research 24 (1), pp 38-42 [10] Beckman J S et al (1989), "A sensitive fluorometric assay for measuring xanthine dehydrogenase and oxidase in tissues", Free Radic Biol Med (6), pp 607-615 [11] Bioactive Compounds from Natural Source: Isolation,characterisation and biological properties (2004), Chapter 9: Antioxidative Plant Constituent, Taylor & Francis eLibrary, USA and Canada [12] Bothe H et al (2010), "Luteolin enhances the bioavailability of benzo (a) pyrene in human colon carcinoma cells", Archives of biochemistry and biophysics 498 (2), pp 111118 [13] Brown A C (2012), "Anticancer activity of Morinda citrifolia (Noni) fruit: a review", Phytother Res 26 (10), pp 1427-1440 [14] Bui A K T et al (2006), "Polysaccharide composition of the fruit juice of Morinda citrifolia (Noni)", Phytochemistry 67 (12), pp 1271-1275 [15] Chan-Blanco Y et al (2006), "The noni fruit (Morinda citrifolia L.): A review of agricultural research, nutritional and therapeutic properties", Journal of Food Composition and Analysis 19 (6), pp 645-654 Tạ Quạng Vượng Trạng 38 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc [16] Chen Y et al (1990), "Flavonoids as superoxide scavengers and antioxidants", Free Radical Biology and Medicine (1), pp 19-21 [17] Choi E.-Y et al (2004), "Studies on the mechanism of action of xanthine oxidase", Journal of inorganic biochemistry 98 (5), pp 841-848 [18] Cimanga K et al (1995), "Flavonoid O-glycosides from the leaves of Morinda morindoides", Phytochemistry 38 (5), pp 1301-1303 [19] Cimanga K et al (1999), "Constituents from Morinda morindoides leaves as inhibitors of xanthine oxidase and scavengers of superoxide anions", Pharmacy and pharmacology communications (6), pp 419 [20] Corte E D et al (1972), "The regulation of rat liver xanthine oxidase Involvement of thiol groups in the conversion of the enzyme activity from dehydrogenase (type D) into oxidase (type O) and purification of the enzyme", Biochemical Journal 126 (3), pp 739745 [21] Czauderna M et al (2000), "Quantification of allantoin, uric acid, xanthine and hypoxanthine in ovine urine by high-performance liquid chromatography and photodiode array detection", Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications 744 (1), pp 129-138 [22] Dave R (2009), "In vitro models for antioxidant activity evaluation and some medicinal plants possessing antioxidant properties: An overview", African Journal of Microbiology Research (13), pp 981-996 [23] Deng S et al (2007), "Noni as an anxiolytic and sedative: a mechanism involving its gamma-aminobutyric acidergic effects", Phytomedicine 14 (7), pp 517-522 [24] Dewanjee S et al (2015), "Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry", Journal of Pharmaceutical Analysis (2), pp 75-84 [25] Dhungat S et al (1954), "The use of pyrophosphate buffer for the manometric assay of xanthine oxidase", Journal of Biological Chemistry 208 (2), pp 845-852 [26] Dussossoy E et al (2011), "Characterization, anti-oxidative and anti-inflammatory effects of Costa Rican noni juice (Morinda citrifolia L.)", Journal of ethnopharmacology 133 (1), pp 108-115 [27] Farine J.-P et al (1996), "Volatile components of ripe fruits of Morinda citrifolia and their effects on Drosophila", Phytochemistry 41 (2), pp 433-438 [28] Graham R et al (1976), "Effect of solvent on tetrazolium reaction", Journal of pharmaceutical sciences 65 (7), pp 1048-1053 [29] Guardia T et al (2001), "Anti-inflammatory properties of plant flavonoids Effects of rutin, quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat", Farmaco 56 (9), pp 683-687 [30] Hak A E et al (2009), "Menopause, postmenopausal hormone use and risk of incident gout", Annals of the rheumatic diseases, pp annrheumdis109884 [31] Halliwell B (1996), "Antioxidants in human health and disease", Annual review of nutrition 16 (1), pp 33-50 Tạ Quạng Vượng Trạng 39 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc [32] Haraguchi H et al (1995), "Inhibition of lipid peroxidation and superoxide generation by diterpenoids from Rosmarinus officinalis", Planta medica 61 (04), pp 333-336 [33] Haraguchi H et al (1996), "Antiperoxidative components in Thymus vulgaris", Planta medica 62 (03), pp 217-221 [34] Haraguchi H et al (1998), "Antioxidative and superoxide scavenging activities of retrochalcones in Glycyrrhiza inflata", Bioorganic & medicinal chemistry (3), pp 339347 [35] Harrison's Principles of Internal Medicine (2016), 19, Mc Graw-Hill Book Company [36] Heinicke R (1985), "The pharmacologically active ingredient of Noni", Bulletin of the national tropical Botanical garden 15 (1), pp 45-52 [37] Jayaraman S K et al (2008), "Antibacterial, antifungal and tumor cell suppression potential of Morinda citrifolia fruit extracts", International journal of integrative biology (1), pp 44-49 [38] Jensen C J et al (2006), Preventative and treatment effects of Morinda citrifolia on osteoarthritis and its related conditions, Google Patents [39] Koda T et al (2008), "Protective effect of rutin against spatial memory impairment induced by trimethyltin in rats", Nutrition Research 28 (9), pp 629-634 [40] Kong L et al (2000), "Inhibition of xanthine oxidase by some Chinese medicinal plants used to treat gout", Journal of ethnopharmacology 73 (1), pp 199-207 [41] Litwack G et al (1953), "A colorimetric assay for xanthine oxidase in rat liver homogenates", J biol Chem 200 (1), pp 303-310 [42] Lu H et al (1992), "Anti-oxidant activity of dibenzocyclooctene lignans isolated from Schisandraceae", Planta medica 58 (04), pp 311-313 [43] Mahattanadul S et al (2011), "Effects of Morinda citrifolia aqueous fruit extract and its biomarker scopoletin on reflux esophagitis and gastric ulcer in rats", Journal of ethnopharmacology 134 (2), pp 243-250 [44] Majkić-Singh N et al (1987), "Spectrophotometric assay of xanthine oxidase with 2, 2'azino-di (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)(ABTS) as chromogen", Clinica chimica acta 162 (1), pp 29-36 [45] Metz S et al (2009), "A combined QM/MM study on the reductive half-reaction of xanthine oxidase: substrate orientation and mechanism", Journal of the American Chemical Society 131 (41), pp 14885-14902 [46] Moslen M T (1994), "Reactive oxygen species in normal physiology, cell injury and phagocytosis", Adv Exp Med Biol 366, pp 17-27 [47] Muto J et al (2010), "Morinda citrifolia fruit reduces stress-induced impairment of cognitive function accompanied by vasculature improvement in mice", Physiology & behavior 101 (2), pp 211-217 [48] Nessa F et al (2014), "Evaluation of antioxidant and xanthine oxidase inhibitory activity of different solvent extracts of leaves of Citrullus colocynthis", Pharmacognosy research (3), pp 218 Tạ Quạng Vượng Trạng 40 Bản quyền tài liệu thuộc Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh Bạo cạo tong hợp kết quạ đế nghiến cưu khoạ hoc [49] Nguyen M T T et al (2004), "Xanthine oxidase inhibitory activity of Vietnamese medicinal plants", Biological and Pharmaceutical Bulletin 27 (9), pp 1414-1421 [50] Noro T et al (1983), "Inhibitors of xanthine oxidase from the flowers and buds of Daphne genkwa", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 31 (11), pp 3984-3987 [51] Özyürek M et al (2009), "Measurement of xanthine oxidase inhibition activity of phenolics and flavonoids with a modified cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC) method", Analytica chimica acta 636 (1), pp 42-50 [52] Palu A et al (2009), "Xanthine oxidase inhibiting effects of noni (Morinda citrifolia) fruit juice", Phytotherapy Research 23 (12), pp 1790 [53] Palu A K et al (2008), "The effects of Morinda citrifolia L.(noni) on the immune system: its molecular mechanisms of action", Journal of ethnopharmacology 115 (3), pp 502-506 [54] Pawlus A D et al (2005), "An Anthraquinone with Potent Quinone Reductase-Inducing Activity and Other Constituents of the Fruits of Morinda c itrifolia (Noni)", Journal of Natural Products 68 (12), pp 1720-1722 [55] Puranik D et al (2013), "Preclinical evaluation of antidiabetic activity of noni fruit juice", International journal of bioassays (02), pp 475-482 [56] Robak J et al (1988), "Flavonoids are scavengers of superoxide anions", Biochemical pharmacology 37 (5), pp 837-841 [57] Schreck R et al (1991), "Reactive oxygen intermediates as apparently widely used messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor and HIV-1", The EMBO Journal 10 (8), pp 2247-2258 [58] Sena Laura A et al (2012), "Physiological Roles of Mitochondrial Reactive Oxygen Species", Molecular Cell 48 (2), pp 158-167 [59] Sies H (1991), "Role of reactive oxygen species in biological processes", Journal of Molecular Medicine 69 (21), pp 965-968 [60] Su B.-N et al (2005), "Chemical Constituents of the Fruits of Morinda c itrifolia (Noni) and Their Antioxidant Activity", Journal of Natural Products 68 (4), pp 592-595 [61] SuGIuRA M et al (1981), "A new method for the assay of xanthine oxidase activity", Chemical and Pharmaceutical Bulletin 29 (2), pp 430-432 [62] Wang M et al (2000), "Novel glycosides from noni (Morinda citrifolia)", Journal of Natural Products 63 (8), pp 1182-1183 Tạ Quạng Vượng Trạng 41 ... chế hoạt tính enzym XO khả ức chế gốc tự superoxid sinh từ hoạt động enzym XO in vitro cao Nhàu  Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym XO khả ức chế gốc tự superoxid sinh từ hoạt động enzym XO in. .. Khảo sát khả ức chế hoạt tính enzym XO in vitro cao tồn phần cao phân đoạn Nhàu Chất thử (ml) Xanthin 100 µM (ml) Đệm phosphat 0,1M (pH =7, 5) (ml) Enzym XO 0,1 U/ml (0,0045 U) (? ?l) HCl 1M (ml)... khả chống oxy hóa in vitro cao Nhàu (Morinda citrifolia L. ) ứng dụng điều trị bệnh gout” thực với mong muốn khảo sát sơ in vitro khả ức chế hoạt tính enzym XO khả ức chế gốc tự superoxid sinh hoạt